Isolamento di astrociti puri e microglia dal midollo spinale di topo adulto per saggi in vitro e studi trascrittomici

Gli astrociti e le microglia sono cellule gliali versatili che svolgono ruoli vitali nel sistema nervoso centrale (SNC), comprendendo responsabilità come la regolazione della funzione neuronale, contribuendo allo sviluppo del SNC, mantenendo la barriera emato-encefalica e partecipando ad altri processi critici 1,2,3,4 . Oltre al loro ruolo nel mantenimento dell'omeostasi, queste cellule gliali svolgono anche un ruolo fondamentale nei meccanismi di lesione e riparazione. Le microglia sono ben note per le loro capacità fagocitarie, infiammatorie e migratorie in seguito a insulti o lesioni ^5,6,7. Le risposte degli astrociti nella malattia sono ugualmente diverse, comprendendo i contributi all'infiammazione, alla formazione di cicatrici gliali e alla compromissione della barriera emato-encefalica ^8,9. Sebbene la nostra comprensione dei ruoli dannosi e riparativi della microglia e degli astrociti nel sistema nervoso centrale sia cresciuta, l'eterogeneità intrinseca sia nella loro struttura che nella loro funzione richiede strumenti robusti per studiarli in vari contesti.

Ottenere ulteriori informazioni sul ruolo della microglia e degli astrociti nella salute e nella malattia richiede un approccio combinato di indagini in vivo e in vitro . Le tecniche in vivo sfruttano l'intricato crosstalk tra cellule gliali e neuroni all'interno del sistema nervoso centrale, mentre le metodologie in vitro si rivelano preziose quando si valutano le funzioni o le risposte di singole cellule sotto stimoli specifici. Ogni metodo offre vantaggi unici; Gli studi in vitro sono essenziali per comprendere i ruoli specifici di questi tipi di cellule senza input diretto o indiretto da parte delle cellule vicine. Inoltre, i saggi in vitro che utilizzano linee cellulari immortali presentano alcuni vantaggi, tra cui la capacità di proliferare indefinitamente, l'efficienza dei costi e la facilità di manutenzione. Tuttavia, è importante notare che le cellule primarie imitano più da vicino le normali risposte fisiologiche rispetto alle linee cellulari. Questa rilevanza fisiologica è cruciale nei saggi funzionali e nelle analisi trascrittomiche.

Una delle sfide nell'ottenere cellule primarie, in particolare dal midollo spinale del topo adulto, risiede nella quantità e nella vitalità dei campioni. Il midollo spinale adulto, essendo più piccolo del cervello e contenente una quantità significativa di mielina, pone difficoltà uniche. Sebbene esistano diversi protocolli pubblicati che descrivono in dettaglio l'isolamento di cellule gliali pure e vitali da animali neonatali o dal cervello di topo adulto 10,11,12,13, queste metodologie potrebbero non essere adatte per lo studio di malattie e lesioni specifiche del midollo spinale. In questo protocollo, offriamo una procedura completa per isolare in modo efficiente microglia e astrociti puri e vitali dal midollo spinale del topo adulto, facilitando le applicazioni a valle nelle colture cellulari e nelle analisi trascrittomiche. Questo protocollo è stato impiegato con successo per isolare queste cellule da topi adulti di età compresa tra 10 settimane e 5 mesi, dimostrando la sua utilità in vari contesti, tra cui studi che coinvolgono topi knockout condizionali, risposte ai farmaci, ricerca sullo sviluppo e modelli legati all'età.

Tutte le procedure sperimentali e di cura degli animali sono state condotte a seguito dell'approvazione del Comitato per la cura e l'uso degli animali presso la George Washington University School of Medicine and Health Sciences (Washington, D.C., USA; IACUC#2021-004). Lo studio ha utilizzato topi maschi e femmine C57BL/6J wild-type (WT) di età compresa tra 10 settimane e 5 mesi, provenienti da un fornitore commerciale (vedi Tabella dei materiali) e ospitati presso la George Washington University. Nella Figura 1 viene presentata una panoramica del flusso di lavoro del protocollo.

