Articolo metodologico

Ottimizzazione del modello murino per parodontite indotta da legatura per la ricerca preclinica

DOI:

10.3791/65908

⸱

30 aprile 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Comprehensive Care, Department of Periodontology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Division of Pediatric and Public Health, Adams School of Dentistry, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Epidemiology, Gillings School of Global Public Health, University of North Carolina at Chapel Hill, 4Department of Applied Physical Sciences, University of North Carolina at Chapel Hill, 5Department of Biostatistics and Health Data Science, School of Medicine, Indiana University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il modello murino della parodontite indotta da legatura è uno strumento efficace e sempre più popolare per lo studio della malattia parodontale. Vengono presentate linee guida dettagliate per implementare una versione semplificata del modello focalizzata sulla distruzione dell'osso alveolare interprossimale, inclusa la progettazione di studi di laboratorio, la produzione di strumenti stampati in 3D e la quantificazione ossea tramite analisi μCT.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il modello sperimentale della parodontite indotta da legatura nei topi ha svolto un ruolo fondamentale nella comprensione della patogenesi della malattia parodontale; Tuttavia, non è stata pienamente sfruttata per applicazioni traslazionali e terapeutiche. Similmente alle malattie umane, la parodontite indotta da legatura nei topi si sviluppa attraverso una serie di eventi microbici, infiammatori e osteo-immunologici distinti. La distruzione dell'osso alveolare indotta dalla legatura progrede in un periodo ragionevolmente breve ed è facilmente quantificabile, rendendolo un modello di malattia economico per studi preclinici.

Per superare la sfida tecnica del modello classico di legatura, è stata organizzata la creazione del modello murino semplificato per parodontite indotta da legatura. Invece di indurre la malattia in tutta la circonferenza di due denti adiacenti, il modello semplificato della malattia si concentra sulla distruzione ossea infiammatoria solo nella regione interprossimale di due denti posteriori, che è anche la regione che la malattia parodontale comune inizia negli esseri umani. Poiché utilizza strumenti stampati tridimensionali (3D) per il posizionamento delle legature, l'approccio è rapido ed efficace, portando a un tempo procedurale di 5-10 minuti per mouse. Sebbene la segnalazione osteoclastogenica venga rilevata dopo 3 giorni di posa della legatura, la distruzione ossea si sviluppa costantemente a 9 giorni dalla legatura.

Qui, il protocollo semplificato del modello di legatura viene elaborato evidenziando elementi importanti specifici per la progettazione dello studio (cioè calcolo della potenza, standardizzazione delle procedure, calibrazione), sviluppo degli strumenti stampati in 3D (cioè il "letto dentale del topo" e il "portalegature") e la quantificazione dell'osso alveolare tramite analisi μCT. L'espressione genica gengivale di Rank, Rankl e Opg, una triade regolatore principale dell'osteoclastogenesi, è utilizzata come prova indiretta dell'efficacia terapeutica. I metodi presentati in questo articolo guideranno l'implementazione da parte dei ricercatori del modello semplificato di parodontite indotta da legatura per testare terapie parodontali innovative in ambito preclinico.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La malattia parodontale è un complesso processo infiammatorio che porta alla distruzione delle strutture che sostengono i denti, inclusi la gengiva, il legamento parodontale, il cemento e l'osso alveolare. Perché si sviluppi la perdita ossea parodontale, è necessario verificarsi la rottura della barriera gengivale e l'invasione batterica, oltre al reclutamento delle cellule infiammatorie e alla transizione da una risposta immunitaria dominata innata a una dominata daacquisita. Lo squilibrio finale tra osteoblasti e osteoclasti causerà una perdita ossea alveolare tramite la sua distruzione2. Il risultato fenotipico distintivo che differenzia la diagnosi di malattia parodontale dall'infiammazione gengivale reversibile (gengivite) è la perdita dell'osso alveolare. Pertanto, la quantità di osso alveolare che sostiene il dente è un esito terapeutico chiave nel contesto preclinico.

Nessun singolo modello animale può replicare tutti gli aspetti biologici necessari per lo sviluppo di diverseterapie 3,4,5. Il modello murino della parodontite indotta da legatura sviluppa una distruzione ossea quantificabile in un tempo ragionevolmente breve (3-9 giorni)5, rendendolo un modello conveniente per testare nuovi interventi terapeutici per la prevenzione e modulazione della parodontite. Nonostante il successo nel supportare lo sviluppo di studi clinici umani di faseII-III 6,7,8,9,10, la parodontite indotta da legatura nei topi non è comunemente utilizzata come modello preclinico. Per superare le sfide tecniche del modello classico in cui la legatura circonda il dente, è stato istituito il modello semplificato per parodontite indotta dalla legatura11,12. La semplice modifica del modello classico si concentra su un sito focalizzato sulla distruzione ossea, tra i denti piuttosto che intorno. I vantaggi di questa modifica sono molteplici, tra cui un tempo più breve richiesto per 1) la formazione del personale, 2) la facilità tecnica della procedura sperimentale e 3) la riproducibilità della quantificazione ossea. Inoltre, è stato scoperto che diversi eventi microbiologici e immunologici che si sviluppano e si manifestano sotto questo modello semplificato sono allineati con la comprensione attuale della comune malattia parodontaleumana 2,11,12,13. Infine, l'efficace prevenzione della perdita ossea indotta dai farmaci precedentemente riportata danoi 2,14 supporta ulteriormente l'uso del modello semplificato della parodontite indotta da legatura come strumento in vivo per valutare aspetti chiave delle nuove terapie parodontali.

