Screening farmacologico basato sulla trascrittomica efficiente in termini di costi

Summary

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro che va dalle colture cellulari ex vivo o in vitro alla pre-elaborazione dei dati trascrittomici per uno screening farmacologico basato sul trascrittoma economicamente vantaggioso.

Abstract

La trascrittomica consente di ottenere informazioni complete sui programmi cellulari e sulle loro risposte alle perturbazioni. Nonostante una significativa diminuzione dei costi di produzione e sequenziamento delle librerie nell'ultimo decennio, l'applicazione di queste tecnologie alla scala necessaria per lo screening dei farmaci rimane proibitivamente costosa, ostacolando l'immenso potenziale di questi metodi. Il nostro studio presenta un sistema economicamente vantaggioso per lo screening farmacologico basato sul trascrittoma, che combina colture di perturbazione miniaturizzate con trascrittomica mini-bulk. Il protocollo mini-bulk ottimizzato fornisce segnali biologici informativi a una profondità di sequenziamento conveniente, consentendo uno screening approfondito di farmaci noti e nuove molecole. A seconda del trattamento scelto e del tempo di incubazione, questo protocollo si tradurrà in librerie di sequenziamento entro circa 2 giorni. A causa dei diversi punti di arresto all'interno di questo protocollo, la preparazione della libreria, così come il sequenziamento, possono essere eseguiti indipendentemente dal tempo. È possibile processare contemporaneamente un numero elevato di campioni; La misurazione di un massimo di 384 campioni è stata testata senza perdita di qualità dei dati. Inoltre, non sono note limitazioni al numero di condizioni e/o farmaci, nonostante si consideri la variabilità nei tempi ottimali di incubazione dei farmaci.

Introduction

Lo sviluppo di nuovi farmaci è un processo complesso e dispendioso in termini di tempo che comporta l'identificazione di potenziali farmaci e dei loro bersagli, l'ottimizzazione e la sintesi di farmaci candidati e la verifica della loro efficacia e sicurezza in studi preclinici e clinici¹. I metodi tradizionali per lo screening dei farmaci, cioè la valutazione sistematica di librerie di composti candidati per scopi terapeutici, prevedono l'uso di modelli animali o saggi basati su cellule per testare gli effetti su bersagli o percorsi specifici. Sebbene questi metodi abbiano avuto successo nell'identificare i farmaci candidati, spesso non hanno fornito informazioni sufficienti sui complessi meccanismi molecolari alla base dell'efficacia dei farmaci e anche della tossicità e dei meccanismi dei potenziali effetti collaterali.

La valutazione degli stati trascrizionali dell'intero genoma rappresenta un approccio potente per superare gli attuali limiti nello screening farmacologico, in quanto consente valutazioni complete dell'espressione genica in risposta ai trattamenti farmacologici². Misurando i trascritti dell'RNA in modo genome-wide espressi in un dato momento, la trascrittomica mira a fornire una visione olistica dei cambiamenti trascrizionali che si verificano in risposta ai farmaci, compresi i cambiamenti nei modelli di espressione genica, lo splicing alternativo e l'espressione dell'RNA non codificante³. Queste informazioni possono essere utilizzate per determinare i bersagli farmacologici, prevedere l'efficacia e la tossicità dei farmaci e ottimizzare il dosaggio dei farmaci e i regimi di trattamento.

Uno dei principali vantaggi della combinazione della trascrittomica con uno screening imparziale dei farmaci è la possibilità di identificare nuovi bersagli farmacologici che non sono stati precedentemente considerati. Gli approcci convenzionali di screening dei farmaci spesso si concentrano su molecole o percorsi bersaglio stabiliti, ostacolando l'identificazione di nuovi bersagli e potenzialmente dando luogo a farmaci con effetti collaterali imprevisti e un'efficacia limitata. La trascrittomica può superare queste limitazioni fornendo informazioni sui cambiamenti molecolari che si verificano in risposta al trattamento farmacologico, scoprendo potenziali bersagli o percorsi che potrebbero non essere stati considerati in precedenza².

Oltre all'identificazione di nuovi bersagli farmacologici, la trascrittomica può essere utilizzata anche per prevedere l'efficacia e la tossicità dei farmaci. Analizzando i modelli di espressione genica associati alle risposte ai farmaci, è possibile sviluppare biomarcatori che possono essere utilizzati per prevedere la risposta di un paziente a un particolare farmaco o regime di trattamento. Questo può anche aiutare a ottimizzare il dosaggio del farmaco e ridurre il rischio di effetti collaterali avversi⁴.

