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Articolo metodologico

Valorizzazione dell'alga rossa Gracilaria gracilis attraverso un approccio di bioraffineria

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DOI:

10.3791/65923

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21 novembre 2023

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1MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, ESTM, Polytechnic University of Leiria, 2MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, Department of Life Sciences, University of Coimbra

In questo articolo

Sommario

In questo articolo descriviamo diversi protocolli che mirano ad una valorizzazione integrata della Gracilaria gracilis: la raccolta di specie selvatiche, la crescita interna e l'estrazione di ingredienti bioattivi. Vengono valutati gli effetti antiossidanti, antimicrobici e citotossici degli estratti, insieme alla valutazione nutrizionale e della stabilità degli alimenti arricchiti con biomassa e pigmenti di alghe intere.

Abstract

L'interesse per le alghe marine come materia prima abbondante per ottenere ingredienti bioattivi preziosi e multitarget è in continua crescita. In questo lavoro, esploriamo il potenziale della Gracilaria gracilis, un'alga rossa commestibile coltivata in tutto il mondo per il suo interesse commerciale come fonte di agar e altri ingredienti per applicazioni cosmetiche, farmacologiche, alimentari e mangimistiche.

Le condizioni di crescita di G. gracilis sono state ottimizzate attraverso la propagazione vegetativa e la sporulazione, manipolando le condizioni fisico-chimiche per ottenere un ampio stock di biomassa. Le metodologie di estrazione verde con etanolo e acqua sono state eseguite sulla biomassa delle alghe. Il potenziale bioattivo degli estratti è stato valutato attraverso una serie di saggi in vitro riguardanti la loro citotossicità, le proprietà antiossidanti e antimicrobiche. Inoltre, la biomassa di alghe essiccate è stata incorporata nelle formulazioni della pasta per aumentare il valore nutrizionale degli alimenti. I pigmenti estratti da G. gracilis sono stati anche incorporati nello yogurt come colorante naturale ed è stata valutata la loro stabilità. Entrambi i prodotti sono stati sottoposti all'apprezzamento di un panel sensoriale semi-addestrato con l'obiettivo di ottenere la migliore formulazione finale prima di raggiungere il mercato.

I risultati confermano la versatilità di G. gracilis sia che venga applicato come biomassa intera, estratti e/o pigmenti. Attraverso l'implementazione di diversi protocolli ottimizzati, questo lavoro consente lo sviluppo di prodotti con il potenziale di profitto nei mercati alimentare, cosmetico e dell'acquacoltura, promuovendo la sostenibilità ambientale e un'economia circolare blu.

Inoltre, e in linea con un approccio di bioraffineria, la biomassa residua di alghe marine sarà utilizzata come biostimolante per la crescita delle piante o convertita in materiali di carbonio da utilizzare nella purificazione delle acque dei sistemi di acquacoltura interni del MARE-Politecnico di Leiria, in Portogallo.

Introduzione

Le alghe possono essere considerate un'interessante materia prima naturale da trarre profitto dai settori farmaceutico, alimentare, dei mangimi e ambientale. Biosintetizzano una panoplia di molecole, molte delle quali non presenti negli organismi terrestri, con proprietà biologiche rilevanti 1,2. Tuttavia, è necessario implementare protocolli di coltivazione ottimizzati per le alghe marine per garantire un ampio stock di biomassa.

I metodi di coltivazione devono sempre tenere conto della natura dei talli delle alghe e della morfologia complessiva. Gracilaria gracilis è un taxon clonale, il che significa che l'organo di attacco produce più assi vegetativi. Si ottiene così la propagazione per frammentazione (riproduzione vegetativa), in quanto ciascuno di questi assi è pienamente in grado di adottare una vita indipendente dal tallo principale3. I taxa clonali possono essere integrati con successo con metodologie di coltivazione semplici e veloci in un solo passaggio, poiché grandi quantità di biomassa si ottengono dividendo il tallo in piccoli frammenti che si rigenerano rapidamente e crescono in nuovi individui geneticamente identici. In questo processo possono essere utilizzati sia talli aplontici che diplonti. Sebbene il genere presenti un complesso ciclo vitale trifasico isomorfo aplo-diplontico, la sporulazione è raramente necessaria, tranne quando è necessario il rinnovamento genetico dei ceppi per ottenere raccolti migliori. In questo caso, sia le tetraspore (spore aplontiche formate dalla meiosi) che le carpospore (spore diplontiche formate dalla mitosi) danno origine a talli macroscopici che possono poi essere cresciuti e propagati per riproduzione vegetativa4. I cicli di crescita sono dettati dalle condizioni ambientali e dallo stato fisiologico degli individui, tra gli altri fattori biologici come l'emergere di epifite e l'adesione di altri organismi. Pertanto, l'ottimizzazione delle condizioni di coltivazione è fondamentale per garantire un'elevata produttività e produrre biomassa di buona qualità5.

L'estrazione di composti bioattivi dalle alghe, tra cui G. gracilis, può essere ottenuta attraverso vari metodi 6,7. La scelta del metodo di estrazione dipende dai composti specifici di interesse, dall'applicazione target e dalle caratteristiche dell'alga. In questo studio, ci siamo concentrati sull'estrazione con solvente, che prevede l'utilizzo di solventi verdi, come acqua o etanolo, per sciogliere ed estrarre composti bioattivi dalla biomassa delle alghe. L'estrazione può essere effettuata tramite macerazione in modo versatile ed efficace e può essere utilizzata per una vasta gamma di composti. Si tratta di un metodo semplice e ampiamente utilizzato che prevede l'immersione della biomassa in un solvente per un periodo prolungato, in genere a temperatura ambiente o leggermente elevata. Il solvente viene mescolato per migliorare il processo di estrazione. Dopo il tempo di estrazione desiderato, il solvente viene separato dal materiale solido mediante filtrazione o centrifugazione.