1. Preparazione del midollo spinale

1. Anestetizzare gli animali utilizzando Avertin (12,5 mg/mL di 2,2,2-tribromoetanolo e 2,5% di 2-metil-2-butanolo in acqua sterile) (vedi Tabella dei materiali). Confermare l'assenza di una risposta ai pizzicotti delle dita dei piedi e della coda nei topi.
2. Eseguire la perfusione cardiaca con 1x soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) per rimuovere le cellule mononucleate del sangue periferico.
   1. Posizionare l'animale su un vassoio poco profondo e praticare un'incisione laterale per esporre la cavità pleurica. Inserire un ago di perfusione da 23 G collegato a una pompa peristaltica (vedere Tabella dei materiali) nel ventricolo sinistro e attivare la pompa. Una volta che il DPBS freddo scorre attraverso il cuore, crea una piccola incisione nell'atrio destro.
      NOTA: In questa fase è preferibile una velocità di perfusione più rapida per migliorare la vitalità cellulare. Il sangue deve essere eliminato in meno di 1 minuto. La pulizia del fegato indica una perfusione riuscita.
3. Decapitare l'animale con delle grosse forbici e rimuovere la colonna vertebrale¹⁴. Immergerlo in 1x DPBS freddo con Ca²⁺/Mg²⁺/0,2% di glucosio in una capsula di Petri su ghiaccio per il risciacquo dei tessuti.
4. A partire da ora, assicurarsi che tutte le fasi siano eseguite in un ambiente sterile. Utilizzare l'estrusione idraulica¹⁴ per isolare l'intero midollo spinale. Utilizzare un ago da 18 G e una siringa da 10 mL riempita con 1x DPBS freddo con Ca²⁺/Mg²⁺/0,2% di glucosio. Trasferire il midollo spinale in una capsula di Petri posta su impacchi di ghiaccio contenenti una quantità sufficiente di DPBS freddo 1x con Ca²⁺/Mg²⁺/0,2% di glucosio per immergere l'intero tessuto.
5. Rimuovere con cautela le meningi al microscopio all'interno di una cappa a flusso laminare. Trasferire il midollo spinale in una capsula di Petri vuota su impacchi di ghiaccio e, utilizzando un bisturi chirurgico a lama n. 10, tagliare l'intero midollo spinale in sezioni di 2-3 mm.

2. Dissociazione enzimatica cellulare

1. Aggiungere la miscela enzimatica 1 e la miscela enzimatica 2 dal kit per la dissociazione cerebrale per adulti disponibile in commercio seguendo il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali). Agitare più volte gli enzimi nella capsula per garantire un rivestimento uniforme del midollo spinale, quindi incubare a 37 °C per 30 minuti. Ogni 5 minuti, agitare delicatamente il piatto per evitare la formazione di grumi di tessuto e facilitare la distribuzione uniforme dei reagenti.
2. Rimuovere la capsula dall'incubatore e aggiungere 350 μL di DNAsi I 0,46 mg/mL in terreno essenziale minimo (MEM) (vedere Tabella dei materiali). Mescolare agitando delicatamente.
3. Aggiungere 1 ml di DMEM/0,5% di siero fetale bovino (FBS) freddo e mescolare agitando delicatamente. Trasferire immediatamente l'intero contenuto in una provetta da 5 ml.

3. Dissociazione meccanica delle cellule

1. Utilizzando una pipetta P1000, triturare delicatamente il tessuto tre volte, assicurandosi che ogni volta vengano prelevati i pezzi di tessuto per dissociare ulteriormente il tessuto. Quindi, utilizzando una pipetta Pasteur in vetro da 9" tappata, triturare delicatamente altre cinque volte, assicurandosi che non si generino bolle durante il processo.
2. Posizionare la provetta da 5 ml in posizione verticale e lasciare che il tessuto si depositi sul fondo per 30 secondi. Una volta che il tessuto si è stabilizzato, prelevare il surnatante utilizzando una pipetta P1000 e farlo passare attraverso un filtro da 30 μm in una provetta conica da 15 mL.
3. Alla stessa provetta da 5 mL con il tessuto rimanente, aggiungere 1 mL di DMEM/0,5% FBS freddo. Utilizzando una pipetta Pasteur, triturare delicatamente tre volte.
4. Lasciare che il tessuto si depositi sul fondo per 30 secondi, quindi passare il surnatante attraverso un filtro da 30 μm e raccoglierlo nella stessa provetta da 15 mL di prima. Ripetere ancora una volta i passaggi 3.3 e 3.4.
5. Centrifugare la sospensione cellulare filtrata a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente (RT). Rimuovere con cautela e scartare il surnatante risultante utilizzando un aspiratore sottovuoto.

4. Rimozione della mielina

1. Rimuovere la mielina utilizzando la soluzione per la rimozione dei detriti (DRS) fornita nel kit di dissociazione cerebrale per adulti seguendo il protocollo del produttore. Dopo la rimozione dei detriti, aggiungere 5 mL di DMEM/0,5% FBS freddo al pellet cellulare e capovolgere delicatamente la provetta tre volte. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente (RT).
   NOTA: Se le cellule saranno utilizzate per studi in vitro e rimarranno in coltura, è necessario utilizzare DMEM/FBS allo 0,5% preriscaldato.
2. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di DPBS/0,5% FBS (a freddo per gli studi sull'RNA e a caldo per i saggi in vitro ). Conta le cellule e valuta la vitalità usando Trypan Blue.
   NOTA: Le sospensioni cellulari di più animali possono essere combinate per aumentare la concentrazione cellulare.
3. Lavare le cellule aggiungendo DPBS/0,5% FBS fino a un volume totale di 5 mL. Centrifugare la sospensione a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante utilizzando una pipetta.

