Articolo metodologico

Modello traslazionale di coltura cellulare 3D per valutare gli effetti dell'iperossia sulle cellule epiteliali delle vie aeree neonatali umane

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DOI:

10.3791/65913

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12 luglio 2024

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1Department of Pediatrics, Section of Neonatal-Perinatal Medicine, Center for Pregnancy and Newborn Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Medicine, Section of Pulmonary, Critical Care & Sleep Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un protocollo per stabilire un modello di coltura di interfaccia aria-liquido (ALI) utilizzando cellule epiteliali delle vie aeree tracheali neonatali (nTAEC) ed eseguire l'esposizione all'iperossia fisiologicamente rilevante per studiare l'effetto dello stress ossidativo indotto dall'atmosfera sulle cellule derivate dall'epitelio della superficie delle vie aeree neonatali in via di sviluppo.

Abstract

L'epitelio neonatale pretermine è costantemente esposto a fattori di stress ambientale. Uno di questi fattori di stress nei neonati con malattie polmonari include la tensione dell'ossigeno (O2) superiore a quella dell'atmosfera ambientale, definita iperossia (>21% O2). L'effetto dell'iperossia sulle vie aeree dipende da vari fattori, tra cui lo stadio di sviluppo delle vie aeree, il grado di iperossia e la durata dell'esposizione, con esposizioni variabili che possono portare a fenotipi unici. Sebbene siano state condotte ricerche approfondite sull'effetto dell'iperossia sull'alveolarizzazione polmonare neonatale e sull'iperreattività delle vie aeree, poco si sa sull'effetto sottostante a breve e lungo termine dell'iperossia sulle cellule epiteliali delle vie aeree neonatali umane. Una delle ragioni principali di ciò è la scarsità di un modello in vitro efficace per studiare lo sviluppo e la funzione epiteliale delle vie aeree neonatali umane. Qui, descriviamo un metodo per isolare ed espandere le cellule epiteliali delle vie aeree tracheali neonatali umane (nTAEC) utilizzando aspirati tracheali neonatali umani e coltivando queste cellule in coltura di interfaccia aria-liquido (ALI). Dimostriamo che gli nTAEC formano un monostrato di cellule polarizzate mature in coltura di ALI e vanno incontro a differenziamento mucociliare. Presentiamo anche un metodo per l'esposizione moderata all'iperossia del monostrato cellulare in coltura di ALI utilizzando un incubatore specializzato. Inoltre, descriviamo un test per misurare lo stress ossidativo cellulare a seguito di esposizione all'iperossia in coltura di ALI utilizzando la quantificazione fluorescente, che conferma che l'esposizione moderata all'iperossia induce stress ossidativo cellulare ma non causa danni significativi alla membrana cellulare o apoptosi. Questo modello può potenzialmente essere utilizzato per simulare l'esposizione all'iperossia clinicamente rilevante riscontrata dalle vie aeree neonatali nell'Unità di Terapia Intensiva Neonatale (NICU) e utilizzato per studiare gli effetti a breve e lungo termine dell'O2 sulla programmazione epiteliale delle vie aeree neonatali. Gli studi che utilizzano questo modello potrebbero essere utilizzati per esplorare modi per mitigare il danno ossidativo precoce alle vie aeree in via di sviluppo, che è implicato nello sviluppo di malattie delle vie aeree a lungo termine negli ex neonati prematuri.

Introduzione

L'ossigeno terapeutico (O2) è una delle terapie più utilizzate nell'unità di terapia intensiva neonatale (NICU)1. Di conseguenza, l'esposizione all'iperossia (>21% O2) è un fattore di stress atmosferico comune riscontrato dai neonati con e senza malattia polmonare significativa. Le risposte polmonari all'iperossia possono variare a seconda dell'intensità e/o della durata dell'esposizione e della posizione anatomica, del tipo di cellula e dello stadio di sviluppo polmonare 2,3,4,5,6. La maggior parte della ricerca sul danno polmonare da iperossia neonatale si è concentrata sull'effetto dell'esposizione all'iperossia nel contesto dell'alveolarizzazione postnatale per modellare la displasia broncopolmonare (BPD) - la malattia polmonare cronica più comune che colpisce i neonati pretermine 6,7,8,9,10,11. La gravità del BPD è classificata in base alla quantità di supporto respiratorio e all'O2 necessario a 36 settimane dopo l'età mestrualedi 9 anni. La maggior parte dei bambini con BPD migliora clinicamente nel tempo man mano che i polmoni continuano a crescere, con la maggior parte che svezza il supporto respiratorio prima del primo compleanno12,13. Indipendentemente dalla gravità della BPD dopo la nascita, le morbilità significative che colpiscono gli ex neonati prematuri includono un aumento di 5 volte del rischio di respiro sibilante in età prescolare, asma, infezioni respiratorie ricorrenti durante l'infanzia e broncopneumopatia cronica ostruttiva ad esordio precoce 12,14,15,16,17,18,19. L'effetto dell'iperossia sulla malattia a lungo termine delle vie aeree e sulle infezioni polmonari nei neonati pretermine è stato studiato utilizzando modelli animali in vitro e in vivo 20,21,22,23,24. Tuttavia, la maggior parte di questi modelli si è concentrata sul ruolo del tessuto mesenchimale, dell'epitelio alveolare e della muscolatura liscia delle vie aeree 25,26,27,28.

L'epitelio della superficie delle vie aeree riveste l'intero percorso dell'apparato respiratorio, estendendosi dalla trachea fino al bronchiolo terminale, terminando appena prima del livello degli alveoli29. Le cellule basali delle vie aeree sono le cellule staminali primarie nell'epitelio delle vie aeree, con la capacità di differenziarsi nell'intero repertorio di linee epiteliali mature delle vie aeree, che includono cellule ciliate e secretorie (cellule club: non produttrici di muco e cellule caliciformi: produttrici di muco)29,30,31,32. Gli studi sulle colture cellulari nel contesto del danno polmonare iperossico neonatale hanno utilizzato principalmente linee cellulari di cancro adulto umano o di topo33,34. Inoltre, la maggior parte degli esperimenti in vitro ha utilizzato sistemi di coltura sommersi, che non consentono la differenziazione delle cellule in un epitelio mucociliare delle vie aeree simile all'epitelio delle vie aeree in vivo nell'uomo35. Di conseguenza, vi è una lacuna nelle conoscenze riguardo agli effetti del danno polmonare indotto dall'iperossia nello sviluppo delle cellule epiteliali delle vie aeree dei neonati umani. Uno dei motivi è la scarsità di modelli traslazionali per studiare gli effetti dell'esposizione atmosferica sull'epitelio delle vie aeree neonatali umane. Il danno polmonare iperossico all'inizio della vita può portare a malattie delle vie aeree a lungo termine e ad un aumento del rischio di infezione, con conseguenti conseguenze che alterano la vita negli ex neonati prematuri 14,36,37. Nei neonati non sopravvissuti con BPD grave, l'epitelio della superficie delle vie aeree presenta anomalie distinte, tra cui iperplasia delle cellule caliciformi e sviluppo ciliare disordinato, che denotano un'anormale clearance mucociliare e un aumento dell'altezza epiteliale che compromette il calibro38 delle vie aeree. Nell'ultimo decennio, c'è stato un crescente interesse per la coltura di cellule epiteliali primarie delle vie aeree all'interfaccia aria-liquido (ALI) per studiare lo sviluppo epiteliale delle vie aeree postnatale 39,40,41,42. Tuttavia, i modelli ALI di cellule epiteliali delle vie aeree neonatali non sono stati utilizzati nel contesto di modelli di perturbazione redox atmosferica come l'esposizione all'iperossia.