L'acqua è un solvente comunemente usato nelle applicazioni alimentari grazie alla sua sicurezza, disponibilità e compatibilità con un'ampia gamma di prodotti alimentari. L'estrazione dell'acqua è adatta per composti polari come polisaccaridi, peptidi e alcuni fenolici. Tuttavia, potrebbe non estrarre efficacemente composti non polari. L'etanolo è anche un solvente ampiamente utilizzato nelle applicazioni alimentari e può essere efficace per estrarre una varietà di molecole bioattive, inclusi composti fenolici, flavonoidi e alcuni pigmenti. L'etanolo è generalmente riconosciuto come sicuro per l'uso negli alimenti e può essere facilmente evaporato, lasciando dietro di sé i composti estratti. Vale la pena notare che la scelta del metodo di estrazione dovrebbe considerare fattori come l'efficienza, la selettività, l'economicità e l'impatto ambientale. L'ottimizzazione dei parametri di estrazione, come la concentrazione del solvente, il tempo di estrazione, la temperatura e la pressione, è fondamentale per ottenere rese ottimali di composti bioattivi da G. gracilis o da altre alghe.

È stato riscontrato che le alghe mostrano attività antimicrobica contro un'ampia gamma di microrganismi, tra cui batteri, funghi e virus8. Questa attività è attribuita a componenti bioattivi, tra cui fenolici, polisaccaridi, peptidi e acidi grassi. Diversi studi hanno dimostrato la loro efficacia contro agenti patogeni come Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. e Pseudomonas aeruginosa, tra gli altri9. L'attività antimicrobica delle alghe è attribuita alla presenza di composti bioattivi che possono interferire con le pareti cellulari microbiche, le membrane, gli enzimi e le vie di segnalazione10. Questi composti possono interrompere la crescita microbica, inibire la formazione di biofilm e modulare le risposte immunitarie.

Le alghe rosse, note anche come rodofite, sono un gruppo di alghe che possono esibire attività antimicrobica contro una varietà di microrganismi. All'interno di questo gruppo, G. gracilis contiene vari composti bioattivi che possono contribuire alla sua attività antimicrobica segnalata. Mentre le molecole specifiche possono variare, le classi comuni che sono state riportate in G. gracilis e che possono possedere proprietà antimicrobiche sono polisaccaridi, fenolici, terpenoidi e pigmenti11. Tuttavia, è importante notare che la presenza e la quantità di questi componenti possono variare a seconda di fattori come il luogo di raccolta delle alghe, la stagionalità, le condizioni fisiologiche dei talli e le condizioni ambientali. Pertanto, la classe specifica e la concentrazione di composti antimicrobici in G. gracilis possono variare di conseguenza.

È stato anche scoperto che G. gracilis ha proprietà antiossidanti, contenendo vari composti fenolici, che hanno dimostrato di eliminare i radicali liberi e ridurre lo stress ossidativo12.Gli antiossidanti aiutano a proteggere le cellule dai danni causati dalle specie reattive dell'ossigeno e hanno potenziali benefici per la salute. La capacità antiossidante può essere valutata direttamente attraverso diversi metodi, tra cui l'attività di scavenging dei radicali liberi 2,2-difenil-1-picrilidrazile (DPPH) e, indirettamente, attraverso la quantificazione del contenuto polifenolico totale (TPC)13.

Anche se un ingrediente ha una bioattività prominente, la sua valutazione della citotossicità è indispensabile per valutare le sostanze naturali e sintetiche da utilizzare a contatto con cellule o tessuti viventi. Esistono diversi metodi per misurare la citotossicità, ognuno con vantaggi e limiti. Nel complesso, offrono una serie di opzioni per valutare gli effetti nocivi di molte sostanze sulle cellule e, allo stesso tempo, per studiare i meccanismi del danno e della morte cellulare14.

In questo lavoro, utilizziamo il saggio del bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), un metodo colorimetrico introdotto da Mosmann (1983)15. Questo metodo misura la riduzione dei sali di tetrazolio a un prodotto di formazano viola da parte di cellule metabolicamente attive. Maggiore è la quantità di cristalli di formazano, maggiore è il numero di cellule vitali, fornendo così una misura indiretta della citotossicità14. Poiché in questo lavoro l'acqua di G. gracilis e gli estratti di etanolo sono destinati ad essere incorporati in formulazioni dermocosmetiche, la valutazione della citotossicità in vitro viene eseguita in una linea cellulare di cheratinociti (HaCaT).

Per quanto riguarda l'applicazione alimentare, le alghe sono generalmente povere di calorie e nutrizionalmente ricche di fibre alimentari, elementi essenziali e aminoacidi, polisaccaridi, acidi grassi polinsaturi, polifenoli e vitamine 2,16. G. gracilis non fa eccezione, avendo un interessante valore nutrizionale. Freitas et al. (2021)4 hanno scoperto che G. gracilis coltivato aveva livelli più elevati di proteine e vitamina C e manteneva il livello di lipidi totali rispetto alle alghe selvatiche. Questo può rappresentare un vantaggio economico e ambientale, in quanto dal punto di vista nutrizionale la produzione è preferibile allo sfruttamento delle risorse selvatiche. Inoltre, i consumatori sono sempre più preoccupati per il tipo di cibo che mangiano, quindi è importante introdurre nuovi ingredienti per l'arricchimento alimentare e utilizzare nuove risorse per ottenere estratti che possano aggiungere valore a un prodotto e rivendicare una "clean label". Inoltre, il mercato attuale è molto competitivo e richiede lo sviluppo di nuovi prodotti e strategie innovative per differenziare i produttori dai loro concorrenti17.

L'arricchimento di prodotti a basso valore nutrizionale, come la pasta, con risorse marine, tra cui le alghe, è una strategia per introdurre questa risorsa come nuovo alimento e una strategia di differenziazione del mercato attraverso un prodotto con un valore nutrizionale distinto. D'altra parte, G. gracilis è una fonte di pigmenti rossi naturali come le ficobiliproteine18, con un alto potenziale per applicazioni nell'industria alimentare. Quest'alga ha mostrato un grande interesse in diverse aree e la sua applicazione può essere effettuata utilizzando l'alga intera, gli estratti e/o la biomassa rimanente. In questo lavoro, dimostriamo alcuni esempi di tali applicazioni.

