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Articolo metodologico

Reazione a catena di ibridazione RNA Fluorescenza a montaggio intero Ibridazione in situ di geni chemiosensoriali nelle appendici olfattive delle zanzare

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DOI:

10.3791/65933

⸱

17 novembre 2023

 , 
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

L'articolo descrive i metodi e i reagenti necessari per eseguire la reazione a catena di ibridazione RNA a fluorescenza intera in situ (HCR, RNA, WM-FISH) per rivelare informazioni sulla risoluzione spaziale e cellulare dei geni dei recettori chemiosensoriali nell'antenna della zanzara e nel palpo mascellare.

Abstract

Le zanzare sono vettori efficaci di malattie mortali e possono navigare nel loro ambiente chimico utilizzando recettori chemiosensoriali espressi nelle loro appendici olfattive. Capire come i recettori chemiosensoriali sono organizzati spazialmente nelle appendici olfattive periferiche può offrire informazioni su come l'odore è codificato nel sistema olfattivo delle zanzare e informare nuovi modi per combattere la diffusione delle malattie trasmesse dalle zanzare. L'emergere della reazione a catena di ibridazione di terza generazione, l'ibridazione in situ dell'RNA a fluorescenza a montaggio intero (HCR, RNA, WM-FISH) consente la mappatura spaziale e la profilazione simultanea dell'espressione di più geni chemiosensoriali. Qui, descriviamo un approccio graduale per l'esecuzione dell'HCR RNA WM-FISH sull'antenna della zanzara Anopheles e sul palpo mascellare. Abbiamo studiato la sensibilità di questa tecnica esaminando il profilo di espressione dei recettori olfattivi ionotropici. Abbiamo chiesto se la tecnica HCR WM-FISH descritta fosse adatta per studi multiplexati legando sonde di RNA a tre fluorofori spettralmente distinti. I risultati hanno fornito la prova che HCR RNA WM-FISH è robustamente sensibile per rilevare simultaneamente più geni chemiosensoriali nell'antenna e nelle appendici olfattive palpi mascellari. Ulteriori indagini attestano l'idoneità di HCR WM-FISH per la profilazione di co-espressione di bersagli a doppio e triplo RNA. Questa tecnica, se applicata con modifiche, potrebbe essere adattabile per localizzare geni di interesse nei tessuti olfattivi di altre specie di insetti o in altre appendici.

Introduzione

Le zanzare vettori come Anopheles gambiae si basano su un ricco repertorio di geni chemiosensoriali espressi nelle loro appendici olfattive periferiche per prosperare in un mondo chimico complesso e identificare odori rilevanti dal punto di vista comportamentale provenienti da ospiti umani, rilevare fonti di nettare e localizzaresiti di ovideposizione. L'antenna della zanzara e il palpo mascellare sono arricchiti con geni chemiosensoriali che guidano il rilevamento degli odori in queste appendici olfattive. Tre classi principali di canali ionici ligando-dipendenti guidano il rilevamento degli odori nelle appendici olfattive delle zanzare: i recettori degli odori (OR), che funzionano con un co-recettore obbligato del recettore degli odori (Orco); i recettori ionotropici (IR), che interagiscono con uno o più corecettori IR (IR8a, IR25a e IR76b); i recettori gustativi chemiosensoriali (GR), che funzionano come un complesso di tre proteine per rilevare l'anidride carbonica (CO2 2)1,2.

L'ibridazione in situ a fluorescenza dell'RNA è un potente strumento per rilevare l'espressione dell'mRNAendogeno 3. In generale, questo metodo utilizza una sonda di acido nucleico a singolo filamento marcata con fluorofori con sequenza complementare a un mRNA bersaglio. Il legame della sonda di RNA fluorescente all'RNA bersaglio consente l'identificazione di cellule che esprimono un trascritto di interesse. I recenti progressi consentono ora di rilevare le trascrizioni nei tessuti delle zanzare a montaggio intero 4,5. La prima generazione di tecnologia di reazione a catena di ibridazione (HCR) utilizzava un amplificatore HCR basato sull'RNA; questo è stato migliorato in un metodo di seconda generazione che ha invece utilizzato DNA ingegnerizzato per l'amplificatore HCR 6,7. Questo aggiornamento ha comportato un aumento di 10 volte del segnale, una drastica diminuzione dei costi di produzione e un miglioramento significativo della durata dei reagenti 6,7.