Utilizzando un metodo39 precedentemente pubblicato, abbiamo utilizzato campioni di aspirato tracheale neonatale ottenuti da neonati intubati in terapia intensiva neonatale e isolato ed espanso con successo le cellule epiteliali delle vie aeree tracheali neonatali primarie (nTAEC). Abbiamo utilizzato inibitori della segnalazione Rho, Smad, glicogeno sintasi chinasi (GSK3) e bersaglio della rapamicina nei mammiferi (mTOR) per aumentare la capacità di espansione e ritardare la senescenza in queste cellule, come descritto in precedenza 39,42, il che consente un passaggio efficiente e successivo dei nTAEC. Il protocollo descrive i metodi per stabilire colture 3D di ALI utilizzando nTAEC ed eseguire l'esposizione all'iperossia sui monostrati nTAEC. L'inibizione di Rho e Smad viene utilizzata per i primi 7 giorni di coltura di ALI (giorni ALI da 0 a 7), dopodiché questi inibitori vengono rimossi dal terreno di differenziazione per il resto della durata della coltura di ALI. La superficie apicale del monostrato di cellule epiteliali delle vie aeree coltivate con ALI rimane esposta all'ambiente43, il che consente studi di perturbazione atmosferica e assomiglia molto alla patobiologia di una via aerea neonatale in via di sviluppo esposta all'iperossia in vivo. La concentrazione di O2 utilizzata in precedenti studi su colture cellulari (indipendentemente dalle cellule immortalizzate o primarie) di danno polmonare iperossico neonatale varia significativamente (dal 40% al 95%), così come la durata dell'esposizione (che varia da 15 minuti a 10 giorni)36,44,45,46,47. Per questo studio, il monostrato di cellule ALI è stato esposto al 60% di O2 per 7 giorni dal giorno 7 al 14 di ALI (dopo la rimozione degli inibitori Rho/Smad dai terreni di differenziazione). L'esposizione all'iperossia è stata eseguita durante la fase iniziale-media della differenziazione mucociliare (ALI da 7 a 14 giorni) rispetto all'epitelio maturo completamente differenziato e quindi simula l'epitelio delle vie aeree in via di sviluppo in vivo nei neonati pretermine. Questa strategia di esposizione riduce al minimo il rischio di tossicità acuta da O2 (che è prevista con concentrazioni più elevate di O2) pur esercitando lo stress ossidativo entro un intervallo fisiologicamente rilevante e assomiglia alla finestra critica di transizione dall'ambiente intrauterino relativamente ipossico a un ambiente esterno iperossico nei neonati umani pretermine.

Protocollo

I campioni di aspirato tracheale neonatale sono stati raccolti solo dopo il consenso informato dei genitori e il protocollo utilizzato per la raccolta, il trasporto e la conservazione è stato approvato dall'Institutional Review Board (IRB) dell'Health Sciences Center dell'Università dell'Oklahoma (IRB 14377).

1. Preparazione all'isolamento, al passaggio e alla coltura ALI di nTAEC

  1. Preparazione dei terreni
    1. Terreno epiteliale bronchiale delle vie aeree (BLEAM) con inibitori (BLEAM-I): preparare 500 ml (1 flacone, conservato a 4 °C) di BLEAM aggiungendo 1,25 ml di integratore HLL (500 μg/mL di albumina sierica umana, 0,6 μM di acido linoleico, 0,6 μg/mL di lecitina), 15 ml di L-glutammina (6 mM), 2 ml di estratto P (0,4%, estratto ipofisario bovino), 5 ml di TM1 (1 μM di adrenalina, 5 μg/mL di transferrina, 10 nM di triiodotironina, 0,1 μg/mL di idrocortisone, 5 ng/mL di fattore di crescita epidermico (EGF), 5 ng/mL di insulina), 1 mL di soluzione antibiotica (Normocin, 0,1 mg/mL). Per prevenire la senescenza delle cellule primarie e migliorare l'efficienza dell'espansione, aggiungere i seguenti inibitori del fattore di crescita come precedentemente descritto39: Y-27632 (proteina chinasi Rho-associata o inibitore ROCK) con una concentrazione finale di 5 μM, A83-01 (inibisce la segnalazione di Smad) con una concentrazione finale di 1 μM, CHIR 99021 (glicogeno sintasi chinasi-3 o inibitore di GSK3) con una concentrazione finale di 0,4 μM e Rapamicina (inibitore del bersaglio molecolare della rapamicina o mTOR) con un finale concentrazione di 5 nM. Filtrare il terreno attraverso un filtro poroso da 0,22 μm. Fare riferimento alla Tabella 1 per un elenco dei componenti multimediali.
    2. Terreno ALI a cellule epiteliali bronchiali/tracheali umane (HBTEC): preparare 500 ml di terreno HBTEC scongelando il flacone a 37 °C e aggiungendo 1 ml di soluzione antibiotica (Normocin, 0,1 mg/mL). Una volta aggiunto, filtrare il terreno attraverso un filtro poroso da 0,22 μm.
    3. Terreni HBTEC con inibitori (HBTEC-I): Preparare i supporti HBTEC come sopra. Prima di filtrare, aggiungere i seguenti inibitori: Y-27632 con una concentrazione finale di 5 μM e A83-01 con una concentrazione finale di 0,5 μM. Filtrare il mezzo attraverso un filtro poroso da 0,22 μm.
      NOTA: Conservare i terreni BLEAM-I, HBTEC e HBTEC-I a 4 °C, datati ed etichettati, al buio (avvolti in un foglio di alluminio) e riscaldare solo le aliquote necessarie (la durata di conservazione è di 30 giorni).
    4. HEPES/FBS: aggiungere 500 mL di soluzione salina tamponata con HEPES e 88 mL di FBS (la concentrazione finale è del 15%). Una volta aggiunta, filtrare la soluzione attraverso un filtro poroso da 0,22 μm e conservarla a 4 °C, datata ed etichettata.
      NOTA: Aliquotare e scaldare BLEAM, HEPES-FBS e Tripsina-EDTA a 37 °C (almeno 30 minuti) prima dell'uso.
  2. Palloni di coltura di rivestimento e inserti per colture cellulari ALI con un terreno condizionato 804G
    1. Preparare terreni condizionati con matrice di cellule 804G (linea cellulare epiteliale della vescica di ratto) come descritto in precedenza39.
    2. Rivestire il matraccio per colture cellulari e i foglietti illustrativi per colture cellulari con terreno condizionato a 804G per almeno 4 ore nell'incubatore a 37 °C, CO2 al 5%. Fare riferimento alla Tabella 2 per le quantità di terreno necessarie per rivestire i diversi palloni di coltura e inserti per colture cellulari.