5. Isolamento della microglia e degli astrociti

1. Etichettare le cellule con microsfere anti-CD11b o anti-ACSA-2 seguendo il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali).
2. Ordinare le celle in base alla selezione positiva utilizzando le colonne MS secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali). Dopo la cernita, centrifugare le cellule selezionate a 300 x g per 10 minuti e scartare il surnatante.

6. Cellule di placcatura per saggi in vitro

NOTA: Se le cellule non verranno placcate e verranno utilizzate immediatamente per l'analisi dell'RNA, procedere al passaggio 8.

1. Risospendere le cellule in 1 mL di DMEM/0,5% FBS caldo. Contare le cellule e valutarne la vitalità utilizzando un ematotometro (vedi Tabella dei materiali).
2. Regolare la concentrazione cellulare a 75.000 cellule per 50 μL. Aggiungere 50 μL di sospensione cellulare a ciascun vetrino coprioggetto rivestito di poli-L-lisina¹¹ in una piastra a 24 pozzetti.
3. Incubare a 37 °C per 2 ore per consentire alle cellule di aderire al vetrino coprioggetti.
4. Aggiungere con cautela 450 μL di DMEM/5% FBS/Penicillina-Streptomicina (Pen-Strep, vedere la Tabella dei Materiali) in ciascun pozzetto.
5. Dopo 3 giorni, sostituire metà del terreno con 250 μL di DMEM/5% FBS/Pen-Strep caldo. Per la manutenzione, sostituire completamente il terreno con 500 μL di DMEM/5% FBS/Pen-Strep caldo ogni 4-5 giorni.

7. Immunoistochimica

NOTA: È meglio eseguire le analisi immunoistochimiche dopo almeno 3 giorni quando il terreno è stato sostituito almeno una volta. Ciò garantisce che i detriti siano stati rimossi e che le celle abbiano aderito completamente al vetrino coprioggetto.

1. Rimuovere il terreno ed etichettare le cellule con anticorpi monoclonali O4 (1:100) (vedere la tabella dei materiali) in DMEM/5% FBS/10% siero di capra normale (NGS) caldo per 15 minuti a temperatura ambiente (RT) o a 37 °C.
   NOTA: Saltare questo passaggio e procedere al passaggio 7.3 se le celle non saranno etichettate con O4.
2. Sciacquare delicatamente i vetrini coprioggetti immergendoli tre volte in DMEM/5% FBS caldo. Aggiungere 594 IgM anti-topo di capra (1: 300) (vedere la tabella dei materiali) in DMEM/5% FBS/10% NGS caldo e incubare a RT per 15 minuti al buio. Risciacquare delicatamente tre volte in DMEM/5% FBS tiepido.
3. Fissare le celle con acido acetico/metanolo freddo al 5% per 15 minuti a 4 °C. Lavare tre volte con 1x PBS, quindi etichettare con l'anticorpo appropriato: GFAP anti-coniglio (1:500), GFAP anti-topo (1:500) o Iba1 anti-coniglio (1:500) in Triton-X100/10% NGS in 1x DPBS (vedi Tabella dei materiali). Incubare per 1 ora a RT.
   NOTA: Tenere i vetrini coprioggetti al buio se sono già stati macchiati con O4.
4. Risciacquare delicatamente tre volte con PBS. Etichetta con l'anticorpo secondario appropriato: anti-topo 594 IgG (1:500), anti-coniglio 488 IgG (1:500) (vedi Tabella dei materiali). Incubare per 30 minuti a RT al buio.
5. Risciacquare delicatamente tre volte con PBS. Colorante di contrasto con DAPI (1: 1000) per 1 minuto a RT. Risciacquare tre volte con PBS, aggiungere il mezzo di montaggio (vedere la tabella dei materiali) e montare i vetrini coprioggetti sui vetrini.

8. Estrazione dell'RNA

NOTA: Idealmente, dovrebbero esserci almeno 100.000 cellule per estrarre RNA sufficiente per l'analisi. Se necessario, le cellule di 2-3 midollo spinale possono essere combinate.

1. Estrarre l'RNA utilizzando un kit di isolamento dell'RNA disponibile in commercio seguendo il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali). Per ogni fase di lavaggio con il tampone di lavaggio RW1 fornito nel kit, lasciare le celle nel tampone di lavaggio per altri 2 minuti.
2. Rimuovere il DNA genomico rimanente utilizzando DNasi I secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali). Incubare con DNasi a RT per 15 minuti, quindi lavare con tampone RW1.
3. Per aumentare la resa di RNA, prima dell'eluizione, incubare i campioni in acqua priva di RNAsi a RT per 10 minuti. Valutare l'integrità e la quantità dell'RNA utilizzando un bioanalizzatore¹⁵ (vedi Tabella dei materiali).