Nonostante i suoi potenziali benefici, il costo della trascrittomica rimane un ostacolo significativo alla sua applicazione diffusa nello screening farmacologico. L'analisi trascrittomica richiede attrezzature specializzate, competenze tecniche e analisi dei dati, il che può rendere difficile per i team di ricerca più piccoli o le organizzazioni con finanziamenti limitati utilizzare la trascrittomica nello screening dei farmaci. Tuttavia, il costo della trascrittomica è in costante diminuzione, rendendola più accessibile alle comunità di ricerca. Inoltre, i progressi nella tecnologia e nei metodi di analisi dei dati hanno reso la trascrittomica più efficiente ed economica, aumentandone ulteriormente l'accessibilità².

In questo protocollo, descriviamo un sistema altamente dimensionale ed esplorativo per lo screening di farmaci basato sul trascrittoma, combinando colture di perturbazione miniaturizzate con analisi trascrittomica mini-bulk ^5,6. Con questo protocollo, è possibile ridurre il costo per campione a 1/^{6 del costo} attuale delle soluzioni commerciali per il sequenziamento dell'mRNA a lunghezza intera. Il protocollo richiede solo attrezzature di laboratorio standard, con l'unica eccezione dell'uso di tecnologie di sequenziamento a lettura breve, che possono essere esternalizzate se gli strumenti di sequenziamento non sono disponibili internamente. Il protocollo mini-bulk ottimizzato fornisce segnali biologici ricchi di informazioni a una profondità di sequenziamento conveniente, consentendo uno screening approfondito di farmaci noti e nuove molecole.

Lo scopo dell'esperimento è quello di effettuare lo screening dell'attività dei farmaci sulle PBMC in diversi contesti biologici. Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi questione biologica in cui diversi farmaci devono essere testati con una lettura trascrittomica, fornendo una visione a livello di trascrittoma dell'effetto cellulare del trattamento.

Protocol

Questo protocollo segue le linee guida dei comitati etici locali dell'Università di Bonn.

1. Preparazione di tamponi, soluzioni e attrezzature

1. Preparare le soluzioni e raccogliere i materiali descritti nell'Indice dei materiali.
2. Riscaldare il bagnomaria a 37 °C e riscaldare il terreno di coltura completo (RPMI-1640 + 10% siero fetale di vitello (FCS) + 1% penicillina/streptomicina).
3. Per la raccolta delle cellule, utilizzare soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS).
   NOTA: Mantenere un ambiente pulito mentre si lavora con le cellule per mantenere la sterilità.

2. Manipolazione delle celle

NOTA: Un protocollo dettagliato per la crioconservazione delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dal sangue umano può essere trovato in⁷.

1. Scongelamento e conteggio delle cellule
   1. Rimuovere i crioviali dall'azoto liquido e scongelarli a bagnomaria a 37 °C per 2 - 3 minuti capovolgendo delicatamente.
   2. Trasferire le cellule scongelate in una provetta conica da 50 ml.
   3. Sciacquare il crioviale con 1 mL di terreno di coltura completo caldo e aggiungere questa soluzione goccia a goccia alle cellule della provetta (1a fase^{di diluizione} ).
   4. Ripetere la diluizione 1:1 fino a raggiungere un volume di 32 mL (5 diluizioni totali rispettivamente con 1, 2, 4, 8 e 16 mL di terreno di coltura completo caldo). Aggiungere il mezzo goccia a goccia per ridurre il disturbo cellulare agitando leggermente il tubo conico.
   5. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti (300 x g, 20 °C) e rimuovere il surnatante inclinando delicatamente la provetta conica con un movimento fluido.
   6. Risospendere le cellule in 3 mL di terreno di coltura completo caldo e procedere con la conta cellulare.
   7. Per il conteggio, miscelare 10 μL di sospensione cellulare con Trypan Blue (diluizione da 1:2 a 1:10 a seconda della densità della sospensione cellulare) per distinguere le cellule vive da quelle morte durante il conteggio. Le cellule morte o danneggiate appariranno blu a causa dell'assorbimento del colorante, mentre le cellule vitali non vengono colorate.
      NOTA: Trypan Blue è leggermente citotossico, le cellule colorate non devono essere conservate per più di 5 minuti.
   8. Contare le cellule con un contatore di cellule automatizzato o una camera di conteggio utilizzando 10 μL di soluzione cellulare colorata.
      1. Quando si utilizza la camera cellulare migliorata da Neubauer, contare tutte le cellule all'interno dei quattro grandi quadrati situati agli angoli e utilizzare la seguente equazione per calcolare la concentrazione della sospensione cellulare.
         