2. Isolamento ed espansione dei nTAEC e preparazione per la successiva coltura di ALI

  1. Acquisire un aspirato tracheale fresco (circa 1 ml) durante l'aspirazione di routine del tubo endotracheale dei neonati intubati e raccogliere l'aspirato in una trappola per muco. Se il volume di aspirazione è insufficiente per raggiungere la trappola del muco, sciacquare il catetere di aspirazione con 1-3 ml di soluzione fisiologica sterile.
  2. Etichettare il campione e conservarlo in un sacchetto per il rischio biologico sul ghiaccio.
    NOTA: I campioni possono essere conservati con ghiaccio a 4 °C per un massimo di 24 ore. Tuttavia, la resa è maggiore con campioni freschi.
  3. Trasportare il campione dalla terapia intensiva neonatale al laboratorio. Rivestire un matraccio T25 con terreno condizionato con 804G e prepararsi per l'inoculazione del campione al momento del trasporto dell'aspirato tracheale in laboratorio.
  4. Rimuovere la trappola per il muco dalla sacca per il rischio biologico e pulire accuratamente le superfici esterne con etanolo al 70% per evitare qualsiasi contaminazione. Aprire con cautela il tappo della trappola per muco sotto una cappa sterile per colture cellulari.
  5. Diluire il campione di aspirato tracheale con PBS sterile a 5 mL (per diluire il muco) e trasferire l'intero contenuto in una provetta conica da 50 mL.
  6. Centrifugare la provetta a 250 x g, 20 °C-23 °C per 5 minuti ed eliminare il surnatante (compreso il muco).
    NOTA: Tutte le centrifugazioni qui vengono eseguite a 250 x g, 20 °C-23 °C per 5 minuti, se non diversamente specificato.
  7. Risospendere il pellet in 5 mL di BLEAM-I.
  8. Rimuovere il pallone T25 dall'incubatore ed eliminare il terreno condizionato 804G prima di placcare il campione.
  9. Placcare il campione nel pallone T25 e metterlo nell'incubatore a 37 °C, 5% di CO2 (questo sarà chiamato Passaggio 0 o P0).
  10. Sostituire il fluido con BLEAM-I 24 ore dopo la placcatura per lavare le celle non attaccate e successivamente ogni 48 ore.
    NOTA: Dopo aver processato il campione di aspirato tracheale e averlo incubato in terreno BLEAM-I, le cellule di forma cuboidale compaiono 7-10 giorni dopo la placcatura. Entro circa 3 settimane dalla placcatura, le celle sono densamente impacchettate e richiedono la tripsinizzazione per il successivo passaggio, espansione e conservazione. Le celle di passaggio precoce (P1 - P2) vengono poste in crioprovette (2,5 x 10,6 cellule per 500 μL di terreno di congelamento per criotubo) e conservate in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
  11. Scongelare rapidamente le cellule congelate dall'azoto liquido in un bagno d'acqua a 37 °C e trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile di dimensioni adeguate contenente BLEAM-I.
  12. Contare le cellule per determinare il numero totale e vivo di cellule utilizzando una macchia blu di tripano e un contatore di cellule automatico o manuale come descritto in precedenza48. Diluire la sospensione cellulare con un volume appropriato di BLEAM-I, in modo che la concentrazione finale sia 2,1 x 106 cellule in 15 mL di sospensione cellulare (per il pallone T75).
    NOTA: Per un matraccio T25, per la semina vengono generalmente utilizzate0,7 x 10 6 cellule in 5 mL di sospensione cellulare.
  13. Trasferire la sospensione cellulare da 15 mL in un matraccio T75 e incubare per una notte a 37 °C, 5% CO2.
  14. La mattina seguente, scambia i media con il nuovo BLEAM-I. Quindi, sostituisci il supporto con un nuovo BLEAM-I ogni 2 giorni. Una volta che le cellule sono intorno all'80%-90%, sono pronte per essere tripsinizzate per la coltura di ALI.
  15. Applicare 5 mL di tripsina-EDTA (T75) sul monostrato cellulare.
    NOTA: Ricordarsi di utilizzare tripsina fresca. Evitare l'uso di tripsina che è stata riscaldata più volte.
  16. Incubare il matraccio a 37 °C per 5 minuti nell'incubatore. Quindi, picchiettare il lato del pallone 8x-10x per rimuovere le celle. Controllare al microscopio per confermare che le cellule siano state rimosse dopo la tripsinizzazione. Se sul pallone rimane il >50% delle cellule, lavare con PBS 2x e ripetere la fase di tripsinizzazione con un tempo di incubazione ridotto di 2-3 minuti.
  17. Arrestare la reazione con 15 mL di HEPES-FBS e pipettare su e giù 4x-5x. Trasferire le cellule in una provetta sterile di dimensioni adeguate e centrifugare a 250 x g per 5 minuti per pellettare le cellule.
  18. Dopo la centrifugazione, aspirare con cura il surnatante. Sciogliere il pellet cellulare in 1 mL di BLEAM-I pipettandolo delicatamente su e giù 5x-10x.
  19. Conta le celle per determinare il numero totale e il numero di cellule vive. Diluire la sospensione cellulare con un volume appropriato di BLEAM-I, in modo che la concentrazione finale sia 1 x 105 cellule vive per 100 μl di sospensione cellulare.

3. Cultura ALI dei nTAEC

NOTA: I foglietti illustrativi per colture cellulari devono essere rivestiti con terreno condizionato con 804G e incubati per almeno 4 ore a 37 °C, 5% di CO2 prima della fase successiva (vedere la fase 1.2).

  1. Rimuovere le piastre per colture cellulari a 24 pozzetti contenenti gli inserti per colture cellulari dall'incubatore ed eliminare il terreno condizionato con 804G.
  2. Aggiungere 1 mL di BLEAM-I nella camera basolaterale (inferiore) di ciascun pozzetto di ALI. Aggiungere 100 μL di sospensione cellulare (1 x 105 cellule) alla camera apicale degli inserti di coltura cellulare ALI e incubare le cellule a 37 °C, 5% CO2. Questa fase è definita come ALI giorno -2.
  3. Il giorno seguente, sostituire il terreno nelle camere basolaterale (1 mL) e apicale (100 μL) con BLEAM-I fresco. Quando si cambia il terreno nella camera apicale, fare attenzione a non disturbare il monostrato cellulare. Questa fase è definita come ALI giorno -1.
  4. Il giorno seguente, rimuovere il terreno sia dalla camera basolaterale che da quella apicale.
    NOTA: Occorrono 2 giorni affinché le cellule sulla membrana della coltura cellulare diventino confluenti in condizioni di immersione. In questa fase, ALI può essere costituito.
  5. Aggiungere 1 mL di terreno HBTEC-I alla camera basolaterale, ma lasciare il terreno della camera apicale libero ed esposto all'aria. Questa fase è definita come ALI giorno 0.
  6. Continuare a sostituire il terreno HBTEC-I (1 mL) nella camera basolaterale ogni 48 ore dal giorno 0 al giorno 6 dell'ALI. Passare ai normali terreni HBTEC (senza inibitori) il giorno 7 di ALI fino al momento di raccolta desiderato.
    NOTA: Durante i primi 7 giorni di coltura ALI, i terreni dalla camera basolaterale possono fuoriuscire nella camera apicale. Questo terreno deve essere aspirato con cura ogni giorno per mantenere la salute dello strato cellulare e consentire loro di differenziarsi.
  7. Raccogli cellule, inserti di colture cellulari e terreni basolaterali in diversi punti temporali per tecniche molecolari, saggi e analisi.
    1. Per questo protocollo, nei giorni ALI 0, 7 e 28, prelevare le cellule per l'analisi dell'espressione genica qPCR (protocollo standard del produttore) dei marcatori di differenziazione epiteliale. Nei giorni 0, 7, 14 e 28 dell'ALI, raccogliere i foglietti di coltura cellulare per testare la funzione di barriera (metodi descritti di seguito).
    2. Nei giorni 0 e 28 dell'ALI, utilizzare inserti di coltura cellulare fissati in formalina per la colorazione immunofluorescente con marcatori di differenziazione epiteliale (utilizzando il protocollo precedentemente pubblicato)49. Il giorno 14 dell'ALI, raccogliere i terreni basolaterali per il rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) (protocollo standard del produttore), i lisati cellulari per la qPCR dei marcatori di stress ossidativo e l'immunoblot con anticorpi caspasi-3 e caspasi-3 scissa (protocollo standard del produttore) e inserti di coltura cellulare per il test dello stress ossidativo (metodo descritto di seguito).

4. Test della funzione di barriera durante la differenziazione ALI

  1. Misurazione della resistenza elettrica transepiteliale (TEER)
    NOTA: Misurare il TEER utilizzando l'EVOM (Epithelial Volt/Ohm Meter) durante la differenziazione dell'ALI per valutare l'integrità dello strato cellulare50.
    1. Prima di misurare i valori di resistenza del filtro di prova, utilizzare una coltura cellulare rivestita con terreno condizionato 804G (priva di cellule) per misurare il valore di resistenza di fondo in Ohm (Ω)
    2. Sottrarre il valore della resistenza di fondo dai valori di resistenza del filtro di prova e moltiplicare la differenza per l'area della superficie di crescita cellulare per ottenere il valore TEER per ciascun filtro di prova.
      TEER = (ΩT - ΩB) X C
      TEER = Resistenza elettrica transepiteliale (Ω.cm2)
      ΩT = Valore di resistenza del filtro di prova (Ω)
      ΩB = Valore della resistenza di fondo (Ω)
      C = Superficie di crescita cellulare (cm2)
      NOTA: Gli inserti per colture cellulari utilizzati per le misurazioni TEER vengono successivamente fissati con formalina tamponata al 10% e utilizzati immediatamente per la colorazione in immunofluorescenza e la microscopia a fluorescenza (metodo descritto di seguito) o conservati a 4 °C per la colorazione successiva.
  2. Saggio di permeabilità epiteliale della fluoresceina isetionato destrano (FITC-destrano)
    NOTA: Il test di permeabilità epiteliale è stato eseguito utilizzando due diversi pesi molecolari di FITC-destrano (10 kD e 20 kD) durante la differenziazione di ALI.
    1. Preparare la soluzione di lavoro FITC-destrano (1 mg/mL): misurare 5 mg di FITC e miscelare 1 mL di DMSO (5 mg/mL). Risospendere 5 mg/mL in terreno HBTEC riscaldato a 37 °C a una concentrazione di 1 mg/mL. Proteggere la soluzione dalla luce.
    2. Trasferire i filtri di prova (contenenti cellule) in una nuova piastra a 12 pozzetti e aggiungere 1 mL di terreno HBTEC nello scomparto basolaterale.
    3. Aspirare il terreno dello scomparto apicale (se presente) e sostituirlo con 250 μL di soluzione di lavoro FITC-destrano. Incubare a temperatura ambiente al riparo dalla luce per 60 min.
    4. Terminare il test FITC-destrano rimuovendo i filtri di prova (contenenti soluzione di lavoro FITC-destrano) dalla piastra a 12 pozzetti.
    5. Raccogliere il terreno basolaterale dalla piastra a 12 pozzetti in provette da microcentrifuga da 1,5 mL e vortex.
    6. Trasferire 100 μl di aliquote da ciascuna provetta in una micropiastra di polistirene nero a fondo trasparente a 96 pozzetti in triplicati. Trasferire 100 μl di terreno HBTEC in pozzetti aggiuntivi nella piastra a 96 pozzetti come controllo negativo per misurare la fluorescenza di fondo.
    7. Misura l'intensità della fluorescenza utilizzando uno spettrofotometro che utilizza un'eccitazione di 490 nm e un massimo di emissione di 520 nm.
    8. Sottrarre il valore medio della fluorescenza di fondo dai valori di fluorescenza del filtro di prova per ottenere una fluorescenza corretta ed esprimere i valori in percentuale rispetto ai valori di fluorescenza corretti al giorno 0 di ALI per FITC 10 kD e 20 kD.