Un aspetto innovativo del modello semplificato della parodontite indotta da legatura è stato lo sviluppo di strumenti stampati in 3D per facilitare più facilmente il processo di induzione dellamalattia 11,12. Sebbene intuitivo per alcuni, i ricercatori hanno riportato un'incapacità di assemblare gli strumenti stampatiin 3D 15, il che potrebbe ulteriormente ostacolare o ritardare l'inizio dello studio sugli animali. Il presente studio amplia le informazioni presentate nel nostro precedente studio diprotocollo 11e fornisce dettagli per consentire l'implementazione con successo del modello semplificato di parodontite indotta da legatura in un contesto di laboratorio. I dettagli inclusi in questo protocollo attuale fanno parte di una complessa serie di fattori che possono contribuire alla mancanza di riproducibilità dei risultatiscientifici 15,16,17. L'uso costante del modello e la riassorbimento ossea affidabile identificati nei molteplici studi 2,11,12,14,18 e da gruppi di ricerca collaborativa 13,19,20,21 negli ultimi 10 anni sostengono l'importanza di diffondere informazioni dettagliate per promuovere la riproducibilità nella comunità scientifica.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo rispettava le linee guida Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE) 22,23. Tutte le procedure sperimentali descritte in questo protocollo sono state approvate dall'IACUC dell'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill.

1. Disegno sperimentale

  1. Calcolo della dimensione del campione
    NOTA: A causa della natura traslazionale del programma di ricerca, il calcolo della potenza presentato qui si basa su misurazioni dell'osso alveolare di topi selvatici C57Bl6 di 8-12 settimane.
    1. Analizzare l'osso basandosi sulle misurazioni lineari tra la giunzione cemento-smalto e la cresta alveolare dell'osso (CEJ-ABC).
      1. I topi sani hanno un livello medio di attacco (o misura CEJ-ABC) di 0,2 mm, mentre i topi con parodontite al momento di 9 giorni dopo la legatura hanno il doppio di questa quantità (distanza CEJ-ABC di 0,4 mm)11. La perdita ossea alveolare non aumenta significativamente da 9 a 18 giorni dopo la posa dellalegatura 11.
      2. Esegui un'analisi di calcolo di potenza basata su questa dimensione d'effetto per identificare il numero di topi necessari a rivelare queste differenze tra salute e malattia (qui, un totale di 8-10 topi [Figura 1A]).
        NOTA: La potenza è stata calcolata per raggiungere una potenza compresa tra 0,8 e 0,95, α = 0,05, utilizzando una potenza media a due campioni. Medie di gruppo e deviazioni standard sono presentate nella Figura 1B.
    2. Per determinare un effetto terapeutico sulla perdita ossea, si effettua un calcolo di potenza diverso. Invece di confrontare topi sani con topi malati, poiché sia i gruppi sperimentali che quelli di controllo sviluppano parodontite in questo protocollo, si possono mettere da parte tra 19 e 31 topi per gruppo per garantire la riproducibilità dei risultati quando si testa la modulazione della perdita ossea utilizzando il modello murino semplificato per periodontite indotta da legatura (vedi risultati rappresentativi e Figura 1C).
      NOTA: La potenza è stata calcolata utilizzando lo stesso test descritto sopra. Le medie di gruppo e le deviazioni standard sono presentate nella Figura 1D.
  2. Standardizzazione delle procedure e calibrazione del personale
    1. Addestrare e calibrare tutto il personale coinvolto nell'induzione e quantificazione della malattia prima dell'inizio dello studio (intercalibrazione e intracalibrazione; r2 ≥ 0,90).
      NOTA: Si stima che l'addestramento per il posizionamento delle legature e la quantificazione della perdita ossea richieda un periodo di 2-3 mesi (tempistica presentata nella Tabella 1). Altri passaggi necessari sono presentati come una timeline nella Tabella 1.
    2. Per la procedura di posizionamento della legatura, si lavorano insieme due investigatori qualificati nella sala intervento. Il ricercatore principale (intra- e inter-calibrato) rimane l'operatore che posiziona le legature.
    3. Fai lavorare il secondo investigatore come assistente procedurale ed esegui i passaggi elencati di seguito:
      1. Registra il peso del topo.
      2. Metti il topo nella scatola dell'anestetico.
      3. Applicare la pomata oculare sul topo prima di consegnarlo all'operatore affinché lo colloci nel "letto dentale del topo".
      4. Assicurati che ≥3 "portalegature" siano adeguatamente caricati con le legature e pronti all'uso.
        NOTA: Per migliorare l'efficienza, è ideale avere ≥3 "portalegature" caricati correttamente per l'uso da parte dell'operatore. Si raccomanda la rapidità (cioè un tempo di procedura di 5-10 minuti per mouse), aumentando il numero di esperimenti condotti in un giorno e riducendo i potenziali effetti di batch.
      5. Esegui il monitoraggio del topo (prima e dopo la procedura).
        NOTA: La parodontite indotta da legatura è una procedura non invasiva e non chirurgica, simile all'uso del filo interdentale di un dente umano. Si prevede che il posizionamento delle legature causi un disagio molto lieve ai topi (principalmente a causa dell'accumulo di batteri tra due denti), ma non dovrebbe richiedere l'uso di analgesici. Non si prevedono complicazioni dopo il posizionamento della legatura eseguito da un individuo addestrato. Tutti gli animali vengono monitorati ogni 2-3 giorni dopo la posa della legatura. I parametri umani (ad esempio mancata toelettatura o alimentazione, incapacità di alzarsi o camminare, respirazione faticosa, ferite necrotiche o infette) dovrebbero essere elencati nel protocollo animale approvato, ma se dovessero verificarsi complicazioni, il personale veterinario dovrebbe essere consultato sulle azioni appropriate.