   9. Diluire le cellule a una concentrazione finale di 1 x 10⁶ cellule/mL con terreno di coltura completo caldo. Centrifugare solo se il volume richiesto è inferiore a 3 mL e risospendere il pellet cellulare al volume corretto.
2. Semina e trattamento cellulare
   1. Seminare 100 μL di sospensione cellulare per pozzetto in una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti (1 x^{10 5} cellule/pozzetto).
      NOTA: Il numero di celle per la semina è stato ottimizzato per le colture PBMC. Mentre basse concentrazioni cellulari non produrranno una quantità sufficiente di RNA per il sequenziamento, un numero eccessivo di cellule aumenterà il rischio di lisi cellulare non ottimale e di inibizione della reazione di trascrizione inversa.
   2. Preparare diluizioni di farmaci a una concentrazione due volte superiore a quella utilizzata per il trattamento (2x). Scegliere il solvente in base alla solubilità del composto, preferibilmente terreno di coltura completo.
      NOTA: PBS o dimetilsolfossido (DMSO) possono essere utilizzati se non è possibile raggiungere una solubilità sufficiente in altro modo. La concentrazione massima di DMSO nel volume di incubazione risultante non deve superare lo 0,5 % per evitare la citotossicità indotta dal solvente.
   3. Aggiungere 100 μL della diluizione del farmaco 2x (concentrazione finale nel pozzetto 1X) e incubare a 37 °C per il tempo definito.
      NOTA: Devono essere effettuate indagini complementari al fine di stabilire il tempo di incubazione ottimale del farmaco ed escludere potenziali meccanismi di citotossicità.
3. Prelievo e lisi cellulare
   1. Centrifugare la piastra di coltura cellulare per 10 minuti (300 x g, 20 °C). Rimuovere delicatamente il surnatante con una pompa a vuoto mantenendo la piastra inclinata (30°-45°) mentre si punta la punta verso l'angolo inferiore del pozzetto per rimuovere il minor numero possibile di cellule.
   2. Lavare le cellule aggiungendo 200 μL di PBS ghiacciato a ciascun pozzetto e centrifugare la piastra per 5 minuti (300 x g, 4 °C). Rimuovere il surnatante con una pompa a vuoto, sempre mantenendo la piastra ad angolo acuto per rimuovere quanto più PBS possibile.
   3. Preparare il tampone di lisi come descritto nella Tabella 1 per il numero di reazioni (rxn) necessarie, aggiungendo il 10% in eccesso.
   4. Aggiungere 15 μL di tampone di lisi a ciascun pozzetto e sigillare la piastra con una pellicola sigillante adesiva per proteggere i campioni dalla contaminazione. Agitare la piastra prima della centrifugazione per 1 minuto (1000 x g, 4 °C) e incubare per 5 minuti su ghiaccio.
   5. Raccogliere 6 μL di soluzione cellulare lisata in una piastra PCR e congelare brevemente il lisato cellulare a -80 °C per garantire una lisi cellulare ottimale. Assicurarsi di evitare più cicli di congelamento delle piastre.
      NOTA: PUNTO DI ARRESTO: Se la produzione di cDNA non viene effettuata successivamente, il lisato cellulare può essere conservato a -80 °C per un massimo di diversi mesi senza una notevole diminuzione della qualità dell'RNA.