5. Esposizione all'iperossia utilizzando l'incubatore TriGas

  1. Il giorno 7 dell'ALI, determinare il numero di inserti di coltura cellulare da mettere in iperossia in base alle esigenze sperimentali e di raccolta.
  2. Impostare il livello di O2 nell'incubatore TriGas al 60% di O2. In genere ci vogliono ~30-45 minuti perché il livello di O2 raggiunga il 60%.
  3. Una volta che il livello di O2 si stabilizza al 60%, posizionare la piastra per colture cellulari a 24 pozzetti con gli inserti per colture cellulari assegnati al gruppo iperossia all'interno dell'incubatore e chiudere lo sportello dell'incubatore.
    NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito nel modo più efficiente possibile per evitare un calo significativo del livello di O2 all'interno dell'incubatrice.
  4. Cambiare i terreni negli inserti di coltura cellulare esposti all'iperossia seguendo lo stesso programma dei pozzetti di controllo (21% O2 esposti). Controllare ogni giorno che gli inserti per colture cellulari non presentino perdite di terreno e aspirare delicatamente eventuali perdite nella camera di coltura cellulare.
  5. Continuare l'esposizione all'iperossia per 7 giorni (ALI giorni da 7 a 14). Una volta completata l'esposizione all'iperossia, raccogliere le cellule o eseguire saggi utilizzando inserti di coltura cellulare il giorno 14 di ALI.

6. Saggio dello stress ossidativo per valutare gli effetti dell'iperossia

NOTA: Abbiamo utilizzato il kit di analisi CM-H2DCFDA e misurato l'intensità della fluorescenza il giorno 14 di ALI come marcatore di stress ossidativo negli inserti di coltura cellulare dopo l'esposizione all'O2 . L'H2DCFDA è una forma chimicamente ridotta e acetilata di 2',7'-diclorofluoresceina (DCF), che è un indicatore delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) pervenute alle cellule vive. CM-H2DCFDA è il derivato clorometilico tiolo-reattivo di H2DCFDA, che promuove un ulteriore legame covalente ai componenti intracellulari, consentendo una più lunga ritenzione del colorante all'interno della cellula. Queste molecole non sono fluorescenti fino a quando i gruppi acetato non vengono rimossi dall'azione delle esterasi intracellulari e si verifica l'ossidazione nella cellula51. Dopo l'ossidazione intracellulare, l'aumento risultante della fluorescenza può essere misurato con un microscopio a fluorescenza come misura surrogata dello stress ossidativo cellulare52. Il reagente è leggero e sensibile all'aria e quindi deve essere protetto dalla luce e mantenuto ermetico il più possibile.

  1. Preparazione della soluzione di dosaggio CM-H2DCFDA: Ogni fiala contiene 50 μg di colorante reagente in polvere. Per ottenere una soluzione madre da 1 mM, aggiungere 80 μL di DMSO sterile alla fiala, mescolare bene con una pipetta e agitare delicatamente. Per una concentrazione finale di 1 μM del colorante negli inserti per colture cellulari, aggiungere 0,1 μL di 1 mM di stock per 100 μL di PBS (ad esempio, aggiungere 0,6 μL di soluzione madre a 600 μL di PBS per 6 inserti per colture cellulari).
    NOTA: La concentrazione finale del colorante può variare tra 1 e 5 μM. La dose deve essere ottimizzata per ogni condizione di coltura.
  2. Aggiungere 100 μl della soluzione colorante da 1 μM in ciascuna coltura cellulare sia per il gruppo esposto all'iperossia che per il gruppo esposto alla normossia. Utilizzare almeno 1 coltura cellulare come controllo negativo da ciascun gruppo di trattamento (100 μL di PBS senza colorante). Incubare a 37 °C per 30 minuti, al riparo dalla luce. Lavare 1 volta con PBS.
  3. Preparazione del vetrino: Scolare il PBS in eccesso. Tenere con cura gli inserti della coltura cellulare e utilizzare una lama per tagliare lentamente la membrana della coltura cellulare. Versare 1-2 gocce di liquido montante sul vetrino. Con una pinza a punta piatta, afferrare con cura l'angolo della membrana, posizionarla con la cellula rivolta verso il basso sul montante e coprirla con un vetrino coprioggetti. Rimuovere il liquido di montaggio in eccesso e lasciare asciugare all'aria per 15 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Le diapositive sono ora pronte per essere visualizzate.
    NOTA: La preparazione del vetrino e della microscopia fluorescente deve essere eseguita il più velocemente possibile poiché l'intensità della fluorescenza diminuisce significativamente nell'arco di 2-3 ore.
  4. Microscopia a fluorescenza: Acquisizione di immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza utilizzando il canale Cy2 (cianine-2). Acquisisci immagini da tre aree separate e non sovrapposte per coltura cellulare.
  5. Rilevamento fluorescente dello stress ossidativo
    NOTA: Utilizzare le immagini della microscopia a fluorescenza fluorescente per misurare la fluorescenza cellulare totale corretta (CTCF) utilizzando il software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) e il flusso di lavoro descritto di seguito. CTCF funge da marcatore per lo stress ossidativo negli inserti di coltura cellulare in seguito all'esposizione all'iperossia e viene misurato eliminando la fluorescenza di fondo con l'aiuto del software ImageJ.
    1. Aprire l'immagine al microscopio in ImageJ e selezionare l'area di interesse utilizzando lo strumento rettangolo. Salva l'area di selezione (α) facendo clic con il pulsante destro del mouse e seleziona Aggiungi al gestore ROI (regione di interesse). Utilizzare quest'area di selezione tra le immagini.
    2. Selezionare i parametri per la misurazione in Analizza > Imposta misurazioni e selezionare Area, Densità integrata e Valore medio di grigio nella scheda delle impostazioni.
    3. Per ogni immagine, utilizza la stessa area di selezione dal gestore ROI e seleziona Analizza > misura. Il valore di densità integrato rappresenta la fluorescenza totale (Ft) dell'area selezionata. Annotare i valori di misurazione dalla finestra pop-up.
    4. Per correggere la fluorescenza di fondo (Fb) in ogni immagine, selezionare una piccola area di regione non fluorescente con lo strumento rettangolo. Selezionare Analizza > Misura per questa regione. Il valore medio dell'intensità rappresenta Fb. Annotare i valori di misurazione dalla finestra pop-up.
    5. Calcola CTCF moltiplicando l'intensità media di fluorescenza delle letture di fondo per l'area totale del ROI e sottraendo questo numero dal valore di densità integrato del ROI. Ripetere questo flusso di lavoro per tutte le immagini per entrambi i gruppi di trattamento (Controllo e Iperossia).
      CTCF = Ft - (Fb x α)
      CTCF = Fluorescenza cellulare totale corretta (U.A.)
      Ft = fluorescenza totale
      Fb = Fluorescenza di fondo
      α = Area di selezione

Risultati

Per isolare gli nTAEC, abbiamo raccolto aspirati tracheali da neonati intubati nella terapia intensiva neonatale e trasportato gli aspirati su ghiaccio in laboratorio per un'ulteriore elaborazione (Figura 1A). Dopo aver seminato i campioni di aspirato tracheale in un terreno di crescita epiteliale delle vie aeree (BLEAM-I contenente inibitori di Rho/Smad, GSK3 e mTOR), le cellule cuboidali sono comparse entro 7-10 giorni. Entro 14 giorni, le cellule erano confluenti al 50%-60% e circa 21 giorni dopo la placcatura, le cellule erano densamente impacchettate e richiedevano tripsinizzazione per il successivo passaggio ed espansione. I passaggi seriali di queste celle (fino a P3) sono stati crioconservati in azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Le cellule (≤ passaggio 3) sono state quindi scongelate per la coltura di ALI.