2. Creazione di strumenti stampati per indurre la parodontite da legatura nei topi

NOTA: Per ottimizzare la posizione delle legature, sono stati sviluppati strumenti stampati in 3D chiamati Mouse Dental Bed e Ligature Holder , composti da diversi pezzi stampati in 3D individuali che vengono stampati separatamente e poi assemblati manualmente. Le specifiche dei blueprint per questi dispositivi sono state precedentemente pubblicate11 e possono essere utilizzate da investigatori esperti per creare singoli file STL. I nuovi dispositivi presenti nello studio sono stati creati in collaborazione con il BeAM Design Center dell'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill. I materiali possono essere ottenuti tramite la relativa struttura principale o stampati in 3D utilizzando i file STL nel File Supplementare 1.

  1. Letto dentale per topi
    1. Stampare il letto dentale del topo (Figura 2A) e il portalegatura (Figura 2B) utilizzando la qualità di stampa standard su una stampante 3D con filamento ad acido polilattico (PLA) da 3,0 mm. Stampare il letto dentale nell'orientamento previsto e le altre parti con le superfici uniformi e piatte orientate verso il basso rispetto al piano di stampa. Attiva l'opzione del materiale di supporto attivando l'impostazione Posizionamento del Supporto. Assicurati che il materiale di supporto tocchi prima la piastra di costruzione selezionando l'opzione Toccare la piastra di costruzione.
      NOTA: Usa i cinque file STL nel File Supplementare 1 per stampare tutti gli elementi richiesti, inclusi il tubo staccato, la legatura (con taccetta), il letto dentale del topo (con tacche), il coperchio e il blocco del portalegature. Consulta la Tabella dei Materiali per le dimensioni di ciascun oggetto (specifiche del progetto precedentementepresentate 10).
    2. Dopo la stampa, rifila eventuali parti di supporto stampate dai modelli usando tronchesi, pinze a becco sottile o altri strumenti.
      NOTA: Indossa occhiali protettivi durante questa procedura.
  2. Assemblaggio del letto dentale del topo
    1. Per preparare il letto dentale del topo, disporre tutte le parti come mostrato (Figura 3A) e preparare la colla da utilizzare (Figura 3B).
    2. Metti qualche goccia di colla (Figura 3C) e fissa le viti come mostrato (Figura 3D). Ancora una volta, preparati a trasferire la colla (Figura 3E) nelle aree in cui verrà applicata. Fai scorrere la fessura del tubo stampato (Figura 3F) in posizione con l'estremità spinata rivolta lontano dal Mouse Dental Bed (qui si attacca il tubo per somministrare l'isoflurano).
    3. Fissare i pezzi stabilizzanti della testa in posizioni con colla (Figura 3F).
    4. Rimuovere eventuali colle in eccesso e mantenere una leggera pressione su tutti i pezzi inseriti per un attacco saldo (Figura 3F).
  3. Regolazioni dei portalegatura
    1. Per ridurre il disagio durante il blocco/sblocco del meccanismo, assicurati che tutti i bordi quadrati/affilati sulla parte esterna del Portalegatura (Figura 4A) siano leggermente smussati a un angolo di 45° usando un manico di bisturi 15C, n. 3 con lama 15C.
    2. Per garantire una calzata aderente del meccanismo di chiusura al Portalegature, si quadrano eventuali angoli interni arrotondati sul Serratore del Portalegatura (Figura 4B-F) usando una lama da bisturi 15C.
      NOTA: Questo permetterà al lucchetto di appoggiarsi completamente contro il Portalegatura e richiederà solo piccole regolazioni.
      1. Usa uno strumento per rifilare la stampa 3D o una lama da bisturi 15C per rimuovere il "flash" rimasto sui bordi superiore e inferiore anche dopo aver rimosso la maggior parte del supporto, e smussa leggermente i bordi a 45° (simile alla bisella eseguita sul Ligature Holder Lock nel primo passo) per garantire un blocco ben regolato.
        NOTA: Non rimuovere troppo materiale, ma solo quanto basta perché il lucchetto possa scorrere senza alcuna resistenza.
    3. Se troppo sottile, si taglia la lunghezza di ogni punta fino a raggiungere una sezione trasversale più spessa [almeno 0,5 mm], assicurandosi che rimanga abbastanza spazio tra le punte per evitare che si impaccino il palato durante la posizione delle legature. Assicurati che le punte siano lunghe almeno 3 mm dopo il taglio (Figura 5A, mostrata da "CUT").
    4. Sulle punte del portalegature, rimuovere qualsiasi flash dal "supporto" su cui è stato stampato lo strumento per assicurarsi che il lato delle punte sia piatto (Figura 5B, freccia).