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Protocollo

1. Raccolta e preparazione della biomassa

  1. Raccogli gli esemplari di G. gracilis durante la bassa marea e trasportali rapidamente in laboratorio in scatole buie e refrigerate per evitare l'essiccazione, la luce e l'esposizione all'aria.
  2. In laboratorio, lavare ogni tallo con acqua di mare corrente e pulire accuratamente per rimuovere detriti, parti necrotiche, epifite e altri organismi dalla superficie.
  3. Mantenere la biomassa selvatica in acqua di mare costantemente aerata (31-35 psu) in una stanza climatica (20 ± 1 °C) con basso irraggiamento fornito da luce diurna, bianco freddo e lampade fluorescenti e fotoperiodo impostato alle 16:08 (chiaro: scuro) per 7 giorni. Durante questo periodo, non fornire alcun mezzo nutritivo; Ciò consente alle alghe di adattarsi lentamente alle nuove condizioni interne.

2. Manutenzione delle scorte

  1. Dopo il periodo di acclimatazione, tagliare le punte sane dei talli di alghe con una lama sterile. Seguendo Redmond et al. (2014)19 e in condizioni sterili, trascinare ogni punta attraverso un gel di agar precedentemente preparato in piastre di Petri (1,0% agar batteriologico, in rapporto 1:1 acqua distillata/acqua di mare) per rimuovere eventuali contaminanti rimanenti. Eseguire il trascinamento dell'agar tre volte per ogni punta e trascinare sempre la punta attraverso le porzioni inutilizzate del gel di agar.
  2. Lavare con acido la vetreria in una soluzione di acido cloridrico (HCl, 15%) e risciacquare accuratamente con acqua distillata. Sterilizzare tutti gli strumenti, la vetreria, l'agar, l'acqua di mare e l'acqua distillata utilizzati nel processo di pulizia in autoclave (121 °C, 15 min).
    ATTENZIONE: Vedere la scheda di sicurezza dell'HCl fornita dal fornitore.
  3. Le punte crescono in acqua di mare sterilizzata a 35 psu, integrata con soluzione arricchita di Von Stosch (VSE) modificata per le alghe rosse, secondo Redmond et al. (2014)19. Aggiungere biossido di germanio (GeO2 ) al terreno (1 mL/L) per prevenire la crescita di diatomee epifite.
    ATTENZIONE: Vedere la scheda di sicurezza di GeO2 fornita dal fornitore.
    NOTA: Le punte che mostrano perdita di pigmentazione, come osservato da uno scolorimento parziale o totale, sono sotto stress o sono già morte e dovrebbero essere scartate.

3. Coltivazione e scale-up

  1. Dopo il periodo di acclimatazione, distribuire in modo casuale circa 8-10 puntali sani in palloni a fondo piatto da 250 mL in una camera climatica impostata a 20 ± 1 °C con la luce fredda bianca di 20 ± 0,5 μmol di fotoni m-2 s-1 (1500 lux), un fotoperiodo impostato a 16 h: 8 h (chiaro: scuro) e acqua di mare sterile arricchita con terreni di coltura VSE rinnovati ogni settimana.
  2. Eseguire misurazioni settimanali del peso, evitando di sforzare eccessivamente i talli20. Per questo, rimuovere con cura le punte dal terreno di coltura, sciacquare delicatamente e pesare i milligrammi su una bilancia da laboratorio.
    NOTA: Questa procedura può essere eseguita insieme al rinnovo settimanale del terreno di coltura.
  3. I talli possono crescere in questi palloni fino a una densità di 2 g/L. A questo punto, eseguire uno scale-up del destinatario (250 mL, 1 L e 5 L). Trasferite la coltivazione in contenitori bianchi aperti all'aperto da 50 L e più grandi quando il volume raggiunge i 5 L.
  4. Calcolare il tasso di crescita relativo (RGR) secondo Patarra et al. (2017)21 :
    RGR (% fw/giorno) = ([Ln (fw) - Ln (iw)]/t) x 100
    dove iw e fw sono rispettivamente il peso fresco iniziale e finale, espressi in grammi, e t è il tempo in giorni.
    NOTA: In questa configurazione di laboratorio, l'RGR raggiunge valori fino al 21% al giorno. La raccolta della biomassa può essere effettuata in qualsiasi momento. La biomassa deve essere lavorata rapidamente per evitare la degradazione mediante essiccazione in forno, liofilizzazione o semplicemente congelata (-20 °C), a seconda dell'uso previsto. La biomassa essiccata può essere conservata a temperatura ambiente (RT) o conservata anche congelata.

4. Procedura di estrazione

NOTA: Per valutare la citotossicità, le proprietà antiossidanti e antimicrobiche in vitro degli estratti di G. gracils , la sua preparazione considera due diversi parametri: la temperatura di estrazione e il tipo di solvente.

  1. Per effettuare le estrazioni, essiccare in forno la biomassa di G. gracilis e macinare la biomassa (ad esempio, in un macinacaffè domestico) fino a quando la polvere non passa attraverso un setaccio da 200 μm.
  2. Pesare la biomassa essiccata (10 g) e scioglierla in 100 mL di solvente (etanolo assoluto o acqua sterile).
  3. Mescolare in un recipiente al riparo dalla luce per 30 min.
  4. Eseguire estrazioni sequenziali di etanolo > acqua e acqua > etanolo a RT, 40 °C e 70 °C.
  5. Per ogni temperatura, eseguire le estrazioni con etanolo e acqua separatamente due volte.
  6. Separare gli estratti liquidi dalla biomassa rimanente mediante filtrazione attraverso carta da filtro (Whatman No.1), seguita da centrifugazione a 8000 x g per 10 min a RT.
  7. Riutilizzare la biomassa algale rimanente per un'ulteriore estrazione con l'altro solvente. Se un campione è stato estratto prima con etanolo, estrarlo successivamente con acqua e viceversa.
  8. Liofilizzare gli estratti acquosi ed evaporare gli estratti di etanolo in un evaporatore rotante a 40 °C.
  9. Conservare gli estratti secchi a 4 °C.
  10. Sciogliere gli estratti a una concentrazione di 50 mg/mL (saggi antimicrobici) o 10 mg/mL (saggi antiossidanti). Sciogliere gli estratti acquosi in acqua sterile e gli estratti etanolici in etanolo assoluto.