3. Preparazione della libreria per il sequenziamento

1. Reazione della trascrittasi inversa (RT)
   NOTA: Quando si lavora con l'RNA, posizionare tutti i campioni su ghiaccio e assicurarsi di utilizzare attrezzature prive di nucleasi (articoli di plastica sterili e monouso) e acqua.
   1. Preparare la miscela di reazione RT come descritto nella Tabella 2 per il numero di reazioni necessarie, aggiungendo il 10% in eccesso. Fate vorticare brevemente la miscela e fatela girare brevemente. Tenere il composto sul ghiaccio fino al momento dell'uso.
   2. Scongelare il lisato cellulare a temperatura ambiente (RT) e ruotarlo brevemente per raccogliere tutto il lisato cellulare sul fondo della piastra.
   3. Eseguire la denaturazione dell'mRNA su un termociclatore come da Tabella 3.
   4. Estrarre la piastra dal termociclatore e ruotarla brevemente verso il basso per raccogliere la potenziale condensa. Aggiungere 6 μL di miscela di reazione RT in ciascun pozzetto per un volume finale di 12 μL. Sigillare la piastra per proteggerla ed evitare l'evaporazione, il vortice e la rotazione verso il basso.
   5. Posizionare la piastra sul termociclatore e avviare il programma di reazione RT come da Tabella 3.
2. Pre-amplificazione
   1. Scongelare il primer della DNA polimerasi ad alta fedeltà e della PCR in situ (ISPCR) a temperatura ambiente.
   2. Preparare la miscela di pre-amplificazione come da Tabella 4 per il numero di reazioni necessarie, aggiungendo il 10% di eccedenza. Agitare brevemente la miscela e farla girare.
      NOTA: La miscela enzimatica è stabile a temperatura ambiente per ore.
   3. Ruotare la piastra PCR, aggiungere 15 μL della miscela di preamplificazione a ciascun pozzetto e sigillare la piastra.
   4. Posizionarlo sul termociclatore e avviare la reazione di preamplificazione come da Tabella 5.
      1. Regolare il numero di cicli in base al contenuto di RNA. Iniziare con un numero più basso e aumentare se la resa di cDNA non è sufficiente.
         NOTA: In base alla nostra esperienza, il numero ottimale di cicli dovrebbe essere stabilito per ogni tipo di cellula, le condizioni sperimentali e il trattamento non influenzeranno il numero ottimale di cicli. Pertanto, raccomandiamo di stabilire sperimentalmente il numero ottimale di cicli quando si stabilisce questo protocollo per un nuovo tipo di cellula. In generale, le cellule primarie richiedono un numero maggiore di cicli rispetto alle linee cellulari. PUNTO DI ARRESTO: Il prodotto di preamplificazione può essere conservato a - 20 °C.
3. Pulizia del cDNA e controllo qualità (QC)
   NOTA: La pulizia del campione può essere eseguita in sequenza per ciascuna piastra poiché i campioni sono piuttosto stabili in questa fase. L'aumento del numero di campioni porterà a una maggiore durata del protocollo, ma non limiterà il numero di campioni che possono essere processati contemporaneamente.
   1. Prima di iniziare, portare le perle di purificazione magnetica a temperatura ambiente e vorticare ad alta velocità per 1 minuto per risospendere completamente le perline.
   2. Aggiungere 0,8 x v/v (20 μL) di microsfere di purificazione magnetica a ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
   3. Posizionare la piastra PCR su un rack magnetico per 5 minuti fino a quando le perle non sono completamente separate. Rimuovere con cautela il surnatante.
   4. Tenendo la piastra sulla griglia magnetica, aggiungere delicatamente 100 μL di etanolo all'80% appena preparato per lavare le perle e incubare per 30 s. Utilizzare una pipetta di piccolo volume per rimuovere il surnatante. Ripetere l'operazione per un'ulteriore fase di lavaggio. Assicurati di rimuovere quanto più etanolo possibile.
   5. Asciugare all'aria le perline sulla griglia magnetica a temperatura ambiente per un massimo di 5 minuti fino a quando l'etanolo non è completamente evaporato e le perline non sembrano più lucide.
   6. Rimuovere la piastra dal rack magnetico, risospendere le perle in 20 μL di acqua priva di nucleasi e incubare per 2 minuti.
   7. Riposizionare la piastra sulla griglia magnetica fino a quando le perline non si sono separate.
   8. Recuperare l'eluato in una nuova piastra PCR per il controllo qualità e la codifica del cDNA.
   9. Eseguire un test TapeStation o FragmentAnalyser per valutare la distribuzione dimensionale e la concentrazione della libreria di cDNA (consigliato: saggio TapeStation D5000). Per i dettagli, vedere le istruzioni del produttore. Ci si può aspettare una resa tipica di 20 ng.
4. Tagmentazione con kit
   NOTA: È possibile utilizzare altri protocolli di tagmentazione se già stabiliti.
   1. Diluire il cDNA a una concentrazione finale di 150 - 300 pg/μL utilizzando acqua priva di nucleasi.
   2. Preprogrammare il termociclatore come da Tabella 6 per garantire un avvio immediato della reazione di tagmentazione dopo aver aggiunto il cDNA alla miscela enzimatica.
   3. Preparare la miscela di tagmentazione come da Tabella 7 per il numero di reazioni necessarie, aggiungendo il 10% in eccesso.
   4. Erogare 3 μL della miscela di tagmentazione per reazione su una nuova piastra PCR e aggiungere 1 μL di cDNA a ciascuna reazione.
   5. Iniziare la reazione di tagmentazione subito dopo aver aggiunto il cDNA.
   6. Inattivare la reazione aggiungendo 1 μL di tampone di neutralizzazione (NT; in alternativa, è possibile utilizzare lo 0,2% di sodio dodecil solfato (SDS)).
5. PCR di arricchimento
   1. Preparare la miscela di arricchimento PCR Tabella 7 per il numero di reazioni, aggiungendo il 10% in eccesso. (Consigliato: Nextera UDI impostato per impedire il salto dell'indice su celle di flusso modellate (ad esempio, Illumina NovaSeq 6000)).
   2. Aggiungere 9 μL della miscela di arricchimento PCR a ciascuna reazione per un volume totale di 14 μL.
   3. Eseguire il programma di arricchimento PCR come indicato nella Tabella 8.
      NOTA: Per la PCR di arricchimento, sono standard 16 cicli. Se la qualità del cDNA è scarsa, è possibile aggiungere ulteriori cicli.
6. Pulizia e controllo qualità
   1. Prima di iniziare, portare le perle di purificazione magnetica a temperatura ambiente e vorticare ad alta velocità per 1 minuto per risospendere completamente le perle.
   2. Aggiungere 1,0 x v/v (14 μL) di microsfere di purificazione magnetica e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
   3. Posizionare il piatto su una griglia magnetica e attendere 5 minuti fino a quando le perline non sono completamente separate. Rimuovere con cautela il surnatante.
   4. Tenendo la piastra sulla griglia magnetica, aggiungere delicatamente 100 μL di etanolo all'80% appena preparato per lavare le perle e incubare per 30 s. Utilizzare una pipetta di piccolo volume per rimuovere il surnatante. Ripetere l'operazione per un'ulteriore fase di lavaggio. Assicurati di rimuovere quanto più etanolo possibile.
   5. Asciugare le perline all'aria a temperatura ambiente per 3 minuti o fino a quando non sembrano più lucide.
   6. Rimuovere la piastra dal rack magnetico, risospendere le perle in 20 μL di acqua priva di nucleasi e incubare per 2 minuti.
   7. Posizionare nuovamente la piastra sul rack magnetico fino a quando le perle non si separano e recuperare l'eluato in una nuova piastra PCR per il controllo qualità della libreria.
   8. Eseguire un test TapeStation o Fragment Analyzer per valutare la distribuzione dimensionale e la concentrazione della libreria di cDNA (consigliato: saggio ad alta sensibilità TapeStation D1000). Per i dettagli, vedere le istruzioni del produttore. In media, ci si può aspettare una resa di 10 ng.
      NOTA: PUNTO DI ARRESTO: Il prodotto PCR può essere conservato a - 20 °C.