    5. Rimuovi una "fetta" del lato di ogni punta con un angolo di 45° per facilitare il carico della legatura e ammorbidire i bordi per prevenire lesioni traumatiche ai tessuti molli (Figura 5C, indicata da frecce).
    6. Assicurati che ogni punta sul Portalegatura abbia una tacca a forma di "V" in cui possano poggiare le legature di seta per sutura. Se questo è stato rimosso nel passo 2.3.6 perché la punta iniziale stampata era troppo sottile, affinalo sulla stampa o riproducilo.
      1. Se questa tacca a forma di "V" è visibile, posa il Portalegatura su una superficie piatta con entrambe le punte parallele al tavolo, posiziona delicatamente una lama da bisturi 15C alla base della tacca e dondola delicatamente da un lato all'altro in modo che il bordo della lama rimanga alla base della "V" e il lato della lama tocchi le pareti superiori della "V". Con la lama alla base della tacca, inclina con molta attenzione la lama verso la superficie esterna della punta e ripeti questo movimento per affinare la base della tacca a "V" sul bordo esterno, il che permetterà al filo della sutura di guidarsi più facilmente in posizione.
        NOTA: Questa azione oscillante crea il giusto movimento nel filamento per spostarlo e affinare la tacca senza rimuovere troppo materiale.
      2. Se questa tacca a forma di "V" non è visibile, posare il Portalegatura su una superficie piatta con entrambe le punte perpendicolari al tavolo. Guardando dritto verso il basso lungo entrambe le punte del Portalegature, posiziona una lama da bisturi 15C al centro delle punte e, con un unico movimento deliberato, fai un taglio superficiale per creare l'inizio di quella che diventerà la tacca a forma di "V".
        NOTA: Spesso è più semplice eseguire questa azione su ogni punta separatamente piuttosto che cercare di posizionare la lama nel punto corretto su entrambe le punte contemporaneamente.
      3. Ripeti il passo 2.3.7.2 se necessario, assicurandoti che il bordo della lama del bisturi rientri sempre nello stesso punto al centro della punta.
        NOTA: Se il bordo della lama non si ritrova nello stesso punto, verranno effettuati diversi tagli, che faranno sì che gli strati di filamento inizino a separarsi in quelle zone e potrebbero ridurre le prestazioni dello strumento.
        NOTA: La profondità della tacca a forma di "V" deve essere testata periodicamente usando una legatura di seta legata con sutura per determinare se la legatura regge o se continua a scivolare via (potrebbe indicare che è necessario ulteriori affinamenti). Il supporto deve essere stampato con la tacca rivolta verso il basso sulla piastra di costruzione e il blocco del portalegatura orientato, con l'apertura più larga verso il basso che tocca la piastra di costruzione. Anche in questo caso, il materiale di supporto può essere usato con il posizionamento del supporto impostato solo su Touching Buildplate.
  4. Supporto per legatura assemblato
    NOTA: Dopo aver effettuato le modifiche, assemblare il Portalegatura e controllare quanto segue:
    1. Quando una legatura è bloccata, assicurati che il lucchetto pizzicchi il filo al Portalegatura (non mostrato nella Figura 6A come indicato dalla freccia, ma nella Figura 6B) sia in cima che in fondo alla serratura (entrambi se possibile, ma può essere difficile da ottenere).
      NOTA: Questo attrito garantirà che la legatura non scivoli fuori posizione.
    2. Quando si infila la legatura nelle scanalature del Portalegature, se continua a scivolare dalle punte, si approfondisce le scanalature o si estendono ulteriormente verso l'esterno della punta per creare una "pista" in cui il filettamento si posizione.
    3. Controlla se i due nodi sono centrati (Figura 6C) e livellati (linea retta nella Figura 6D) quando si osserva dalla parte anteriore del Portalegature; Se no, allora una scanalatura è più profonda dell'altra.
    4. Controlla che la legatura sia posizionata appena all'interno delle tacche e che non sia troppo profonda; altrimenti, c'è un rischio elevato che la punta del portalegatura entri in contatto con i tessuti molli e causi traumi durante la posa della legatura.
    5. Utilizzando un esploratore dentale (Figura 6E), conferma che la legatura rimbalzi in posizione senza scivolare quando viene applicata una lieve forza tra i nodi (questo simula la forza che subirà durante la posa della legatura).