5. Attività antimicrobica

NOTA: Gli estratti etanolici e acquosi devono essere testati singolarmente contro Bacillus subtilis subsp . spizizenii (DSM 347), Escherichia coli (DSM 5922) e Listonella anguillarum (DSM 21597). I test antimicrobici devono essere eseguiti secondo le raccomandazioni del National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2012)22. Tutte le colture sono state ottenute dalla Collezione tedesca di microrganismi e colture cellulari (DSMZ). L. anguillarum è stato coltivato su brodo di soia triptico (TSB) o agar di soia triptico (TSA) integrato con cloruro di sodio (NaCl) all'1%. I restanti due ceppi sono stati coltivati su terreno LB (VWR Chemicals). Le colture di Bacillus subtilis subsp . spizizenii (DSM 347) e Listonella anguillarum (DSM 21597) sono state incubate a 30 °C, mentre Escherichia coli (DSM 5922) è stata incubata a 37 °C, secondo le istruzioni del fornitore. Il metodo di microdiluizione del brodo può essere utilizzato per la determinazione dell'attività antimicrobica in un mezzo liquido, e questo dovrebbe essere effettuato su microscala, consentendo di determinare il potenziale antimicrobico in modo rapido ed efficiente. Questo metodo a basso costo permette di ottenere risultati in sole 24 h, risultando quindi adatto a determinare, in una fase precoce, le migliori condizioni di estrazione che permettono, per un determinato ceppo microbico, di ottenere risultati in termini di azione inibitoria della crescita. Tuttavia, la metodologia richiede l'uso di micropiastre sterili con un coperchio specifico per la crescita microbica, nonché la disponibilità di un lettore di micropiastre per la lunghezza d'onda di 600 nm.

  1. Eseguire i test di microdiluizione del brodo utilizzando micropiastre a 96 pozzetti non trattate e a fondo tondo con 170 μL di Brodo Muller-Hinton (MHB), inoculati con 10 μL di inoculo standardizzato (a 0,5 standard McFarland) e 20 μL di ciascun estratto (50 mg/mL).
  2. Incubare le piastre per 24 ore alla temperatura ottimale per ogni ceppo.
  3. Rilevare l'attività antimicrobica mediante la riduzione della torbidità visibile misurata registrando la densità ottica (OD 600) in uno spettrofotometro per micropiastre, a 0 h e 24 h.
  4. Esprimere i risultati in percentuale di inibizione:
    figure-protocol-1
    dove Abs. ext è la differenza nell'assorbanza misurata, tra 0 h e 24 h, nei pozzetti che contengono ceppi batterici che crescono in presenza dell'estratto, e Abs si riferisce alla stessa misura nei pozzetti che contengono il ceppo batterico e il solvente.
  5. In questo metodo, includere reazioni di controllo, con pozzetti contenenti solo terreno di coltura che sarà il controllo negativo, ma anche pozzetti con terreno inoculato con il ceppo standard aggiunto al solvente (etanolo o acqua) e terreno con il ceppo batterico e l'antibiotico di controllo positivo (cloramfenicolo).

6. Attività antiossidante e quantificazione dei polifenoli totali

  1. Contenuto polifenolico totale
    NOTA: Il contenuto polifenolico totale (TPC) viene effettuato con il metodo Folin-Ciocalteu23 e adattato alla microscala.
    1. Aggiungere a ciascun pozzetto di una micropiastra a 96 pozzetti, protetta dalla luce, 158 μL di acqua ultrapura, 2 μL del campione e 10 μL di reagente Folin-Ciocalteu.
      ATTENZIONE: Vedere la scheda di sicurezza del reagente Folin-Ciocalteu fornito dal fornitore.
    2. Dopo 2 minuti, aggiungere 30 μL di Na2CO3 (20%).
    3. Dopo l'incubazione al buio a RT per 1 ora, misurare i campioni spettrofotometricamente a 755 nm.
    4. Utilizzare l'acido gallico (che consente di tracciare la curva di calibrazione) o l'acqua ultrapura (2 μL) come controlli.
    5. Esprimere i risultati come equivalenti di acido gallico (mg di estratto GAE/g).
  2. Attività di scavenging dei radicali 2,2 difenil-1-picrilidrazile (DPPH)
    NOTA: L'attività antiossidante degli estratti è valutata come descritto da Duan et al. (2006)24, adattata alla microscala
    1. In una micropiastra a 96 pozzetti protetta dalla luce, posizionare 2 μL di ciascun campione (a una concentrazione di 10 mg/mL) e 198 μL di DPPH disciolto in etanolo assoluto (0,1 mM).
      ATTENZIONE: Vedere la scheda di sicurezza del DPPH fornita dal fornitore.
    2. Eseguire la reazione per 30 minuti a RT al buio. Misurare l'assorbanza a 517 nm in uno spettrofotometro per micropiastre.
    3. Eseguire una reazione di controllo con 2 μL di etanolo assoluto/acqua distillata e 198 μL di soluzione DPPH. Eseguire una misurazione in bianco con 2 μL di estratto e 198 μL di etanolo assoluto.
    4. Esprimere i risultati come percentuale di inibizione del DPPH utilizzando la seguente equazione:
      figure-protocol-2
      dove As è l'assorbanza dell'estratto algale, Ab è l'assorbanza dei campioni bianchi e Ac è l'assorbanza del controllo.

7. Valutazione della citotossicità nelle cellule epidermiche

NOTA: L'effetto citotossico in vitro degli estratti acquosi ed etanolici di G. gracilis è valutato nei cheratinociti umani (cellule HaCaT - 300493) attraverso il test colorimetrico MTT come descrittoin precedenza 25. Le cellule sono state acquisite da Cell Lines Services, Germania (CLS) e il metodo è stato eseguito in conformità con le linee guida istituzionali e le istruzioni CLS.
ATTENZIONE: Vedere la scheda di sicurezza di MTT fornita dal fornitore)

  1. Mantenimento delle colture cellulari
    1. Colture di cellule HaCaT nel terreno ad alto contenuto di glucosio (DMEM) di Dulbecco Modified Eagle integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di soluzione antibiotica/antimicotica (amfotericina B, 0,25 mM; penicillina, 60 mM; streptomicina, 100 mM).
    2. Usa la tripsina-EDTA per dissociare le cellule.
      NOTA: La sottocoltura delle cellule HaCaT viene eseguita dopo che le cellule hanno raggiunto la confluenza totale.
    3. Coltivare le cellule in una camera a 37 °C con il 5% di CO2 e il 95% di umidità.
    4. Subcoltura delle cellule secondo le istruzioni della biobanca ogni volta che le colture raggiungono l'80%-85% di confluenza.
  2. Valutazione della citotossicità
    1. Dopo aver seminato le cellule in piastre da 96 pozzetti e l'incubazione per una notte, trattare le cellule HaCaT (4 x 104 cellule/pozzetto) con gli estratti secchi precedentemente disciolti in DMSO (100 mg/mL). Quindi, aggiungere 2 μL della soluzione di estratto a 198 μL di terreno e incubare le piastre per 24 ore.
    2. Rimuovere il terreno di coltura e aggiungere 100 μL di MTT (0,5 mg/mL) alle cellule. Incubare le cellule per 30 minuti al buio nelle normali condizioni di coltura sopra menzionate.
    3. Rimuovere la soluzione di MTT e solubilizzare i cristalli intracellulari di formazano con 100 μL di DMSO.
    4. Misurare l'assorbanza a 570 nm utilizzando un lettore per micropiastre. Esprimere i risultati come percentuale di cellule di controllo non trattate.