Gli nTAEC sono stati coltivati in ALI una volta raggiunta circa l'80%-90% di confluenza in una piastra T75 in condizioni sommerse. Abbiamo eseguito la colorazione in immunofluorescenza del monostrato nTAEC al giorno 0 di ALI con i marcatori specifici delle cellule basali - citocheratina-5 (KRT5)53 e proteina tumorale p63 (TP63)54 (Figura 1B). Al giorno 0 dell'ALI, quasi tutte le cellule sono KRT5 e TP63 positive, suggerendo un fenotipo di cellule basali delle vie aeree con una differenziazione minima. Dopo la costituzione dell'ALI, il TEER è stato misurato utilizzando EVOM (Figura 1C) ed è aumentato rapidamente nella fase iniziale della coltura di ALI (dal giorno 0 al giorno 7) quando gli nTAEC hanno iniziato a formare un monostrato di cellule polarizzate mature, con successivo plateau del TEER tra il giorno 7 e il giorno 28 (Figura 1D). Inoltre, il FITC-destrano di due pesi molecolari (10 kD e 20 kD) è stato utilizzato per valutare la permeabilità paracellulare durante la differenziazione di ALI e ha mostrato una graduale diminuzione complessiva della fluorescenza nel tempo (Figura 1E). Ciò è correlato alla formazione di un monostrato di cellule mature durante la differenziazione di ALI con diminuzione della permeabilità ai soluti. 

Durante la coltura di ALI, le cellule basali si differenziano in linee epiteliali mature, che includono cellule ciliate, cellule club non secernenti muco e cellule caliciformi secernenti muco39. L'analisi dell'espressione genica dei marcatori specifici delle cellule epiteliali mature al giorno 0 dell'ALI ha mostrato un'espressione minima o nulla della proteina J155 (FOXJ1, marcatore delle cellule ciliate), dell'uteroglobina56 (SCGB1A1, marcatore delle cellule club) e della mucina-5AC57 (MUC5AC, marcatore delle cellule caliciformi; Figura 2A), con successivo aumento (ALI giorni 7 e 28) che suggerisce una differenziazione in questi sottotipi epiteliali maturi delle vie aeree durante la coltura di ALI. Inoltre, abbiamo eseguito la colorazione immunofluorescente il giorno 28 di ALI utilizzando marcatori specifici delle cellule epiteliali mature e la differenziazione epiteliale quantificata costituita da cellule ciliate positive per tubulinaacetilata 58 (TUBA4A) (~22%), cellule club SCGB1A1 positive (~13%) e cellule caliciformi positive per MUC5AC (~3%), mentre il resto è costituito da cellule basali positive per KRT5 (~51%) e altri tipi di cellule rare (Figura 2B).

Gli inibitori di Rho e Smad sono stati utilizzati durante i primi 7 giorni di coltura di ALI (giorni ALI da 0 a 7) e poi rimossi dai terreni di differenziazione per il resto della durata della coltura di ALI (Figura 3A). La superficie apicale del monostrato cellulare durante la coltura di ALI è esposta all'aria, consentendo studi sulle perturbazioni atmosferiche. L'esposizione all'iperossia del monostrato cellulare è stata eseguita con il 60% di O2 in modo continuo per 7 giorni dal giorno 7 al 14 dell'ALI utilizzando l'incubatore TriGas. Il gruppo di controllo è stato mantenuto in un incubatore separato con esposizione all'aria ambiente (21% O2). Data l'intenzione futura di studiare le conseguenze di lunga durata (1-2 settimane dopo il completamento dell'esposizione all'O2) dell'esposizione all'O2 sullo sviluppo e la rigenerazione degli epiteliali delle vie aeree, era essenziale che l'esposizione all'O2 non provocasse una grave citotossicità o un danno alla membrana nella misura in cui interrompesse significativamente il monostrato cellulare dell'ALI. Per valutare il danno alla membrana cellulare, abbiamo misurato il rilascio di LDH nel terreno basolaterale il giorno 14 dell'ALI, che non ha mostrato differenze significative tra l'iperossia e le colture trattate con aria ambiente (Figura 3B). Per valutare ulteriormente se gli effetti citotossici dell'O2 fossero abbastanza significativi da indurre l'apoptosi nei nTAEC, abbiamo eseguito l'immunoblot per la caspasi-3 totale e la caspasi-359 scissa sui lisati cellulari raccolti da gruppi esposti all'iperossia e all'aria ambiente il giorno 14 dell'ALI (Figura 3C). L'espressione totale della caspasi-3 è risultata comparabile tra i due gruppi e l'espressione della caspasi-3 scissa non è stata rilevata, suggerendo che 7 giorni di esposizione al 60% di O2 non hanno indotto apoptosi nei nTAEC al giorno 14 dell'ALI. Inoltre, è stato progettato un controllo positivo con l'incubazione notturna di nTAEC in condizioni sommerse con concentrazioni crescenti di staurosporina (0,5 μM, 1 μM e 2 μM), un agente citotossico e un induttore dell'apoptosi. L'immunoblotting per l'espressione della caspasi-3 totale e della caspasi-3 scissa ha confermato il successo dell'induzione dell'apoptosi. Per misurare lo stress ossidativo indotto dall'esposizione al 60% di O2, è stato eseguito un test di stress ossidativo cellulare con misurazione dell'intensità fluorescente sui monostrati cellulari nTAEC su ALI 14 (Figura 3D). L'esposizione all'iperossia ha causato un aumento significativo dell'intensità della fluorescenza fluorescente (calcolata dalla fluorescenza cellulare totale corretta o CTCF) rispetto alle cellule esposte all'aria ambiente, suggerendo un aumento dello stress ossidativo cellulare. L'analisi dell'espressione genica dei geni antiossidanti ha mostrato che il 60% di O2 ha causato una sovraregolazione di questi geni antiossidanti al giorno 14 di ALI, con catalasi, SOD1, SOD2 e GPX3 significativamente sovraregolate (Figura 3E).