3. Posizionamento delle legature

NOTA: È possibile che le legature possano essere posizionate tra i denti murini con o senza l'aggiunta di patogeni parodontaliumani 11. Un'analisi dipendente dal tempo della composizione microbica della legatura (senza integrazione con specie batteriche umane) ha dimostrato uno spostamento nella comunità microbiomica (disbiosi) durante lo sviluppo dellaparodontite 12. Per questo motivo, la sostituzione della legatura non è raccomandata poiché potrebbe alterare la riproducibilità dei risultati. L'inclusione delle specie batteriche in combinazione con la legatura dipende dalla questione affrontata in uno studio specifico. A causa della prevista perdita dilegatura del 10-15%, le legature vengono inserite bilateralmente in un singolo topo. Questo approccio minimizza la perdita di topi durante l'esperimento.

  1. Dopo che il topo è stato anestetizzato usando isoflurano inalato, si posiziona il topo anestetizzato nel letto dentale del topo con la schiena appoggiata al letto e il naso posizionato in prossimità del cono nasale.
    NOTA: I topi dovrebbero essere anestetizzati usando isoflurano al 4% (vol/vol). Il vaporizzatore di isoflurano e l'ossigeno sono filtrati da un filtro dell'aria da 0,2 μm. Una volta che il topo è completamente anestetizzato e posto nel letto dentale del topo, dovrebbe essere mantenuto con un flusso dell'1,5-2,5% attraverso il cono nasale. I topi sono monitorati tramite movimenti involontari del corpo e la frequenza respiratoria (~55-65 respiri al minuto). Non è necessario somministrare alcun analgesico ai topi indotti da parodontite da legatura, poiché si tratta di una procedura non invasiva e non chirurgica, simile al filo interdentale di un dente umano. La posa delle legature dovrebbe causare un disagio molto lieve ai topi (principalmente a causa dell'accumulo di batteri tra due denti), ma non dovrebbe richiedere l'uso di analgesici. Non si prevedono complicazioni dopo il posizionamento della legatura eseguito da un individuo addestrato.
  2. Usa gli elastici per stabilizzare la testa del topo e aprirgli la bocca.
    NOTA: La fascia intorno agli incisivi mandibolari ritrae anche la lingua, e la tensione è passiva per aprire la mandibola senza tirarla. La visualizzazione dei molari è facilitata quando la sorgente luminosa è orientata ad un angolo per evitare che le ombre oscurino il campo visivo. Il letto dentale per topi è stato progettato specificamente per il modello murino semplificato per parodontite indotta da legatura. La distanza tra il naso del topo e il cono è necessaria per permettere al topo di avere piccoli movimenti corporei durante la procedura sperimentale. Questo movimento del mouse consente un monitoraggio adeguato della manovra della mano dell'operatore mentre utilizza il portalegatura e controlla la quantità di forza utilizzata durante la posa della legatura. Il posizionamento delle legature dovrebbe richiedere 5-10 minuti per ogni mouse. Le procedure devono essere eseguite in una cappa ben ventilata per eseguire esperimenti sugli animali
  3. Per posizionare una legatura sul lato destro, tenere il Portalegatura nella mano destra e l'esploratore nella sinistra.
    NOTA: Se i nodi sulla legatura non sono centrati tra le punte ma piuttosto più vicini a una punta, allora la legatura potrebbe essere più adatta per essere posizionata su un lato specifico. Ad esempio, se i nodi sono posizionati più vicino alla punta destra del Supporto Legatura, questa legatura potrebbe essere più facile da posizionare sul lato destro.
  4. Posiziona delicatamente la punta dell'esploratore sotto il contatto interprossimale del primo e del secondo molare sul lato palatale.
    1. Fai sì che la punta dell'esploratore tocchi prima i denti e poi scivoli giù e appoggiata contro la gengiva per evitare di traumatizzare i tessuti molli; Riposa il manico esploratore in un'angolazione orizzontale una volta posizionato correttamente.
    2. Annota quale estremità dell'esploratore viene usata per posizionarsi sul lato destro e quale da quella sinistra. Assicurarsi che la punta dell'esploratore si agganci all'area di contatto prossimale in direzione verso l'alto, permettendo al contempo che la piega del gambo si posi sul lato controlaterale per stabilizzare la testa contro forze reattive durante il posizionamento.
  5. Utilizzando il Portalegatura in un'angolazione orizzontale, ritrae la guancia posizionando prima il Portalegatura sopra il contatto interprossimale tra il secondo e il terzo molare, spingendo il bordo del Portalegatura contro la guancia per spostarlo, e poi portando il Portalegatura in posizione al contatto interprossimale del primo e del secondo molare.
    NOTA: Questo passaggio aiuta a garantire che nessuna mucosa buccale rimanga intrappolata tra la legatura e i denti, interferendo con la posizione.
  6. Una volta posizionata la legatura sul contatto interprossimale tra il primo e il secondo molare, ruota il manico del portalegatura fino a 45° e, con una combinazione di lieve oscillazione e scivolamento, spingi la legatura attraverso il contatto.
  7. Tagliare il filo in eccesso:
    1. Usa una pinza a ago fine per agganciare il filo in eccesso attaccato al nodo sul lato destro, tira il filo attraverso i denti verso sinistra e, usando forbici appena aperte, fai scivolare le forbici lungo il filo finché non le posizioni a ~1,5 mm dal nodo prima di tagliare.
      NOTA: Questo aiuta a ridurre la probabilità di traumi mucosi involontari durante la riduzione dell'eccesso.
    2. Ripeti quanto sopra con le indicazioni invertite per l'altro nodo.
  8. Ripeti i passaggi sopra della 3.3. fino a 3.7.2. quando si posiziona una legatura sul lato opposto della bocca.
    NOTA: Si raccomanda la raccolta delle legature a ritiro, poiché lo spostamento disbiotico può essere alterato da diversi testsperimentali 12. Per facilitare la raccolta, i topi vengono posti nel letto dentale murino e uno dei nodi della legatura viene tagliato, seguito da una delicata rimozione interprossimale con la pinza. L'uso del letto dentale del topo durante la raccolta delle legature consente una stabilità adeguata del topo e un facile accesso al sito della legatura.