Nel protocollo, descriviamo l'utilizzo di un metodo di ibridazione in situ a fluorescenza dell'RNA a montaggio intero HCR di terza generazione (HCR RNA WM-FISH) progettato per rilevare la localizzazione spaziale e l'espressione di qualsiasi gene 8,9. Questo metodo in due fasi utilizza innanzitutto sonde di acido nucleico specifiche per l'mRNA di interesse, ma che contengono anche una sequenza di riconoscimento dell'iniziatore; la seconda fase utilizza forcine marcate con fluorofori che si legano alla sequenza dell'iniziatore per amplificare il segnale fluorescente (Figura 1). Questo metodo consente anche il multiplexing di due o più sonde di RNA e l'amplificazione dei segnali della sonda per facilitare il rilevamento e la quantificazione dell'RNA8. La visualizzazione dell'abbondanza del trascritto e dei modelli di localizzazione dell'RNA dei geni chemiosensoriali espressi nelle appendici olfattive offre la prima linea di comprensione delle funzioni dei geni chemiosensoriali e della codifica degli odori.

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Protocollo

1. Considerazioni e preparazione dei materiali

  1. Decidi se sarà appropriato l'intero montaggio o la criosezione del tessuto. Questo protocollo è ottimizzato per l'imaging in situ dell'RNA nell'antenna antizanzara Anopheles e nel palp mascellare senza criosezionamento. Se i campioni sono più spessi di 5 mm, si consiglia la criosezione per consentire la penetrazione della sonda.
  2. Identificare i geni di interesse e copiare le sequenze, inclusi introni ed esoni, da un database adatto. Trascrivere la sequenza genica in RNA per la sintesi.
  3. Determinare se acquistare sonde da fornitori commerciali o se le sonde verranno sintetizzate in laboratorio.
    NOTA: In questo studio, le sonde in situ sono state acquistate da un fornitore commerciale (vedere la tabella dei materiali). In alternativa, può essere sintetizzato come riportato in precedenza10. I reagenti utilizzati nello studio sono descritti nella Tabella 1. I materiali necessari per preparare i reagenti sono elencati nella tabella dei materiali.

2. Prefissazione tissutale

  1. Anestetizzare 10-15 zanzare adulte femmine o maschi di zanzare Anopheles coluzzii (ceppo N'Gousso), di età compresa tra 5 e 10 giorni dopo l'emergenza, raccogliendole con un aspiratore orale in un bicchiere di carta o in un tubo di plastica e mettendole in un secchio contenente ghiaccio. Un'anestesia indotta dal freddo di successo può essere confermata quando le zanzare sono immobili.
  2. Decapitali rimuovendo le teste dalla regione del collo con un paio di pinze. Usando la mano non dominante, afferrare il torace con una pinza e separare il collo dal corpo con una pinza tenuta dalla mano dominante. Mettere le testine in una provetta da 1,5 mL contenente 500 μL di tampone chitinasi-chimotripsina dimetilsolfossido (tampone CCD) su ghiaccio.
    NOTA: Il congelamento degli animali può deformare le antenne; Si consiglia un rapido atterramento sul ghiaccio. L'età della zanzara durante il test può variare a seconda del progetto. È importante confermare e coordinare il loro stato fisiologico, ad esempio se sono nutriti con sangue, affamati o accoppiati. In questo studio, le appendici olfattive sono state campionate da zanzare che erano state nutrite con sangue e accoppiate.
  3. Preriscaldare le teste di zanzara in tampone CCD a 37°C su un blocco termico per 5 min e poi trasferire il tubo contenente le teste di zanzara in un forno di ibridazione e ruotare a 37°C. Il tempo di incubazione in tampone CCD dipende dal tipo di tessuto. Per le antenne Anopheles femminili utilizzare 20 min, le antenne maschili richiedono 15 min, mentre per i palpi mascellari è necessario un tempo di incubazione più lungo (1 h).
  4. Trasferire l'intero contenuto del tubo in un vetro da dissezione dell'orologio. Versare delicatamente il campione nella depressione del vetro di un orologio (dissezione). Se le teste di zanzara sono bloccate all'interno del tubo, utilizzare una pipetta per aggiungere il tampone CCD nel tubo e risciacquare la testa.
  5. Utilizzare una pinza per trasferire con cura le teste o eventuali antenne/palpi staccati durante l'incubazione e fissare in 1 mL di prefissativo.
    NOTA: Il tampone CCD rimanente può essere conservato a -20 ° C. Il tampone può essere riutilizzato fino a 3 volte. Se il prefissativo diventa leggermente brunastro a causa del carryover del tampone CCD da parte dei tessuti, sostituirlo con un altro 1 mL di fissativo.
  6. Ruotare le teste in prefissativo per 24 h a 4° C utilizzando un nutator.
    NOTA: La velocità di oscillazione per il nutator utilizzato in questo studio non era regolabile; È stata utilizzata la velocità predefinita impostata (12 giri/min) dal produttore.

