Questo protocollo delinea l'isolamento di astrociti e microglia purificati dal midollo spinale del topo adulto, facilitando le successive applicazioni come l'analisi dell'RNA e la coltura cellulare. Include metodi e procedure dettagliati di dissociazione cellulare progettati per migliorare sia la qualità che la resa delle cellule isolate.
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Articolo metodologico
Isolamento di astrociti puri e microglia dal midollo spinale di topo adulto per saggi in vitro e studi trascrittomici
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli astrociti e le microglia svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo del sistema nervoso centrale, nelle risposte alle lesioni e nelle malattie neurodegenerative. Queste cellule altamente dinamiche mostrano risposte rapide ai cambiamenti ambientali e mostrano una significativa eterogeneità in termini di morfologia, profili trascrizionali e funzioni. Mentre la nostra comprensione delle funzioni delle cellule gliali nella salute e nella malattia è progredita notevolmente, rimane la necessità di analisi in vitro, specifiche per cellule, condotte nel contesto di insulti o lesioni per caratterizzare in modo completo popolazioni cellulari distinte. L'isolamento delle cellule dal topo adulto offre diversi vantaggi rispetto alle linee cellulari o agli animali neonatali, in quanto consente l'analisi delle cellule in condizioni patologiche e in punti temporali specifici. Inoltre, concentrandosi sull'isolamento specifico del midollo spinale, escludendo il coinvolgimento cerebrale, consente la ricerca sulle patologie del midollo spinale, tra cui l'encefalomielite autoimmune sperimentale, la lesione del midollo spinale e la sclerosi laterale amiotrofica. Questo protocollo presenta un metodo efficiente per isolare astrociti e microglia dal midollo spinale del topo adulto, facilitando l'analisi immediata o futura con potenziali applicazioni in studi funzionali, molecolari o proteomici a valle.
Introduzione
Gli astrociti e le microglia sono cellule gliali versatili che svolgono ruoli vitali nel sistema nervoso centrale (SNC), comprendendo responsabilità come la regolazione della funzione neuronale, contribuendo allo sviluppo del SNC, mantenendo la barriera emato-encefalica e partecipando ad altri processi critici 1,2,3,4 . Oltre al loro ruolo nel mantenimento dell'omeostasi, queste cellule gliali svolgono anche un ruolo fondamentale nei meccanismi di lesione e riparazione. Le microglia sono ben note per le loro capacità fagocitarie, infiammator....
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali e di cura degli animali sono state condotte a seguito dell'approvazione del Comitato per la cura e l'uso degli animali presso la George Washington University School of Medicine and Health Sciences (Washington, D.C., USA; IACUC#2021-004). Lo studio ha utilizzato topi maschi e femmine C57BL/6J wild-type (WT) di età compresa tra 10 settimane e 5 mesi, provenienti da un fornitore commerciale (vedi Tabella dei materiali) e ospitati presso la George Washington University. Nella Figura 1 viene presentata una panoramica del flusso di lavoro del protocollo.
1. Prepa....
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Risultati
I metodi delineati in questo protocollo consentono l'isolamento di microglia e astrociti puri e vitali dal midollo spinale del topo adulto, facilitando varie applicazioni a valle, tra cui saggi funzionali o istologici in vitro e analisi dell'RNA.
Un isolamento di successo per gli studi in vitro si tradurrà in una proliferazione cellulare continua per diversi giorni. Le cellule adulte mostrano un tasso di proliferazione più lento rispetto alle cellule isolate da animali neonat.......
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Discussione
L'isolamento di cellule primarie pure e vitali è fondamentale per studiare la struttura e la funzione di specifici tipi di cellule. Nel topo adulto, in particolare nel midollo spinale, questo compito pone sfide significative, poiché i protocolli esistenti spesso non sono adattati al midollo spinale adulto10,17. Questo protocollo presenta un metodo efficiente ed economico applicabile a varie applicazioni a valle, tra cui colture cellulari, citometria a flusso, ist.......
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Ringraziamenti
Ringraziamo Castle Raley del George Washington University Genomics Core per le analisi dell'RNA e Q2 Lab Solutions per le analisi di sequenziamento dell'RNA. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke [sovvenzione numero F31NS117085] e dal Vivian Gill Research Endowment al Dr. Robert H. Miller. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2,2,2-Tribromoetanolo | Sigma Aldrich | T48402 | |
| Piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Metil-2-butanolo, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Fenilidolo, Dicloridrato | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| Soluzione di glucosio al 45% | Corning | 25-037-CI | |
| Provette con tappo da 5 mL | Eppendorf | 30122305 | |
| Acido acetico | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Kit di dissociazione cerebrale adulta | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Kit di microsfere Anti-ACSA2 | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Bioanalizzatore Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Agilent Tecnologie | G2939BA | ||
| topi C57BL/6J wild-type (WT) | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µ m filtro | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Camera di conteggio (ematocitometro) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deossiribonucleasi I da pancreas bovino | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Acqua distillata | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNasi per la purificazione dell'RNA | Qiagen | 79254 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Siero fetale bovino | Thermo Fisher | A5209401 | |
| Anticorpo GFAP (topo) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| Anticorpo GFAP (coniglio) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Anti-topo di capra 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Capra anti-topo 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Capra anti-coniglio 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 anticorpo (coniglio) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separatore | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Metanolo | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mezzo di montaggio | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| Colonne MS | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Anticorpo | R & D | MAB1326 | |
| Penicillina-Streptomicina | Gibco | 15070063 | |
| Pipetta pasteur in vetro da 9" VWR | 14672-412 | ||
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Lama per bisturi chirurgico n. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Set per infusione di piccole vene, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
Riferimenti
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).
- Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia
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Ristampe e permessi