4. Quantificazione della distruzione ossea

  1. Analisi μCT
    1. Apri il software e clicca su File | Importa immagine...
    2. Clicca su Sfoglia nel menu pop-up, vai nella cartella contenente i file Dicom per una scansione e seleziona il primo file.
    3. Clicca su Esamina per trovare e selezionare altri file nella cartella che fanno parte dello stesso campione scansionato. Clicca OK.
    4. Dopo che l'immagine inizia a caricarsi, clicca su Visualizza e Isosurface.
    5. Cambia la soglia dell'immagine a 5.000 e il fattore di qualità superficiale (%) a 55.
    6. Seleziona le caselle Abilita Liscio Immagine e Taglia Superficie con il ROI Attuale e clicca su Aggiorna.
    7. Regola le proprietà dei livelli cliccando con il tasto destro su Finestra/Livello in basso (Figura 7A) e su Modifica Proprietà Finestra/Livello. Seleziona un valore di densità ossea che sia standard per tutti i campioni. Per seguire questo protocollo, usa 2.000 ma cambia la densità ossea dei campioni e mantienilo costante per tutte le misurazioni.
    8. Per manipolare i piani:
      1. Usa scorciatoie da tastiera I/J/K nascondi/mostra per i tre piani diversi.
      2. Clicca con il tasto destro e sposta il cursore per zoomare avanti e indietro.
      3. Premi Shift e poi clicca con il tasto sinistro per panare.
      4. Clicca su Slice per spostare e ruotare i piani.
      5. Clicca sul centro del piano per spostarlo avanti o indietro oppure posiziona il cursore al centro del piano desiderato e usa i tasti freccia su e giù per muovere il piano una fetta alla volta.
      6. Clicca sul bordo del piano per ruotare attorno a una linea parallela a questo bordo al centro del piano.
      7. Clicca sull'angolo di un piano per ruotare attorno al piano.
    9. Orientare l'asse z (pannello blu in cima allo schermo - la fetta z) in modo che le superfici/forme di tutti e tre i denti diventino visibili contemporaneamente (o il più vicino possibile) (Figura 7B).
    10. Scorri attraverso questo stesso piano (pannello blu in cima allo schermo-z-slice) in modo che le radici delprimo e del secondo molare siano visibili (Figura 7C). Cerca di scegliere un punto abbastanza in profondità dalle radici in modo che tutta l'anatomia circostante sia visibile, ma anche dove i canali appaiono ben definiti e in linea retta.
      NOTA: Il piano potrebbe dover essere ruotato per orientare verticalmente i canali.
    11. Orientare l'asse x (linea verde verticale nel pannello della fetta Z) per allinearsi con le radici buccali delprimo e del secondo molare (cerca di allineare attraverso la parte centrale di ciascuna radice/canale se possibile; altrimenti, allinea attraverso la radice bucale delprimo molare e la radice distobucale delsecondo molare ) (Figura 7D).
    12. Usa l'orientamento della fetta x come riferimento per l'allineamento della fetta a y (linea blu verticale nel pannello della fetta x).
      1. Allinea la fetta Y in modo che sia verticalmente parallela attraverso la radice del primo molare nel pannello della fetta X (Figura 7E). Ruota il piano per orientare verticalmente la radice. Osserva che la linea blu attraversa il centro della radice.
        NOTA: Nelle aree di perdita ossea (come ci si aspetta con questo modello), la cresta alveolare può presentare un difetto; Pertanto, la linea mediana della radice deve essere stimata perché l'osso circostante potrebbe non essere presente per definire idealmente il centro dell'alveolo.
    13. Nel pannello a Y-slice, misura la distanza dalla giunzione smaltato cemento-smalto (CEJ) alla cresta alveolare (ABC) posizionando il cursore nel punto più profondo della scanalatura al CEJ e premendo 1, poi posizionando il cursore nel punto più vicino dell'ABC e premendo 2 come mostrato (Figura 7F). Ilprimo punto è indicato da una freccia blu e il secondo punto da una freccia verde.
      1. Se le frecce non appaiono finché entrambi i punti non sono selezionati, selezionale passando il mouse sopra le aree desiderate e premi i tasti numerici sulla tastiera, poiché basta cliccare il mouse senza funzionare.
      2. Se il CEJ è difficile da determinare, usa i tasti freccia su e giù per scorrere tra le fette adiacenti e confermarne la posizione.
      3. Misurare più punti dell'ABC se il "punto più vicino" è difficile da determinare per confermare che ci sia poca o nessuna variazione nella misurazione.
        NOTA: Per confermare che sia stata effettuata la misura corretta, è necessario vedere le fette x e z che si intersecano sulla radice desiderata e si può confermare visivamente la misura nella visuale 3D nascondendo i piani (Figura 7F).
  2. Quantificazione dell'espressione gingivale di Rankl/Opg e Rankl/Rank
    1. Raccogliere tessuto gengivale come descrittoin precedenza 9.
      NOTA: I migliori risultati di estrazione di RNA si ottengono utilizzando campioni di tessuto fresco e la purificazione dell'RNA deve essere processata il prima possibile.
    2. Estrae l'RNA del tessuto gengivale battendo le perle utilizzando il kit e le perline ceramiche indicate. Segui le istruzioni del kit e conserva il campione a -80 °C fino all'analisi tramite qRT-PCR.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