8. Innovazione alimentare

  1. Nuovo prodotto alimentare: Pasta alle alghe
    1. Selezione degli ingredienti e formulazione della pasta
      NOTA: La selezione degli ingredienti è stata effettuata in collaborazione con un'azienda di pasta. La scelta degli ingredienti chiave (descritti al paragrafo 8.2) è stata fatta considerando la loro facile accessibilità e compatibilità con le linee di produzione esistenti, utilizzando le risorse marine per ottenere pasta con valore nutrizionale aggiunto.
      1. Dopo la scelta degli ingredienti, progettare la formulazione seguendo il valore nutrizionale previsto (fonte di fibre, vitamine ed elementi minerali, basso contenuto di grassi saturi) analizzando la composizione chimica teorica delle formulazioni utilizzando un foglio di calcolo.
      2. Una volta soddisfatti i requisiti teorici, procedere con la produzione su scala di laboratorio come descritto al punto 8.1.2.
      3. Eseguire un test sensoriale con un panel semi-addestrato (>10 assaggiatori) per convalidare la necessità di riformulazione o l'accettazione della formulazione per le fasi successive.
        NOTA: Il panel è stato precedentemente addestrato per l'assaggio della pasta e ha valutato edonicamente le formulazioni presentate per quanto riguarda attributi come sapore, gusto, odore, consistenza e aspetto.
    2. Produzione di pasta
      NOTA: Produrre campioni di pasta Chifferi utilizzando un estrusore per pasta.
      1. Nell'apparecchiatura, mescolare porzioni precedentemente definite di farina di riso, G. gracilis e Chlorella vulgaris e aggiungere circa il 30% di acqua alla miscela.
      2. Per ottenere pasta secca, essiccare Chifferi a 68 °C per 42 min, seguiti da 5 h, 30 min a 76 °C, simulando un processo industriale.
      3. Infine, confezionare e sigillare sottovuoto i campioni e conservarli in un luogo buio a RT fino a ulteriori analisi.
    3. Analisi nutrizionale
      NOTA: Per l'analisi del profilo nutrizionale, utilizzare campioni essiccati e macerati in triplice copia.
      1. Contenuto di proteine grezze: eseguire il dosaggio delle proteine totali attraverso il metodo Kjeldahl , adattato da Duarte et al. (2022)26, seguendo i passaggi 8.1.3.2-8.1.3.6.
      2. Pesare accuratamente 1,0 g di campione (o acqua distillata per il saggio in bianco) e miscelare con due compresse di Kjeldahl e 25 mL di H2SO4 in provette per digestione.
        ATTENZIONE: Vedere la scheda di sicurezza di H2SO4 fornita dal fornitore.
      3. Eseguire la digestione dei campioni in un digestore Kjeldahl a 220 °C per 30 minuti, seguiti da 90 minuti a 400 °C.
      4. Dopo il raffreddamento a RT, aggiungere 80 mL di acqua distillata e distillare l'ammoniaca formata in 30 mL di una soluzione al 4%H 3 BO3 contenente verde bromocresolo e rosso metile. Questa fase avviene in condizioni alcaline (distillazione con il 40% di NaOH utilizzando un distillatore Kjeldahl.
        ATTENZIONE: Vedere la scheda di sicurezza della soluzione H 3BO3 contenente verde bromocresolo, rosso metile e NaOH al 40% fornita dal fornitore.
      5. Titolare i campioni distillati con HCl 0,1 M fino a quando non si osserva un cambiamento di colore in un rosa grigiastro.
      6. Calcolare il contenuto di proteina grezza, rappresentato dal contenuto di azoto del campione, ed esprimerlo in g per 100 g utilizzando la seguente equazione:
        figure-protocol-3
        dove Vs corrisponde al volume di HCl (mL) utilizzato nella titolazione del campione; Vb corrisponde al volume utilizzato nel bianco; N corrisponde alla normalità dell'HCl; w corrisponde al peso del campione (g).
      7. Contenuto totale di grassi: determinare il contenuto totale di grassi utilizzando il metodo di Folch, adattato da Folch et al. (1957)27, seguendo i passaggi 8.1.3.8-8.1.3.14.
      8. Preparare il reagente di Folch mescolando CHCl3 e MeOH in proporzione di 2:1 (v:v).
        ATTENZIONE: Vedere la scheda di sicurezza del reagente di Folch fornito dal fornitore.
      9. Alle provette contenenti aliquote di 1 g di campioni, aggiungere 5 mL di reagente di Folch e 0,8 mL di acqua distillata. Mescolare in un vortice per 1 min.
      10. Quindi, aggiungere altri 5 mL di reagente Folch e omogeneizzare per 5 min. Aggiungere 1,2 mL di soluzione di NaCl allo 0,8% e omogeneizzare per 2 min.
      11. Centrifugare i campioni a 7000 x g per 10 min. Filtrare la fase organica (fase inferiore) attraverso cotone idrofilo e solfato di sodio anidro in un pallone di vetro a fondo tondo.
      12. Per evitare la perdita di campione, ripetere le fasi di aggiunta di 5 mL di CHCl3, omogeneizzazione, centrifugazione e filtrazione nelle stesse condizioni.
      13. Rimuovere il solvente organico dalle fasi organiche raccolte mediante evaporazione a bassa pressione e lasciare in forno a 105 °C per 4 h. Raffreddare i campioni in un essiccatore.
      14. Calcolare il contenuto di grassi, espresso in g per 100 g, utilizzando la seguente equazione:
        figure-protocol-4
        dove W1 è il peso vuoto del pallone di vetro a fondo tondo; W2 è il peso iniziale del campione; W3 è il pallone di vetro a fondo tondo con il peso del campione.
      15. Contenuto di fibra grezza: determinare il contenuto di fibra grezza utilizzando una metodologia adattata dalla norma ISO 6865 (2000)28, seguendo le fasi 8.1.3.16-8.1.3.22.
      16. Pesare 1 g del campione (W0) in un crogiolo di vetro con fondo filtrante (riferimento P2) e inserirlo nell'analizzatore di fibre.
      17. Il primo passo è l'idrolisi acida: aggiungere 150 mL di H 2 SO4 all'1,25%, preriscaldato, e2mL di agente antischiuma (n-ottanolo) alla colonna di ciascun crogiolo; Scaldare fino a ebollizione e conservare per 30 min.