4. Sequenziamento e pre-elaborazione dei dati

1. Sequenziamento
   NOTA: Le seguenti linee guida saranno applicabili a tutti gli strumenti Illumina per il sequenziamento a lettura breve. Se la strumentazione non è disponibile, il sequenziamento può essere eseguito da una struttura di sequenziamento esterna. Potrebbero essere utilizzati anche altri approcci di sequenziamento. Per semplicità, abbiamo scelto di riportare solo la tecnologia di sequenziamento più utilizzata.
   NOTA: I seguenti passaggi relativi all'utilizzo del software descrivono la procedura su un sequencer Illumina NovaSeq6000.
   1. Raggruppare le librerie indicizzate in modo univoco in un rapporto equimolare in base ai risultati ottenuti nel passaggio 3.6.8.
   2. Misurare la concentrazione del pool finale con un test ad alta sensibilità per calcolare la molarità del campione come segue:
      
   3. Caricare la cella di flusso secondo le specifiche dello strumento e l'ottimizzazione sperimentale. Esempi di concentrazioni di carico di strumenti comuni sono riportati nella tabella 9.
   4. Toccando lo schermo, selezionare Sequenza per avviare l'impostazione dell'esecuzione.
   5. Seguire le istruzioni sullo schermo e sulla cella di flusso di carico, sulla cartuccia di sequenza per sintesi, sulla cartuccia di clustering, sulla cartuccia tampone e assicurarsi che i contenitori dei rifiuti siano vuoti.
   6. Una volta che tutti i reagenti sono stati riconosciuti dallo strumento, fare clic su Run Setup. Definire qui il nome dell'esecuzione e la cartella di output in cui memorizzare i dati.
   7. Definire i dettagli della sequenza come paired-end con entrambe le letture di 51 bp. Vengono inoltre sequenziate due letture dell'indice con 8 bp ciascuna.
   8. Premere Review e, dopo aver verificato se tutti i dettagli della sequenza sono corretti, premere Start Run.
      NOTA: La profondità di sequenziamento consigliata è di 5 x 10⁶ letture/campione, con un minimo di 1 x 10⁶ letture/campione.
2. Pre-elaborazione dei dati
   1. Trasforma i dati di sequenziamento grezzi in formato FASTQ e demultiplexa in base agli indici del campione con lo strumento Bcl2Fastq2. Eseguire il demultiplexing con le impostazioni predefinite. Per istruzioni dettagliate su Bcl2Fastq2, vedere il manuale di riferimento.
      NOTA: La conversione e il demultiplexing di FASTQ vengono solitamente eseguiti dalla struttura di sequenziamento se il sequenziamento non viene eseguito internamente. Le strutture di sequenziamento di solito forniscono FASTQ demultiplexato per ulteriori elaborazioni.
   2. Sono disponibili diverse opzioni per l'allineamento dei dati e la quantificazione dell'abbondanza delle letture di sequenziamento (consigliato: pipeline nf-core RNA-seq (https://nf-co.re/rnaseq)). La pipeline offre diverse opzioni, utilizzare l'impostazione predefinita con STAR⁸ come allineato e Salmon⁹ per quantificare l'abbondanza della trascrizione.
   3. NOTA: Per ulteriori analisi bioinformatiche, sono disponibili diversi metodi. Non rientra nell'ambito di questo protocollo coprire tutti i protocolli (consigliato: pipeline DEseq2¹⁰). Uno script standard basato sul flusso di lavoro DEseq2 da noi sviluppato è disponibile su GitHub (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2).