l'analisi rappresentativa dei dati delle misurazioni dell'osso alveolare lineare su topi femmina e maschi WT alla fase iniziale (salute) e 9 giorni dopo la legatura è presentata nella Figura 1A. Il calcolo di potenza indica che sono necessari un totale di 10 topi (4-5 per gruppo) per rilevare differenze tra questi gruppi se l'esito primario considerato sono i livelli ossei lineari misurati tramite μCT (Figura 1B). Tuttavia, un c...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il presente studio fornisce informazioni approfondite e linee guida dettagliate, passo dopo passo, sul protocollo semplificato del modello murino indotto da parodontite indotta da legatura precedentementepresentato 10. I dettagli inclusi nell'attuale articolo possono influenzare drasticamente la riproducibilità e sono supportati dall'esperienza del gruppo con questo specifico modello murino di parodontite indotta dalegatura 11,12,13,18,19,2...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I file STL utilizzati per creare i dispositivi stampati in 3D nella precedente pubblicazione9 sono soggetti a un accordo di copyright con l'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill ("UNC-Mouse Surgical Bed and UNC-Ligature Holder" UNC Ref. No. 18-0024). Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Institute of Dental & Craniofacial Research dei National Institutes of Health sotto i numeri di assegnazione K01DE027087 (JTM) e R01DE032830 (JTM). Il lavoro è stato inoltre supportato dal National Institute of Allergy and Infectious Diseases dei National Institutes of Health con il numero di premio R01-AI153265 (KVS). Il contenuto è esclusivamente di responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dei National Institutes of Health. Inoltre, la ricerca qui riportata è supportata dal codice finanziario del programma Fulbright/CAPES 001 (TA).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
LamaIntegra4-315CLama 15C
Perle ceramicheVWR10158-6080,5 mL x 1,4 mm Perle ceramiche
Materiale di colla/resinaLa Gorilla Glue Company8401519
Portalegatura (con taccetta)Centro centrale di UNC presso il Centro di Progettazione BeAM di UNC presso Chapel HillNon applicabile118,01 mm x 13 mm x 13,74 mm
Serratura del PortalegaturaCentro centrale di UNC presso il Centro di Progettazione BeAM di UNC presso Chapel HillNon applicabile17,5 mm x 14,57 mm x 17,8 mm
Lulzbot mini v1.0 3D stampante  Lulzbot (Fargo Additive Manufacturing Equipment 3D, LLC)Non applicabileOggetti Aleph, modello Lulzbot Mini v1.0
MicroView SoftwareInnovazioni in Parallax2.5.0-3139Software utilizzato per le misurazioni ossee
Letto dentale per topi (con tacche)Centro centrale di UNC presso il Centro di Progettazione BeAM di UNC presso Chapel HillNon applicabile103,86 mm x 196,85 mm x 50,99 mm
Piano letto dentale per topiCentro centrale di UNC presso il Centro di Progettazione BeAM di UNC presso Chapel HillNon applicabile99,8 mm x 77 mm x 21,5 mm
Filamento di acido polilattico (PLA)Parola parola55259PLA 3,0 mm
Kit Rapidpure per Tessuti RNAMP Biomedici112721050
Manico della lama del bisturiBard-Parker371030Manico della lama del bisturi 15C
Sutura-SetaStrumento chirurgico RobozSUT-15-1
Primer qPCR TaqmanThermo FisherGrado (Mm00437135_ m1), Rankl (Mm00441906_ m1), Opg (Mm00435452_ m1), Gapdh (Mm99999915_g 1)
VX-765  InvivoGen, San Diego, USA#inh-vx765-1Inibitore della caspasi-1 utilizzato per la modulazione dell'ospite