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Figura 1: Le cellule epiteliali delle vie aeree tracheali neonatali (nTAEC) sono isolate con successo da aspirati tracheali neonatali e coltivate in interfaccia aria-liquido (ALI). (A) Le nTAEC isolate utilizzando l'aspirazione tracheale da neonati intubati sono state fatte passare in condizioni sommerse con successiva coltura di ALI. (B) Le cellule sono state raccolte il giorno 0 di ALI per la colorazione immunofluorescente con marcatori di cellule basali delle vie aeree - KRT5 (rosso) e TP63 (rosso). I nuclei sono colorati di blu con DAPI. Barra della scala = 50 μm. (C) Misurazione della resistenza elettrica transepiteliale (TEER) in inserti di coltura cellulare utilizzando un misuratore epiteliale di volt/ohm (EVOM). (D) Il TEER è stato misurato durante la differenziazione dell'ALI. Dati presentati come media (n=2 donatori, 5-10 pozzetti per donatore per punto temporale). Le barre di errore indicano il SEM. (E) Il test di permeabilità transepiteliale dell'isotiocianato-destrano della fluoresceina (FITC-destrano) è stato eseguito durante la differenziazione dell'ALI utilizzando due diversi pesi molecolari del FITC-destrano (10 kD e 20 kD). La soluzione di FITC-destrano (10 kD o 20 kD) è stata aggiunta alla camera apicale e gli inserti di coltura cellulare sono stati incubati a temperatura ambiente per 60 minuti. La fluorescenza nel mezzo della camera basolaterale è stata misurata spettrofotometricamente in piastre a 96 pozzetti. La fluorescenza di fondo (terreno HBTEC) è stata sottratta dalle misurazioni del test per ottenere un valore di fluorescenza corretto (espresso in percentuale rispetto ai valori del giorno 0). Dati presentati come media (n=2 donatori, tre pozzetti per donatore per punto temporale per ogni peso molecolare di FITC-destrano). Le barre di errore indicano SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Le cellule epiteliali delle vie aeree tracheali neonatali (nTAEC) subiscono differenziazione mucociliare durante la coltura dell'interfaccia aria-liquido (ALI). (A) Le cellule sono state raccolte nei giorni ALI 0, 7 e 28 per l'analisi qPCR di marcatori specifici delle cellule epiteliali: citocheratina-5 (KRT5) per basale, proteina a forchetta J1 (FOXJ1) per ciliata, uteroglobina (SCGB1A1) per club e mucina-5AC (MUC5AC) per cellule caliciformi. L'espressione relativa di ciascun gene è stata determinata utilizzando il metodo δCt con GAPDH come controllo endogeno. Dati presentati come media (da n = 3 donatori, tre pozzetti per donatore per punto temporale). Le barre di errore indicano il SEM. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando l'ANOVA bidirezionale con l'analisi post-hoc di Tukey, *p=0,0114, ***p=0,0005, ***p<0,0001. (B) La colorazione immunofluorescente di cellule basali (KRT5, rosso), ciliate (tubulina acetilata o TUBA4A, verde), club (SCGB1A1, rosso) e calice (MUC5AC, verde) è stata eseguita il giorno 28 di ALI per quantificare la differenziazione epiteliale. I nuclei sono colorati di blu con DAPI. I dati per la percentuale (%) di cellule positive sono presentati come media (n=2 donatori, due inserti per coltura cellulare per donatore, 6-8 immagini non sovrapposte per vetrino, minimo 3000 cellule contate per vetrino). Le barre di errore indicano SEM. Barra di scala = 50 μm.  Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: L'iperossia induce stress ossidativo cellulare nelle cellule epiteliali delle vie aeree tracheali neonatali (nTAEC) ma non causa danni significativi alla membrana cellulare o apoptosi. (A) Cronologia sperimentale per l'esposizione all'iperossia di nTAEC utilizzando l'incubatore Trigas. L'esposizione all'ossigeno è iniziata dopo che gli inibitori sono stati rimossi dal terreno di differenziazione il giorno 7 dell'ALI ed è continuata per 7 giorni (dal giorno 7 al 14). (B) Il terreno basolaterale è stato raccolto per il test di rilascio di LDH per valutare il danno alla membrana cellulare tra il gruppo esposto all'aria ambiente (controllo) e il 60% di O2 (iperossia) al giorno 14 dell'ALI. Dati presentati come singoli punti dati (assorbanza corretta) con linee che denotano la media generale per ciascun gruppo, n=3 donatori indicati da cerchi neri, quadrati e triangoli con quattro pozzetti per donatore, rispettivamente. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando un t-test non accoppiato, p=0,6184. (C) Le cellule sono state raccolte il giorno 14 dell'ALI ed è stato eseguito l'immunoblotting per i marcatori di apoptosi (caspasi-3 e caspasi-3 scissata) per confrontare le risposte tra l'aria ambiente e i nTAEC esposti a O2. Il controllo positivo per il test è stato progettato incubando i nTAEC durante la notte con staurosporina (Stau 0,5 μM, 1 μM e 2 μM) o il controllo del veicolo (Veh Ctrl) in una condizione di coltura sommersa. Le cellule sono state raccolte per l'immunoblot con l'anticorpo caspasi-3 totale e caspasi-3 scissata. La densitometria è stata eseguita con α-tubulina come gene di pulizia. Dati presentati come media (da n=2-3 donatori, da uno a due pozzetti per donatore). Le barre di errore indicano il SEM. Un t-test non accoppiato è stato utilizzato per confrontare l'espressione totale della caspasi-3 tra l'aria ambiente e il gruppo O2 al 60%, p = 0,4. L'ANOVA unidirezionale è stata utilizzata per confrontare l'espressione totale della caspasi-3 e della caspasi-3 scissa tra i gruppi esposti a Veh Ctrl e Stau, *p<0,05, ***p<0,0005. (D) Il test CM-H2DCFDA per lo stress ossidativo cellulare è stato eseguito il giorno 14 dell'ALI con inserti di coltura cellulare raccolti dall'aria ambiente e nTAEC esposti a O2. Vengono mostrate immagini rappresentative al microscopio a fluorescenza dell'aria ambiente (controllo) e degli inserti di coltura cellulare esposti al 60% di O2 (iperossia). La fluorescenza cellulare totale corretta (CTCF) è stata calcolata per confrontare lo stress ossidativo cellulare tra l'aria ambiente e il 60% di nTAEC esposti a O2. I dati CTCF sono presentati come singoli punti dati con una linea che indica la media generale per ciascun gruppo, 6-7 immagini/gruppo da 2 donatori individuali (cerchi e quadrati neri) con due pozzetti per donatore. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando un test t non appaiato, *p<0,05. Barra della scala = 50 μm. (E) Le cellule sono state raccolte il giorno 14 dell'ALI dall'aria della stanza ed è stato eseguito pozzetti esposti all'iperossia per l'analisi qPCR dei geni dello stress ossidativo, tra cui catalasi, superossido dismutasi 1 e 2 (SOD1 e SOD2), glutatione perossidasi 1, 2 e 3 (GPX1, GPX2 e GPX3). I dati di variazione del fold di ciascun gene sono stati determinati utilizzando il metodo δCt con 18s rRNA come controllo endogeno. Dati presentati come media (da n=3 donatori, due pozzetti per donatore). Le barre di errore indicano il SEM. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando un test t non accoppiato, *p<0,05, **p=0,006.  Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Componente multimedialeImportoConcentrazione finale
BLEAM-I
Supporti BLEAM500 ml
Integratore HLL1,25 ml500 μg/mL di albumina sierica umana
0,6 μM di acido linoleico; 0,6 μg/mL di lecitina
L-Glutammina15 ml6 milioni
Estratto P2 ml0,4% estratto di ipofisi bovina
TM15 ml1 μM di adrenalina; 5 μg/mL di transferrina
10 nM di triiodotironina; 0,1 μg/mL di idrocortisone
5ng/mL Fattore di crescita epidermico (EGF)
5 ng/mL di insulina
Normocin1 ml0,1 mg/mL
Y-27632Può variare in base al numero di lotto5 μM
A83-01Può variare in base al numero di lotto1 μM
Codice CHIR 99021Può variare in base al numero di lotto0,4 μM
RapamicinaPuò variare in base al numero di lotto5 nM
HBTEC
Supporti HBTEC500 ml
Normocin1 ml0,1 mg/mL
HBTEC-I
Supporti HBTEC500 ml
Normocin1 ml0,1 mg/mL
Y-27632Può variare in base al numero di lotto5 μM
A83-01Può variare in base al numero di lotto0,5 μM

Tabella 1: Componenti dei terreni per il terreno delle vie aeree epiteliali bronchiali con inibitori (BLEAM-I), i terreni ALI delle cellule epiteliali bronchiali/tracheali umane con inibitori (HBTEC-I) e HBTEC.

Palloni per colture cellulari/Inserti per colture cellulariTerreno condizionato con cellule 804G (mL)
Pallone T253 ml
Pallone T755 ml
Inserto per colture cellulari a 24 pozzetti (dimensione dei pori 0,4 μm, superficie 0,33 cm2 )400 μl

Tabella 2: Volumi di terreni condizionati con matrice cellulare 804G necessari per i matracci di coltura e gli inserti per colture cellulari.