Results

Seguendo il protocollo riportato, le PBMC umane sono state seminate, trattate con diversi farmaci immunomodulatori e, dopo diversi tempi di incubazione, raccolte per l'analisi trascrittomica di massa utilizzando il protocollo di sequenziamento (Figura 1).

Le concentrazioni ideali del farmaco e i tempi di incubazione per i composti in esame dovrebbero essere identificati a monte di questo protocollo con l'aiuto di strategie sperimentali complementari e sulla base della specifica domanda scientifica. Nella maggior parte dei casi, l'incubazione di 2-4 ore e 24 ore dovrebbe fornire una rappresentazione delle risposte trascrizionali precoci e tardive al trattamento.

I risultati più importanti per valutare la corretta esecuzione del protocollo sono i QC del cDNA e della libreria (Figura 2 e Figura 3). Il profilo del cDNA dovrebbe avere un'ampia distribuzione con una dimensione media di > 1000 bp (Figura 2), una dimensione media inferiore o un accumulo di molecole a basso peso molecolare (Figura 4) potrebbe indicare un basso input di RNA o una degradazione dell'RNA.

Anche la preparazione di una buona libreria di sequenziamento è un passo importante nel protocollo; le librerie di post-tagmentation dovrebbero avere una distribuzione piuttosto ristretta di circa 250 bp (Figura 3); i frammenti più lunghi avranno scarse prestazioni durante il sequenziamento (Figura 5).

Dopo il sequenziamento, i file FASTQ grezzi vengono allineati con il genoma di riferimento appropriato (ad esempio, umano o di topo) e l'abbondanza del trascritto viene quantificata per ciascun campione (vedi pipeline nf-core RNA-seq (https://nf-co.re/rnaseq)). Verrà ora eseguita un'analisi esplorativa dei dati per verificare la qualità complessiva dei dati. I dati allineati dovrebbero catturare un numero elevato di geni codificanti proteine, poiché solo l'RNA poliadenilato verrà catturato con questo protocollo (Figura 6A). Nei campioni umani ci aspettiamo di catturare tra 15000 e 20000 trascritti (questo valore si basa sull'annotazione del genoma umano di riferimento GENCODE 27¹¹). Un'ulteriore analisi esplorativa dei dati può includere l'analisi delle componenti principali (PCA). In questo caso, la struttura sottostante dei dati può essere visualizzata in un grafico bidimensionale. Nella Figura 6B, mostriamo un grafico PCA esemplare; I punti qui sono colorati per trattamento, mostrando tre diversi gruppi di condizioni sperimentali che portano a profili trascrittomici simili. Si può anche notare che le repliche biologiche (punti con lo stesso colore) sono trascrizionalmente simili, mostrando una buona robustezza del protocollo. I risultati illustrati in questa figura sono stati generati con la pipeline disponibile su GitHub in base al flusso di lavoro DESeq2 (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2).

Figura 1: Stime temporali e flusso di lavoro. (A) Stime temporali di questo protocollo per un'esecuzione con 96 campioni. (B) Diagramma di ogni fase all'interno del protocollo, dallo scongelamento delle cellule fino alla pre-elaborazione dei dati. Il diagramma deve essere letto dall'alto verso il basso seguendo le frecce. Le frecce cerchiate descrivono una ripetizione del passo. I punti rossi rappresentano i punti di arresto ulteriormente descritti nel protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Risultati esemplari per le librerie di cDNA. Risultati di un'elettroforesi miniaturizzata che mostra la distribuzione dimensionale di una libreria di cDNA esemplare. I segnali superiore e inferiore rappresentano i marcatori utilizzati per allineare il campione. Le linee blu indicano le dimensioni medie dei frammenti (parentesi blu). Il profilo del cDNA mostra un'ampia distribuzione con una dimensione media di > 1000 bp. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Risultati esemplari per le librerie di sequenziamento. Risultati di un'elettroforesi miniaturizzata che mostrano la distribuzione dimensionale di librerie di sequenziamento preparate con successo con una distribuzione stretta e una dimensione media di circa 250 bp. I segnali superiore e inferiore rappresentano i marcatori utilizzati per allineare il campione. Le linee blu indicano le dimensioni medie dei frammenti (parentesi blu). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Risultati subottimali esemplari per le librerie di cDNA. Risultati di un'elettroforesi miniaturizzata che mostrano la distribuzione dimensionale di una libreria di cDNA non ottimale con una dimensione media di < 200 bp. I segnali superiore e inferiore rappresentano i marcatori utilizzati per allineare il campione. Le linee blu indicano le dimensioni medie dei frammenti (parentesi blu). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Risultati subottimali esemplari per le librerie di sequenziamento. Risultati di un'elettroforesi miniaturizzata che mostra la distribuzione dimensionale di una libreria di sequenziamento non ottimale contenente frammenti più lunghi di 200 - 1000 bp. I segnali superiore e inferiore rappresentano i marcatori utilizzati per allineare il campione. Le linee blu indicano le dimensioni medie dei frammenti (parentesi blu). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Analisi esplorativa dei dati. Risultati rappresentativi dell'analisi esplorativa dei dati che mostrano l'effetto di farmaci immunomodulatori selezionati sulle PBMC. (A) Grafico a barre del numero di geni rilevati (assi Y) separati per tipo di gene (assi X). (B) PCA di tutti i geni nel set di dati colorati dai diversi trattamenti farmacologici. I punti con lo stesso colore sono repliche biologiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Reagente	Concentrazione	Volume [μL] /rxn
Guanidina cloridrato	80 millimetri	7.50
Deossinucleotidi trifosfati (dNTP)	10 mM ciascuno	6.52
Primer SMART dT30VN	100 μM	0.33
Acqua priva di nucleasi		0.65
Volume totale		15.00