      18. Dopo aver rimosso questo solvente, lavare tre volte con acqua deionizzata per procedere all'idrolisi basica. Aggiungere 150 mL di NaOH all'1,25%, preriscaldato, e 5 mL di agente antischiuma alla colonna priva di liquidi ed eseguire la stessa procedura di riscaldamento dell'idrolisi acida.
      19. Infine, effettuare un triplo lavaggio con 150 mL di acetone per l'estrazione a freddo.
      20. Dopo questo processo, rimuovere con cura i crogioli dal sistema e metterli in forno a 150 °C per 1 h. Registrare il peso finale (W1).
      21. Porre i crogioli in un forno a muffola a 500 °C per 3 ore e poi registrare il peso finale (W2).
      22. Calcolare il contenuto di fibra grezza ed esprimere i risultati in percentuali utilizzando la seguente equazione:
        % fibra grezza = 100 x (W1-W2)/W0
      23. Profilo degli acidi grassi (FA): determinare il profilo degli acidi grassi secondo Fernández et al.(2015)29, seguendo i passaggi 8.1.3.24-8.1.3.29.
        NOTA: Gli esteri metilici degli acidi grassi (FAME) sono ottenuti mediante transmetilazione diretta catalizzata da acido dei campioni liofilizzati macinati. Tutte le analisi sono fatte in triplice copia.
      24. Aggiungere 2 mL di una soluzione di H 2 SO4 al 2% (v/v) in metanolo a un campione da 50 mg e versare la miscela a 80 °C per2ore agitando continuamente.
        ATTENZIONE: Vedere la scheda di sicurezza del metanolo fornita dal fornitore.
      25. Dopo il raffreddamento a RT, aggiungere 1 mL di acqua ultrapura e 2 mL di n-eptano a ciascun campione, vorticare la miscela per 1 minuto e centrifugarla per 5 minuti.
        ATTENZIONE: Vedere la scheda di sicurezza dell'n-eptano fornita dal fornitore.
      26. Recuperare la fase superiore di n-eptano (organica) contenente i FAME e trasferirla in fiale di gascromatografia (GC).
      27. Eseguire l'analisi in un gascromatografo dotato di una colonna capillare TR-FAME (60 m × 0,25 mm ID, 0,25 μm di spessore del film), un autocampionatore e un rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID).
      28. Impostare l'iniettore (modalità splitless) a 250 °C e il rilevatore a 280 °C. Impostare la temperatura iniziale della colonna a 75 °C e mantenerla per 1 min. Quindi aumentare a 5 °C/min a 170 °C e tenere premuto per 10 min. Quindi aumentare a 5 °C/min a 190 °C e mantenere la temperatura per altri 10 min. Infine, portare a 2 °C/min a 240 °C e tenere premuto per 10 min. Utilizzare l'elio come gas di trasporto a una portata di 1,5 mL/min. Aria di alimentazione e idrogeno a portate rispettivamente di 350 e 35 mL/min.
      29. Determinare il profilo FA confrontando i tempi di ritenzione risultanti con uno standard ed esprimere i risultati come percentuale di grasso totale.
      30. Profilo degli elementi minerali: Determinare gli elementi minerali (Ca, P, Mg, Na, K, Fe, Cu, Mn, Zn) analizzati da ICP-OES, seguendo il metodo adattato da Pinto et al. (2022)30, seguendo i passaggi 8.1.3.31-8.1.3.34.
      31. Pesare accuratamente circa 0,4 g di ciascun campione secco e aggiungere 7,5 mL di HNO3 e 2,5 mL di HCl.
        ATTENZIONE: Vedere la scheda di sicurezza di HNO3 e HCl fornita dal fornitore.
      32. La digestione segue un processo in due fasi: aumentare la temperatura da RT a 90 °C in 30 minuti (e mantenere altri 30 minuti a questa temperatura) seguita da 60 minuti a 105 °C.
      33. Raffreddare le soluzioni campione, diluirle a 25 mL, filtrarle e conservarle in provette etichettate. In ogni digestione, eseguire lo stesso processo con un materiale di riferimento e un bianco. Ottenere la concentrazione dei diversi elementi mediante ICP-OES.
      34. Esprimere i risultati in mg per 100 g di fw.
      35. Contenuto di carboidrati: Calcolare il contenuto di carboidrati seguendo i passaggi 8.1.3.36-8.1.3.37.
      36. Calcolare il contenuto di carboidrati disponibili (fibre escluse) dalla differenza dei fattori precedentemente determinati per 100 g, utilizzando la seguente equazione, secondo l'Organizzazione delle Nazioni Unite per l'alimentazione e l'agricoltura (FAO; 2003)31
        figure-protocol-5
      37. Esprimere i risultati in g per 100 g.
      38. Contenuto di umidità e ceneri: Stimare il contenuto di umidità e ceneri seguendo i passaggi 8.1.3.39-8.1.3.45.
      39. Incubare i crogioli di porcellana per 3 ore a 105 °C, raffreddarli in un essiccatore e pesarli.
      40. Pesare 10 g del campione nel crogiolo e metterlo in un forno di essiccazione a 105 °C per cicli di 3 ore fino a quando i valori delle pesate successive non differiscono di oltre 10 mg.
      41. Calcolare il contenuto di umidità, espresso in g per 100 g di fw, utilizzando la seguente equazione:
        figure-protocol-6
        dove W1 è il peso del crogiolo vuoto, W2 è il peso del crogiolo con il campione fresco e W3 è il peso del crogiolo con il campione essiccato.
      42. Dopo il dosaggio del contenuto di umidità, porre i crogioli con i campioni essiccati in un inceneritore a 525 °Cper 4 ore.
      43. Ripetere questa procedura fino a quando le pesate successive non differiscono di più di 1 mg.
      44. Raffreddare i campioni in RT in un essiccatore e poi pesarli.
      45. Calcolare il contenuto di ceneri, espresso in g per 100 g di fw, utilizzando la seguente equazione:
        figure-protocol-7
        dove W1 è il peso del crogiolo vuoto, W2 è il peso del crogiolo con campione fresco, W3 è il peso del crogiolo con peso.
      46. Valore energetico: Calcolare il valore energetico seguendo i passaggi 8.1.3.47-8.1.3.48.