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Offenbacher, S. Periodontal diseases: pathogenesis. Ann Periodontol. 1 (1), 821-878 (1996).
  2. Alves, T., Swanson, K. V., Girnary, M. S., Freire, M., Moss, K., Divaris, K., Beck, J., Santos, P. C. P., Brickey, W. J., Wrobel, J. A., Min, H. Y., Syed, M., Morelli, T., Seaman, W. T., Preisser, J. S., Hu, D., Preisser, H., Makhanova, N., Susin, C., Vias, N. P., Styner, M., Zhang, S., Pirih, F. Q., Chang, J., Gill, H. S., Lietzan, A. D., Webster-Cyriaque, J., Ting, J. P. Y., Marchesan, J. T. Inflammasome targeting for periodontitis prevention is sex dependent. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (44), e2507092122(2025).
  3. Padial-Molina, M., et al. Methods to .validate tooth-supporting regenerative therapies. Methods Mol Biol. 887, 135-148 (2012).
  4. Hajishengallis, G. Illuminating the oral microbiome and its host interactions: animal models of disease. FEMS Microbiol Rev. 47 (3), fuad018(2023).
  5. Graves, D. T., Fine, D., Teng, Y. T., Van Dyke, T. E., Hajishengallis, G. The use of rodent models to investigate host-bacteria interactions related to periodontal diseases. J Clin Periodontol. 35 (2), 89-105 (2008).
  6. Hasturk, H., et al. RvE1 protects from local inflammation and osteoclast- mediated bone destruction in periodontitis. FASEB J. 20 (2), 401-403 (2006).
  7. Hasturk, H., et al. Phase IIa clinical trial of complement C3 inhibitor AMY-101 in adults with periodontal inflammation. J Clin Invest. 131 (23), e152973(2021).
  8. Maekawa, T., et al. Genetic and intervention studies implicating complement C3 as a major target for the treatment of periodontitis. J Immunol. 192 (12), 6020-6027 (2014).
  9. Maekawa, T., et al. Antagonistic effects of IL-17 and D-resolvins on endothelial Del-1 expression through a GSK-3beta-C/EBPbeta pathway. Nat Commun. 6, 8272(2015).
  10. Hajishengallis, G., Hasturk, H., Lambris, J. D. Contributing authors. C3-targeted therapy in periodontal disease: moving closer to the clinic. Trends Immunol. 42 (10), 856-864 (2021).
  11. Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nat Protoc. 13 (10), 2247-2267 (2018).
  12. Ribeiro, A. A., et al. Oral biofilm dysbiosis during experimental periodontitis. Mol Oral Microbiol. 37 (6), 256-265 (2022).
  13. Jiao, Y., et al. Induction of bone loss by pathobiont-mediated Nod1 signaling in the oral cavity. Cell host & microbe. 13 (5), 595-601 (2013).
  14. Marchesan, J. T., et al. Role of inflammasomes in the pathogenesis of periodontal disease and therapeutics. Periodontol 2000. 82 (1), 93-114 (2000).
  15. Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. J Vis Exp. (155), e59667(2020).
  16. Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505 (7485), 612-613 (2014).
  17. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
  18. Swanson, K. V., et al. Interferon activated gene 204 (Ifi204) protects against bone loss in experimental periodontitis. J Periodontol. 93 (9), 1366-1377 (2022).
  19. Sun, L., et al. IL-10 dampens an IL-17-mediated periodontitis-associated inflammatory network. J Immunol. 204 (8), 2177-2191 (2020).
  20. Offenbacher, S., et al. GWAS for Interleukin-1beta levels in gingival crevicular fluid identifies IL37 variants in periodontal inflammation. Nat Commun. 9 (1), 3686(2018).
  21. Apaza Alccayhuaman, K. A., et al. FasL is a catabolic factor in alveolar bone homeostasis. J Clin Periodontol. 50 (3), 396-405 (2023).
  22. Percie du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. BMJ Open Sci. 4 (1), e100115(2020).
  23. Percie du Sert, N., et al. Reporting animal research: Explanation and elaboration for the ARRIVE guidelines 2.0. PLoS Biol. 18 (7), e3000411(2020).
  24. Marchesan, J. T. Inflammasomes as contributors to periodontal disease. J Periodontol. 91 Suppl (1), S6-S11 (2020).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Alveolar Bone Destruction3D Printed ToolsMouse Dental BedLigature HolderMicro CT AnalysisGingival Gene ExpressionOsteoclastogenic SignalingInflammatory Bone Destruction

Articoli correlati