Tabella 1: Tampone di lisi.

Reagente	Volume [μL] /rxn
Tampone SSRT II (5x)	2.00
DTT (100 mM)	0.50
Betaina (5 m)	2.00
MgCl2 (1 m)	0.14
SSRT II (200 U/μL)	0.25
Inibitore dell'RNAsi (40 U/μL)	0.25
TSO-LNA (100 μM)	0.20
Acqua priva di nucleasi	0.66
Volume totale	6.00

Tabella 2: Miscela di reazione della trascrittasi inversa (RT).

Denaturazione dell'mRNA
Passo	Temperatura	Durata
Denaturazione dell'mRNA	95 °C	2 minuti
	sul ghiaccio	2 minuti
Trascrizione inversa
Passo	Temperatura	Durata
Trascrizione inversa	42 °C	90 minuti
Inattivazione enzimatica	70 °C	15 minuti
	4 °C	tenere

Tabella 3: Programma termociclatore per la denaturazione dell'mRNA e la trascrittasi inversa (RT).

Reagente	Volume [μL] /rxn
DNA polimerasi ad alta fedeltà	12.50
Primer ISPCR (10 μM)	0.15
Acqua priva di nucleasi	2.35
Volume totale	15.00

Tabella 4: Mix di pre-amplificazione.

Passi	Temperatura	Durata
Denaturazione iniziale	98 °C	3 minuti
Denaturazione	98 °C	20 secondi	16 – 18 cicli
Ricottura	67 °C	20 secondi
Estensione	72 °C	6 minuti
	4 °C	tenere

Tabella 5: Programma termociclatore di pre-amplificazione.

Passi	Temperatura	Durata
Tagmentazione	55 °C	8 minuti
	4 °C	tenere

Tabella 6: Programma termociclatore di tagmentazione.

Combinazione di tagmentazione
Reagente	Volume [μL] /rxn
Miscela di tagment dell'amplicon (ATM)	1.0
Tampone DNA Tagment (TD)	2.0
Volume totale	3.0
Miscela di PCR di arricchimento
Reagente	Volume [μL] /rxn
DNA polimerasi ad alta fedeltà	7.0
Primer indicizzato compatibile con Nextera	2.0
Volume totale	9.0

Tabella 7: Miscela di tagmentazione e miscela di PCR di arricchimento.

Passi	Temperatura	Durata
Avvio a caldo	72 °C	5 minuti
Denaturazione iniziale	98 °C	30 secondi
Denaturazione	98 °C	10 secondi	16 cicli
Ricottura	60 °C	30 secondi
Estensione	72 °C	1 minuto
Estensione finale	72 °C	5 minuti
	4 °C	tenere

Tabella 8: Programma di arricchimento del termociclatore PCR.

Strumento	Concentrazione di carico
MiSeq v2	Ore 22
SuccessivoSeq 500/550	Ore 13.4
NovaSeq 6000	1250 pM

Tabella 9: Esempi di concentrazioni di carico di strumenti di sequenziamento comuni.

Discussion

La scoperta e lo sviluppo di farmaci possono trarre grandi benefici dalla visione olistica dei processi cellulari che la trascrittomica di massa può fornire. Tuttavia, questo approccio è spesso limitato dall'alto costo dell'esperimento con il protocollo standard di RNA-seq di massa, che ne impedisce l'applicazione in ambienti accademici e dal suo potenziale di scalabilità industriale.