      47. Calcolare il valore energetico dei campioni secondo il regolamento UE:La fornitura di informazioni sugli alimenti ai consumatori (Regolamento 1169/2011)32, utilizzando le equazioni:
        Energia (kcal/ 100 g) = 4 x (g di proteine) + 4 x (g di carboidrati) + 9 x (g di grassi) + 2 x (g di fibre)
        Energia (kJ/ 100 g) = 17 x (g di proteine) + 17 x (g di carboidrati) + 37 x (g di grassi) + 8 x (g di fibre)
      48. Esprimere i risultati in chilocalorie per 100 g e kilojoule per 100 g.
    4. Accettazione da parte dei consumatori
      1. Valutare l'accettazione da parte dei consumatori utilizzando campioni di pasta cotti in acqua distillata per 8 minuti.
      2. Eseguire il test di accettazione da parte dei consumatori: valutare l'aspetto visivo, il colore, la consistenza, l'odore, il sapore del mare, il gusto generale, la valutazione complessiva e l'intenzione di acquisto dei campioni.
        NOTA: Il test di accettazione da parte dei consumatori si basa su test edonistici che valutano l'aspetto visivo, il colore, la consistenza, l'odore, il sapore del mare, il gusto generale, la valutazione complessiva e l'intenzione di acquisto su una scala da 1 a 9, dove 1 è una valutazione scarsa e 9 è una valutazione molto buona.
      3. Eseguire test sensoriali in cabine sensoriali individuali in un laboratorio di analisi sensoriale (con controllo della temperatura e dell'illuminazione). Fornisci posate, tovaglioli e tazze di vetro di acqua minerale per pulire il palato tra un campione e l'altro.
        NOTA: Gli assaggiatori hanno un'età compresa tra i 16 e i 64 anni e provengono da tutti i contesti (n > 80).
  2. Yogurt
    1. Estrazione del pigmento
      NOTA: Eseguire l'estrazione del pigmento attraverso la metodologia descritta in Pereira et al. (2020)18.
      1. Preparare il solvente di estrazione, tampone fosfato di sodio a 0,1 M, con fosfato di sodio bibasico (0,03 M) e fosfato di sodio monobasico (0,07 M). Impostare il pH a pH 6,8 utilizzando NaOH o HCl.
      2. Pesare 1 g di G. gracilis e aggiungere 50 mL di tampone fosfato di sodio (pH 6,8). Omogeneizzare per 10 min, a cui seguono 10 min di macerazione con mortaio e pestello.
      3. Trasferire la soluzione in una provetta e centrifugare per 20 minuti a 12.298 x g (4 °C).
      4. Mettere in comune il surnatante e aggiungere lentamente il 65% di solfato di ammonio. Quando tutto il solfato di ammonio è sciolto, coprire la soluzione con un foglio di alluminio e lasciarla precipitare a 4 °C per una notte.
        ATTENZIONE: Vedere la scheda di sicurezza del solfato di ammonio fornita dal fornitore.
      5. Centrifugare il precipitato per 20 minuti a 12.298 x g (4 °C). Recuperare il pellet e scioglierlo in acqua distillata (circa 5 mL).
      6. Eseguire la dialisi dell'estratto utilizzando una membrana tubolare (14 kDa) contro l'acqua per 24 ore, seguita da liofilizzazione. Conservare l'estratto liofilizzato al riparo dalla luce a 4 °C fino al momento dell'utilizzo.
    2. Preparazione dello yogurt
      1. Preparare lo yogurt naturale mescolando 1 L di latte pastorizzato, 120 g di yogurt naturale, 20 g di zucchero e 50 g di latte in polvere in un termomixer per 5 min, 50 °C, velocità 3.
      2. Mettere il composto nel vaso del termomixer in un'incubatrice a 37 °C per 12 h.
      3. Incorporare l'estratto mescolandolo allo yogurt ad una concentrazione dello 0,21%. Conservare i campioni in matracci di vetro individuali a 4 °C fino all'analisi.
      4. Conservare le singole porzioni di yogurt senza pigmento (controllo) a 4 °C fino all'analisi.
    3. Stabilità del colore
      NOTA: Valutare la stabilità del pigmento negli yogurt attraverso l'analisi del colore per 12 giorni. Eseguire l'analisi del colore utilizzando un colorimetro a riflettanza, utilizzando un osservatore standard a 2 gradi e un illuminante D65. I risultati sono presentati come coordinate CIELab con i parametri L (luminosità, nero - bianco, 0 - 100), a* (verde - rosso, -60 - 60) e b* (blu - giallo, -60 - 60). Il parametro a* ha valori positivi per i colori rossastri e valori negativi per i colori verdastri. Il parametro b* accetta valori positivi per i colori giallastri e valori negativi per i colori bluastri. L* è il parametro di luminosità, che è la proprietà secondo la quale ogni colore può essere considerato equivalente a un membro della scala di grigi tra il bianco e il nero33.
      1. Calibrare il colorimetro utilizzando una piastra in ceramica bianca (L* 88.5, a* 0.32, b* 0.33) fornita dal produttore.
      2. Riempire una cella con circa 28 g di campione (o controllo) e analizzare il colore utilizzando un software di analisi dei dati cromatici.
        NOTA: Il software utilizzato per l'analisi dei dati cromatici è stato SpectraMagic NX.
      3. Eseguire le letture 5 volte in triplicati campioni/controlli.
    4. Analisi sensoriale
      NOTA: Eseguire la valutazione sensoriale degli yogurt con incorporazione di pigmenti utilizzando un test triangolare (ISO 4120, 2004)34 e una valutazione edonica del colore, del gusto e dell'apprezzamento generale.
      1. Per il test del triangolo, dai ai relatori tre campioni (un campione di yogurt con pigmento e due campioni di controllo, o due campioni di yogurt con pigmento e un controllo) e chiedi loro di scegliere un campione diverso in base all'aroma, alla consistenza e al gusto. Fornire campioni in volumi simili identificati con codici casuali a 3 numeri.
      2. Per la valutazione edonica dello yogurt con pigmento, date ai relatori un campione di yogurt con pigmento e chiedete loro di valutare il colore, il gusto e l'apprezzamento generale utilizzando una scala edonica a 9 punti (da estremamente antipatia a estremamente simile).