Discussione

Il protocollo qui descritto descrive in dettaglio un metodo per la raccolta e l'elaborazione di campioni di aspirato tracheale neonatale da neonati intubati in terapia intensiva neonatale con successivo isolamento ed espansione di nTAEC vivi da questi campioni utilizzando metodi precedentemente stabiliti39. Inoltre, abbiamo descritto un metodo per la coltura di nTAEC su ALI e la caratterizzazione della loro differenziazione in un epitelio mucociliare polarizzato delle vie aeree in funzione del tempo attraverso la misurazione di TEER, il saggio FITC-destrano, la colorazione immunofluorescente e l'analisi qPCR di marcatori specifici per tipo di cellula (ad esempio, basale, ciliata, clava e calice). L'aspetto innovativo di questo protocollo è la perturbazione redox atmosferica eseguita attraverso l'esposizione moderata all'iperossia (60% O2) su monostrati nTAEC in via di sviluppo. Abbiamo dimostrato che l'esposizione al 60% di O2 per 7 giorni induce stress ossidativo cellulare nei nTAEC. Dimostriamo inoltre che la strategia di esposizione all'O2 non induce apoptosi cellulare significativa o danno alla membrana cellulare, il che consente il mantenimento di questi nTAEC in coltura di ALI oltre il tempo di completamento dell'esposizione all'O2 . Pertanto, il modello può essere potenzialmente utilizzato per studiare gli effetti sia a breve che a lungo termine dell'esposizione all'O2 sulla programmazione epiteliale delle vie aeree neonatali.

La coltura di nTAEC nell'ALI conferisce alcuni vantaggi rispetto alla coltura sommersa convenzionale in quanto promuove la formazione di un monostrato epiteliale polarizzato delle vie aeree con formazione di giunzioni strette e differenziazione mucociliare60,61. Precedenti studi con nTAEC hanno dimostrato che nella fase iniziale della coltura di ALI (dal giorno 0 al 7 dell'ALI), le cellule subiscono una pseudo-stratificazione (apparendo come multistrato anziché come strato di singola cellula) e infine formano un epitelio pseudostratificato maturo entro la fine della seconda settimana42,62. La formazione di giunzioni strette segue una traiettoria simile nella fase iniziale della coltura di ALI, accompagnata da un rapido aumento di TEER con un successivo plateaudi 63, dimostrato nel modello con nTAEC. Inoltre, le cellule epiteliali delle vie aeree coltivate in ALI migliorano l'espressione e la localizzazione apico-laterale della claudina-1 (un componente del complesso di giunzione stretta), che aumenta le proprietà di tenuta delle giunzioni strette durante la coltura di ALI, promuovendo la formazione di un monostrato di cellule mature63. Ciò è correlato a una diminuzione della permeabilità paracellulare, che è stata testata nel modello con il saggio FITC-destrano e ha dimostrato una tendenza generalmente decrescente nella permeabilità del monostrato. Abbiamo delineato il pattern di differenziazione mucociliare nei nTAEC con immunocolorazione per marcatori specifici per cellule ciliate (TUBA4A), club (SCGB1A1) e calici (MUC5AC) al giorno 28 di ALI. Inoltre, abbiamo eseguito l'espressione genica di marcatori specifici per cellule ciliate (FOXJ1), club (SCGB1A1) e calici (MUC5AC) durante il corso temporale di ALI. Altri gruppi hanno dimostrato che il fattore di trascrizione FOXJ1 è essenziale per la ciliogenesi mobile, mentre TUBA4A è presente sia nelle ciglia primarie che in quelle mobili64,65. In questo modello, il pattern di espressione genica per FOXJ1 durante la differenziazione ALI dei nTAEC è approssimativamente correlato con il tempo di comparsa delle ciglia mobili nella coltura epiteliale delle vie aeree da studi precedenti 64,66.

Un recente studio di Teape et al. ha valutato gli effetti proteomici e metabolomici dell'esposizione all'iperossia sulla coltura di ALI67. Tuttavia, le cellule sono state derivate da donatori adulti. Precedenti studi sul virus respiratorio sinciziale (RSV)62,68,69,70 e la recente pandemia di COVID-1971 hanno evidenziato l'importanza delle differenze legate all'età nella risposta e nella funzione epiteliale delle vie aeree. Zhao et al. hanno utilizzato flussi di lavoro simili per isolare le cellule epiteliali delle vie aeree neonatali e adulte e hanno dimostrato che dopo 21 giorni di differenziazione di ALI, non c'erano differenze significative nella composizione cellulare tra le cellule epiteliali delle vie aeree neonatali e adulte62. Tuttavia, c'erano differenze distinte nella loro risposta all'infezione da RSV, con le cellule neonatali che mostravano più cellule infettate da RSV e danni epiteliali rispetto agli adulti. In generale, le condizioni di coltura utilizzate da Zhao et al. hanno prodotto una differenziazione più robusta nei nTAEC rispetto ai nostri, con un numero maggiore di cellule ciliate (41% vs 22%) e caliciformi (10% vs 3%). Queste differenze potrebbero essere attribuite all'uso di diversi terreni di crescita. È stato dimostrato che il terreno PneumaCult-ALI utilizzato dal loro gruppo (al contrario del terreno HBTEC-ALI) induce una differenziazione più robusta con un numero maggiore di cellule ciliate e caliciformi72. In questo modello, l'espressione genica di marcatori specifici per tipo di cellula per cellule ciliate, clava e caliciformi ha mostrato un rapido aumento iniziale (ALI dal giorno 0 al 7) con un successivo decremento intorno al giorno 28 dell'ALI. Una possibile ragione potrebbe essere il plateau della differenziazione dopo il giorno 14 di ALI, che è stato dimostrato in studi precedenti con nTAEC42.

Abbiamo descritto l'uso di un'esposizione moderata all'iperossia (60% O2) per 7 giorni, che riteniamo simuli più da vicino le esperienze di vita reale dei neonati pretermine nelle UTIN rispetto all'uso di livelli molto elevati di O2 (> 80% O2)67 dove il rischio di tossicità acuta da O2 è aumentato1, 5. Infatti, è stato dimostrato che l'esposizione al 95% di O2 del tessuto polmonare neonatale induce l'apoptosi cellulare attraverso l'attivazione della caspasi73. Tuttavia, questa strategia di esposizione è rilevante solo in una piccola percentuale di neonati in UTIN che, come conseguenza del danno polmonare acuto indotto da O2, sviluppano BPD grave con patologie bronchiali croniche (modello di danno polmonare acuto)37. Nell'era moderna dell'uso giudizioso della terapia O2 , la maggior parte dei bambini prematuri non viene esposta a un O2 così alto; Tuttavia, sono ancora a rischio di sviluppare future malattie delle vie aeree (modello di perturbazione dello sviluppo). In quest'ultimo gruppo, la lesione da perturbazione redox precoce può essere inizialmente silente, ma manifestarsi successivamente durante l'età infantile o oltre sotto forma di malattia cronica delle vie aeree37. I nostri dati che utilizzano il saggio dello stress ossidativo cellulare hanno mostrato che l'esposizione moderata all'iperossia (60% O2) aumenta significativamente lo stress ossidativo all'interno del monostrato cellulare nTAEC. L'analisi del rilascio di LDH e dell'attivazione della caspasi-3 cellulare ha suggerito che la nostra strategia di esposizione all'iperossia non ha causato una morte cellulare significativa. I metodi e il sistema modello che descriviamo possono potenzialmente essere utilizzati per scoprire meccanismi molecolari sensibili all'O2 nelle prime fasi della vita come collegamento allo sviluppo successivo della malattia polmonare nei neonati prematuri.

Durante la vita fetale, le cellule epiteliali delle vie aeree sono immerse nel liquido polmonare e si trovano nell'ambiente intrauterino relativamente ipossico26. Le cellule epiteliali delle vie aeree neonatali subiscono un rapido turnover e differenziazione e formano una barriera critica tra il polmone e il mondo esterno. Quando i neonati passano alla vita postnatale, le cellule epiteliali delle vie aeree sono esposte a un ambiente postnatale relativamente iperossico. Questa transizione è resa più brusca nei neonati prematuri e clinicamente malati poiché richiedono anche di routine l'O2 terapeutico come parte della loro cura40,74, esponendoli ad alto rischio di danno ossidativo dopo la nascita1. Mentre gli effetti dell'iperossia sull'alveolarizzazione polmonare postnatale sono stati ben caratterizzati utilizzando modelli animali75, gli effetti dell'esposizione all'iperossia sullo sviluppo delle cellule epiteliali delle vie aeree sono relativamente poco studiati38. L'uso di cellule epiteliali delle vie aeree di derivazione neonatale umana con esposizione all'iperossia fisiologicamente rilevante durante l'ALI aggiunge rilevanza traduzionale al nostro modello. Inoltre, l'uso dell'esposizione all'iperossia durante la fase iniziale-media della differenziazione attiva e della formazione di monostrati cellulari piuttosto che l'epitelio maturo delle vie aeree67 completamente differenziato simula potenzialmente lo scenario clinico nei neonati estremamente prematuri (< 28 settimane di gestazione) che nascono durante le fasi precedenti (da canalicolare a sacculare) dello sviluppo polmonare piuttosto che durante lo stadio alveolare7.