Le fasi più critiche del protocollo sono lo scongelamento delle cellule e le fasi iniziali della preparazione della libreria. Garantire un'elevata vitalità delle cellule dopo lo scongelamento è fondamentale per il successo dei trattamenti e dell'analisi trascrittomica. Le prime fasi della raccolta cellulare e della preparazione della libreria fino alla sintesi del cDNA sono fondamentali per preservare l'integrità dell'RNA. In questa fase è fondamentale mantenere il lisato cellulare sempre ghiacciato ed elaborare i campioni il più rapidamente possibile. Se si osserva un'eccessiva degradazione dell'RNA, le superfici e le attrezzature del laboratorio devono essere pulite con prodotti specifici per inibire qualsiasi attività della RNasi.

Il protocollo qui descritto è attualmente ottimizzato per il trattamento farmacologico su PBMC da donatori sani per un massimo di 24 ore. Per eseguire l'esperimento con un diverso tipo di cellula o per un tempo di incubazione più lungo, potrebbe essere necessario ottimizzare di conseguenza il numero di cellule per le condizioni di semina e coltura.

Con questo protocollo, forniamo un flusso di lavoro per l'analisi trascrittomica dopo il trattamento farmacologico su PBMC utilizzando apparecchiature di laboratorio standard e senza bisogno di kit commerciali. Con questo approccio ed evitando la fase di purificazione dell'RNA, abbiamo ridotto significativamente i costi consentendo l'analisi parallela di un elevato numero di composti.

Poiché questo protocollo si basa su un test in vitro, il suo principale limite è che non può valutare alcun processo metabolico dei farmaci che potrebbe portare a una diversa bioattività. Inoltre, il numero di trascritti acquisiti e la profondità di sequenziamento saranno inferiori rispetto ai metodi standard di trascrittomica a lunghezza intera, impedendo l'uso di questi dati per applicazioni che richiedono un contenuto di informazioni più elevato, come lo splicing differenziale o la quantificazione di polimorfismi a singolo nucleotide.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provetta conica da 50 mL	Fisher Scientific	10203001
Guarnizioni adesive per piastre PCR	Thermo Fisher Scientific	AB0558
Amplicon Tagment Mix (ATM)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT Kit di preparazione della libreria DNA (96 campioni)
Perline AMPure XP	Beckman Coulter	A 63881
Betaine	Sigma-Aldrich	61962
Piastre a 96 pozzetti per colture cellulari	Thermo Fisher Scientific	260860
Pompa a vuoto per colture cellulari (VACUSAFE)	Integra Bioscience	158300
Miscela di deossinucleotidi trifosfati (dNTP) 10 mM ciascuno	Fermentas	R0192
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
DTT (100 mM)	Invitrogen	18064-014
EDTA	Sigma-Aldrich 798681		per cellule aderenti
Etanolo	Sigma-Aldrich	51976
Siero fetale bovino	Thermo Fisher Scientific	26140079
Puntali filtranti (10 &; L)	Gilson
Puntali filtranti (100 µ L)	Gilson
Puntali filtranti (20 & micro; L)	Gilson
Puntali filtranti (200 & micro; L)	Gilson
Guanidina cloridrato	Sigma-Aldrich	G3272
ISPCR primer (10 &; micro; M)	Biomers.net GmbH	SP10006	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)	KAPA Biosystems	KK2601
Cloruro di magnesio (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Supporto magnetico 96	Ambion	AM10027
Neutralizzare Tagment (NT) Buffer	di DNA Illumina	FC-131-1096	Nextera XT (96 campioni), in alternativa 0,2 % SDS
Primer di indicizzazione compatibile con Nextera	Illumina
Acqua priva di nucleasi	Invitrogen	10977049
PBS	Thermo Fisher Scientific	AM9624
PCR Piastre a 96 pozzetti	Thermo Fisher Scientific	AB0600
Sigillatrice per piastre PCR	Thermo Fisher Scientific	HSF0031
Penicillina / Streptomicina	Thermo Fisher Scientific	15070063
Qubit 4 fluorimetro	Invitrogen	15723679
Inibitore ricombinante della RNasi (40 U/ul)	TAKARA	2313A
RPMI-1640 terreno di coltura cellulare	Gibco	61870036	Se non si lavora con le PBMC, regolare in base al tipo di cella
Primer SMART dT30VN	Sigma-Aldrich		5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3
Attrezzature di laboratorio standard	varie	ad	es. centrifuga, macchina per il ghiaccio, secchiello per il ghiaccio, acqua distillata, bagno d'acqua
SuperScript II Trascrittasi inversa (SSRT II)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
SuperScript II Trascrittasi inversa (SSRT II) tampone (5x)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
Tagment DNA Buffer (TD)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 campioni)
Sistema TapeStation 4200	Agilent	G2991BA
Thermocycler (S1000)	Bio-Rad	1852148
TSO-LNA (100 uM)	Eurogentec		5' Biotina AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G(G){G
Vortex-Genie 2 Mixer	Sigma-Aldrich	Z258415