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Risultati

Attività antimicrobica

Nell'interpretare i risultati ottenuti, occorre tenere presente che maggiore è la percentuale di inibizione, maggiore è l'efficacia dell'estratto nell'inibire la crescita di quello specifico ceppo e, di conseguenza, più l'estratto è interessante come antimicrobico. Attraverso questa metodologia, possiamo individuare rapidamente quali estratti hanno maggiore attività su determinati ceppi ba...

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Discussione

I test di attività antimicrobica in un mezzo liquido sono utilizzati per valutare l'efficacia delle sostanze antimicrobiche contro i microrganismi sospesi in un mezzo liquido e vengono solitamente eseguiti per determinare la capacità di una sostanza di inibire la crescita o uccidere i microrganismi35,36,37,38. Sono utilizzati per valutare la sensibilità dei microrganismi agli agenti antimicrobi...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Portoghese per la Scienza e la Tecnologia (FCT) attraverso i Progetti Strategici concessi al MARE-Centro di Scienze Marine e Ambientali (UIDP/04292/2020 e UIDB/04292/2020) e al Laboratorio Associato ARNET (LA/P/0069/2020). FCT ha inoltre finanziato le borse di dottorato individuali assegnate a Marta V. Freitas (UI/BD/150957/2021) e Tatiana Pereira (2021. 07791. BD). Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente anche dal progetto HP4A - PASTA SANA PER TUTTI (co-promozione n. 039952), cofinanziato dal FESR - Fondo Europeo di Sviluppo Regionale, nell'ambito del Programma Portogallo 2020, attraverso COMPETE 2020 - Programma Operativo Competitività e Internazionalizzazione.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Etanolo assolutoAga, Portogallo64-17-5
Cloruro di ammonioPanReac12125-02-9
Amfotericina BSigma-Aldrich1397-89-3
Bilancia analiticaSartorius, TE124S22105307
Bacillus subtilis subsp. spizizeniiCollezione tedesca di microrganismi e Colture cellulari (DSMZ)DSM 347
Biotina Panreac AppliChem58-85-5
CentrifugaEppendorf, 5810R5811JH490481
CloramfenicoloPanReac56-75-7
CO2 CameraMemmertN/A
Lampade fluorescenti bianche freddeOSRAM Lumilux SkywhiteN/A
Densitometro McFarlandGrant InstrumentsN/A
DMEM mediumSigma-AldrichD5796
DMSOSigma-Aldrich67-68-5
DPPHSigma, Steinheim, Germania1898-66-4
Escherichia coli (DSM 5922)Collezione tedesca di microrganismi e colture cellulari (DSMZ)
Etanolo 96%AGA-Portugal64-17-5
Acido etilendiamminotetraacetico Sale disodico diidrato (Na2EDTA)J.T.Baker6381-92-6
Siero fetale bovino (FBS)Sigma-AldrichF7524
Carta da filtro (Whatman No.1)WhatmanWHA1001320
FlaconiVWR International, Alcabideche, Portogallo N/A
Folin-CiocalteuVWR Chemicals31360.264
Acido gallico Merck149-91-7
Germanio (IV) Oxide, 99,999%AlfaAesar1310-53-8
Cellule HaCaT - 300493CLS-Cell Lines Services, Germania
Agitatore magnetico a piastra caldaIKA, C-MAG HS706.090564
Solfato di ferroVWR Chemicals10124-49-9
Cappa a flusso laminareTelStar, Portogallo526013
LB Medium VWR ChemicalsJ106
Listonella anguillarumCollezione tedesca di microrganismi e colture cellulari (DSMZ)  DSM 21597
Cloruro di manganeseVWR Chemicals7773.01.5
Micropipette Eppendorf, PortogalloN/A
MicroplatesVWR International, Alcabideche, Portogallo10861-666
MicropiastreGreiner738-0168
Micropiastre (sterili)Fisher Scientific10022403
Lettore di micropiastre  Spettrofotometro per micropiastre Epoch, BioTek, Vermont, USA1611151E
MTTSigma-Aldrich289-93-1
Brodo Muller-Hinton (MHB)VWR Chemicals90004-658
Legante per forno, FD11512-04490
Legante per forno, BD11504-62615
PenicillinaSigma-Aldrich1406-05-9
pHmetro Inolab VWR International, Alcabideche, Portogallo
punte PippeteEppendorf, Portogallo5412307
Pyrex Bottles Media Storage  VWR International, Alcabideche, Portogallo16157-169
Evaporatore rotanteHeidolph, Laborota 400080409287
RotavaporIKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portogallo07.524254
Carbonato di sodio (Na2CO3)Chem-Lab497-19-8
Cloruro di sodio (NaCl) Normax Chem7647-14-5
Fosfato di sodio bibasicoRiedel-de Haë n7558-79-4
SpectraMagic NXKonica Minolta, Giapponesoftware di analisi dei dati del colore
SpectrophotometerEvolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA5A4T092004
StreptomicinaSigma-Aldrich57-92-1
TiaminaPanreac AppliChem59-43-8
Tripsina-EDTASigma-AldrichT4049
Agar di soia triptico (TSA)VWR ChemicalsICNA091010617
Brodo di soia trittico (TSB) VWR Chemicals22091
Acqua ultrapura Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, GermaniaF5HA17360B
Pompa a vuotoBuchi, SvizzeraFIS05-402-103
Vitamina B12Merck68-19-9
DSM592230049315212099

Riferimenti

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