Il nostro modello ha dei limiti che devono essere considerati quando lo si applica allo sviluppo umano e alle malattie. Abbiamo utilizzato la riprogrammazione condizionale di cellule epiteliali primarie delle vie aeree neonatali precedentemente pubblicate in un modello ALI di nTAEC39. L'uso di inibitori del fattore di crescita (Rho/Smad/GSK3/mTOR) consente un passaggio più rapido e tardivo di queste cellule. Abbiamo cercato di coltivare nTAEC sia in condizioni sommerse che ALI senza inibitori nel terreno di crescita; tuttavia, l'espansione e il passaggio di queste cellule erano significativamente più lenti e il monostrato cellulare in ALI diventava permeabile entro la fine della seconda settimana (dati non mostrati). Un altro gruppo che utilizzava gli stessi inibitori per la coltura di cellule epiteliali primarie delle vie aeree neonatali42 ha eseguito il sequenziamento dell'RNA a singola cellula per dimostrare che la presenza di questi inibitori non causava un'espressione differenziale significativa di geni coinvolti nello stress ossidativo, nella transizione epiteliale-mesenchimale o nella senescenza cellulare. Tuttavia, abbiamo considerato questa limitazione nel nostro modello e abbiamo deciso di eseguire l'esposizione all'iperossia dopo che gli inibitori di Rho e Smad sono stati rimossi dai mezzi di differenziazione. Per questo studio, abbiamo testato solo gli effetti moderati dell'iperossia (60% O2) sui nTAEC. Tuttavia, studi futuri intendono utilizzare l'esposizione graduata all'iperossia (40%, 60% e 95% O2) e confrontare le risposte nei nTAEC. Sebbene il modello qui descritto abbia un fascino traslazionale dato l'uso di cellule provenienti da neonati umani ricoverati in terapia intensiva neonatale, si tratta di un modello di coltura cellulare in vitro e, pertanto, risultati significativi che utilizzano questo modello giustificherebbero la conferma con un modello animale complementare in vivo .

In conclusione, abbiamo descritto il metodo passo dopo passo per stabilire un modello di coltura ALI 3D in vitro utilizzando cellule epiteliali delle vie aeree neonatali isolate da aspirati tracheali di neonati intubati in terapia intensiva neonatale. Abbiamo utilizzato questo modello per esaminare gli effetti dell'esposizione moderata all'iperossia, un insulto ambientale comune nei neonati prematuri nelle UTIN. L'esposizione all'iperossia ha indotto stress ossidativo cellulare nel monostrato cellulare senza causare danni significativi alla membrana cellulare o morte cellulare, consentendo la continuazione della coltura di ALI per studiare gli effetti duraturi dell'esposizione all'O2 sullo sviluppo e la funzione epiteliale delle vie aeree neonatali. Le applicazioni future che utilizzano questi metodi potrebbero potenzialmente scoprire meccanismi di malattia precoce coinvolti nello sviluppo a lungo termine indotto dall'iperossia di malattie polmonari frequentemente osservate negli ex neonati prematuri.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare e nessun conflitto di interessi da segnalare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è supportato da finanziamenti della Presbyterian Health Foundation (PHF) e dell'Oklahoma Shared Clinical and Translational Resources (U54GM104938 con un Institutional Development Award (IDeA) da NIGMS) ad AG. Vorremmo ringraziare il Dr. Paul LeRou e il Dr. Xingbin Ai del Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, per aver fornito cellule di donatori neonatali utilizzate in alcuni degli esperimenti. Le figure sono state create con Biorender. L'analisi statistica è stata eseguita con GraphPad Prism.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Formalina tamponata al 10%Fisher Scientific23-426796
1X PBS (soluzione salina tamponata con fosfato), pH 7,4Gibco10010049
A 83-01Tocris29-391-0
Inserti ALI Transwell, 6,5 mmCorning3470
Anticorpo anti-tubulina acetilata, monoclonale di topoSigmaT7451
Anticorpo anti-alfa tubulinaAbcamab7291
Anticorpo anti-citocheratina 5Abcamab53121
BronchiaLife Epithelial Airway Medium (BLEAM)LifeLine Cell TechnologyLL-0023
CHIR 99021Tocris44-231-0
Anticorpo caspasi-3 scissaSegnalazione cellulare9664T
SCGB1A1 o proteina delle cellule club (CC16) umano, anticorpo policlonale di coniglioBioVendor R& DRD181022220-01
CM-H2DCFDA (indicatore generale di stress ossidativo)Thermo ScientificC6827
Corning Colture cellulari Flaconi T25 trattatiCorning430639
Corning Colture cellulari a forma di U Corning Flaconi T75Corning430641U
CyQUANT LDH Saggio di citotossicitàThermo ScientificC20300
DAPI Soluzione (1 mg/mL)Fisher ScientificEN62248
Dimetilsolfossido [DMSO] Hybri-MaxSigmaD2650
Acqua distillataGibco15230162
EVOM Manuale per la misurazione TEERPrecision InstrumentEVM-MT-03-01
FBS (Siero fetale bovino)Gibco10082147
Isotiocianato di fluoresceina destrano (media mol wt 10.000)Fisher ScientificF0918100MG
Isotiocianato di fluoresceina... destrano (peso medio mol 20,00)SigmaFD20-100MG
IgG anti-topo di capra (H+L), annunci umani-HRPSouthern Biotech1031-05
Anticorpo secondario adsorbito incrociato anti-topo di capra, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21141
Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-coniglio di capra (H+L), Alexa Fluor 546InvitrogenA-11035
IgG anti-coniglio di capra (H+L), topolino/umano ads-HRPSouthern Biotech4050-05
HBTEC Interfaccia aria-liquido (ALI) Differenziazione MediaLifeLine Cell TechnologyLM-0050
HEPESLonzaCC-5024
Heracell VIOS 160i Tri-Gas CO2 Incubatore, 165 LThermo Scientific51030411
Kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacitàThermo Scientific4368814
Integratore HLLLifeLine Cell TechnologyLS-1001
ImageJNIHN/A
Invivogen Normocin - Reagente antimicrobicoFisher Scientific
L-GlutamminaLifeLine Cell TechnologyLS-1013
Siero di capra normaleGibco
NormocinInvivogenant-nr-05
p63 anticorpoSanta Cruz Biotechnologysc-25268
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP36930
PureLink RNA Mini KitThermo Scientific12183025
RAPAMYCINThermo ScientificAAJ62473MC
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Scientific4444964
Saggi di espulsione genica Taqman: 18S rRNAThermo ScientificHs99999901_s1
Saggi di espulsione genica Taqman: CATThermo ScientificHs00156308_m1
Saggi di espulsione genica Taqman: FOXJ1Thermo ScientificHs00230964_m1
Saggi di espulsione genica Taqman: GAPDHThermo ScientificHs02786624_g1
Saggi di espulsione genica Taqman: GPX1Thermo ScientificHs00829989_gH
Saggi di espulsione genica Taqman: GPX2Thermo ScientificHs01591589_m1
Saggi di escressione genica Taqman: GPX3Thermo ScientificHs01078668_m1
Saggi di escressione genica Taqman: KRT5Thermo Scientific
Saggi di escressione genica Taqman: MUC5ACSaggi
Saggi di espulsione genica Taqman
Thermo Scientific Unità filtranti monouso sterili a flusso rapido Nalgene con membrana in PES (0,22 μ m pori, 500 ml)Thermo Scientific5660020
TM-1 Integratore combinatoLifeLine Cell TechnologyLS-1055
Anticorpo caspasi-3totale Segnalazione cellulare14220S
Triton X-100Sigma9036-19-5
Tripsina-EDTA (0,05%), Fenolo rossoGibco25300062
Y-27632 2 HClTocrisCodice 12-541-0
World imagej.nih.gov/ij/ NC9273499 PCN5000Hs00361185_m1 di escressione genica Taqman Thermo Scientific Hs01365616_m1: SCGB1A1 Hs00171092_m1 Thermo Scientific: SOD1 Thermo Scientific Hs00533490_m1 Saggi di escressione genica Taqman: SOD2 Thermo Scientific Hs00167309_m1

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