I metodi delineati in questo protocollo consentono l'isolamento di microglia e astrociti puri e vitali dal midollo spinale del topo adulto, facilitando varie applicazioni a valle, tra cui saggi funzionali o istologici in vitro e analisi dell'RNA.

Un isolamento di successo per gli studi in vitro si tradurrà in una proliferazione cellulare continua per diversi giorni. Le cellule adulte mostrano un tasso di proliferazione più lento rispetto alle cellule isolate da animali neonatali e alcuni detriti possono essere presenti nei primi giorni. Entro 4 giorni in vitro (DIV), le cellule dovrebbero essere in gran parte libere da detriti, con la maggior parte delle cellule che aderiscono al fondo del pallone. Gli astrociti inizieranno a formare processi più lunghi, mentre la microglia assumerà una forma ovale con fusi più corti (Figura 2). Entro 7 DIV, gli astrociti dovrebbero formare uno strato confluente connesso e la microglia dovrebbe mostrare meno processi e più brevi (Figura 3).

La purezza può essere confermata mediante doppia marcatura di cellule selezionate per ACSA2 con GFAP e O4 per valutare la contaminazione da oligodendrociti in colture di astrociti e cellule con ordinamento CD11b con Iba1 e GFAP per valutare la contaminazione da astrociti in colture di microglia (Tabella 1).

Un protocollo di successo produrrà anche RNA di alta qualità con degradazione minima e quantità sufficiente (Figura 4A). Gli elettroferogrammi dell'RNA estratto da cellule isolate dovrebbero mostrare picchi prominenti di 18S e 28S. L'eccessiva dissociazione delle cellule o il tempo prolungato tra la perfusione e la selezione cellulare possono portare alla degradazione dell'RNA (Figura 4B). Un'insufficiente dissociazione enzimatica e/o meccanica o un'inadeguata rimozione della mielina possono comportare una riduzione della resa cellulare e dell'RNA (Figura 4C). Gli astrociti isolati possono essere sequenziati per identificare i marcatori infiammatori. Il confronto tra astrociti sani e astrociti attivati dall'infiammazione (ad esempio, da un animale sperimentale con encefalomielite autoimmune) rivelerà inibizioni relative delle vie infiammatorie negli astrociti sani rispetto a quelli infiammatori (Figura 4D).

Figura 1: Panoramica della preparazione del midollo spinale, della dissociazione tissutale e dello smistamento cellulare. La figura fornisce una panoramica del processo di preparazione del midollo spinale, compresa la dissociazione dei tessuti e lo smistamento cellulare. Dopo la dissezione del midollo spinale, i tessuti subiscono una dissociazione enzimatica e meccanica. La mielina viene rimossa e le cellule vengono marcate con anticorpi anti-ACSA2 o anti-CD11b per colpire astrociti e microglia. Le cellule selezionate possono quindi essere utilizzate per la coltura cellulare e l'analisi dell'RNA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini a contrasto di fase di astrociti e microglia a 4 giorni in vitro (4DIV). (A) Raffigura un esempio rappresentativo di cellule ordinate ACSA2+ con processi estesi. (B) Le cellule CD11b+ mostrano corpi cellulari di forma ovale e processi brevi. Barra graduata = 50 μm. Questa figura è adattata da Ahn, J. J. et al.16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immagini fluorescenti di astrociti e microglia a 8 giorni in vitro (8DIV). (A) Le cellule ACSA2+ marcate con GFAP (verde) e O4 (rosso) mostrano una colorazione minima di O4 e formano uno strato confluente connesso di astrociti. (B) Le cellule CD11b+ marcate con Iba1 (verde) e GFAP (rosso) mostrano una presenza minima di GFAP. Barra graduata = 50 μm. Questa figura è adattata da Ahn, J. J. et al.16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Elettroferogrammi rappresentativi di campioni di RNA. (A) Ci si aspetta un RNA ad alta resa e di alta qualità dopo un isolamento cellulare riuscito. (B) In caso di morte cellulare, dissociazione insufficiente o rimozione inadeguata dei detriti ci si può aspettare RNA a bassa resa e di bassa qualità o (C) RNA a bassa resa e di alta qualità. (D) L'analisi del sequenziamento dell'RNA di vie infiammatorie selezionate in astrociti sani rispetto agli astrociti infiammatori rivela l'inibizione relativa dell'infiammazione negli astrociti sani ordinati rispetto agli astrociti infiammatori. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Resa cellulare, purezza e vitalità dopo l'ordinamento per le cellule ACSA-2 e CD11b. Questa tabella è adattata da Ahn, J. J. et al.16.

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