3. Dissezione tissutale

  1. Sciacquare le testine 4 volte (5 minuti per lavaggio) con 1 mL di PBS-Tween allo 0,1% su ghiaccio. Per evitare la perdita di campione, utilizzare una pipetta collegata al puntale di caricamento del gel per rimuovere il liquido.
    NOTA: È possibile eseguire due lavaggi rapidi seguiti da un lavaggio di 10 minuti e un lavaggio rapido finale al posto del passaggio 3.1.
  2. Trasferisci le teste nel tubo in un vetro da sezione. Versare delicatamente il campione nella depressione del vetro di un orologio. Risciacquare le teste di zanzara che sono bloccate all'interno del tubo con PBS-Tween allo 0,1%.
  3. Sotto un microscopio da dissezione, rimuovere i tessuti di interesse (antenne/palpi) dalla testa con una pinza affilata. Tenere la parte posteriore della testa con una pinza e afferrare un'antenna con un'altra pinza dalla base. Pulire le pinze con carta inumidita con solvente privo di RNAsi. Rimuovere i palpi utilizzando lo stesso procedimento.
  4. Trasferire le antenne e i palpi con una pinza in provette vuote prive di DNA/RNasi poste su ghiaccio. Separare le diverse parti di tessuto in provette diverse pre-etichettate.
  5. Disidratare il tessuto in 400 μL di solvente contenente una miscela di metanolo (MeOH 80%) e dimetilsolfossido (DMSO 20%) per 1 ora a temperatura ambiente.
    NOTA: Non è necessario posizionare il tessuto su un nutator; Lascialo riposare su un rack per provette a temperatura ambiente sul banco del laboratorio. Si consiglia di utilizzare una miscela di solventi freschi. Per una soluzione madre da 500 μL, miscelare 400 μL di MeOH con 100 μL di DMSO.
  6. Sostituire il reagente disidratante con 400 μL di metanolo assoluto (100%) e disidratare i tessuti per una notte a -20 °C. Lasciare che i tessuti si depositino per gravità e utilizzare una pipetta per rimuovere il liquido.
    NOTA: I campioni sono vitali per un lungo periodo di disidratazione, fino a 4 notti sono state testate senza perdita di segnale.

4. Post-fissazione tissutale

  1. Reidratare i tessuti in una serie in quattro fasi di MeOH/PBS-Tween graduato da 400 μL per 10 minuti su ghiaccio. Iniziate con il 75% di MeOH/25% di PBS-Tween, seguito dal 50% di MeOH/50% di PBS-Tween, poi con il 25% di MeOH/75% di PBS-Tween e infine con il 100% di PBS-Tween.
    NOTA: Una punta di caricamento del gel con una piccola apertura può essere utilizzata per rimuovere il tampone dalla provetta per evitare di perdere i tessuti. La rimozione del tampone può essere eseguita al microscopio da dissezione.
  2. Lavare con 400 μL di soluzione salina tamponata con fosfato contenente lo 0,1% di Tween-20 (PBS-T) per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare posizionando il campione su un nutator.
  3. Preparare una soluzione di proteinasi-K da 20 μg/mL e incubare in 400 μl di soluzione di proteinasi-K per 30 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Diluire 20 mg/mL di proteinasi-K stock (soluzione madre 1000x), cioè 2 μL in 2 mL di PBS-Tween allo 0,1%. Gli avanzi possono essere conservati in un congelatore a -20 ° C.
  4. Interrompere la digestione enzimatica del tessuto lavando 2 volte per 10 minuti con 400 μL di PBS-tween allo 0,1%.
  5. Aggiungere 400 μL di post-fissativo e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare 3 volte, 15 minuti per lavaggio, con 400 μL di PBS-Tween allo 0,1%.

5. Ibridazione della sonda

  1. Incubare il tessuto in 400 μL di tampone di ibridazione della sonda per 5 minuti. Assicurarsi che il tessuto sia completamente immerso nel tampone pipettando delicatamente.
  2. Prepararsi per la fase successiva riscaldando un'aliquota di tampone di ibridazione della sonda a 37 ° C per 30 min.
  3. Rimuovere il tampone e pre-ibridare con 400 μL di tampone di ibridazione della sonda preriscaldato per 30 minuti a 37 ° C.
  4. Preparare la soluzione della sonda per i recettori chemiosensoriali bersaglio (IR8a, IR76b, IR25a, IR41t.1, IR75d, IR7t, IR64a o Orco) aggiungendo 8 pM di sonda. Aggiungere 8 μL di materiale di sonde da 1 μM a un tampone di ibridazione della sonda preriscaldato da 500 μL.
  5. Rimuovere il tampone di ibridazione della sonda preriscaldato e sostituirlo con 400 μL di soluzione di sonda riscaldata.
  6. Incubare il tessuto a 37°C per due notti su un nutator posto all'interno di un'incubatrice e coperto sotto una scatola.

6. Amplificazione della sonda

  1. Riscaldare il tampone di lavaggio della sonda a 37 ° C. Rimuovere la soluzione di sonda in eccesso risciacquando il tessuto 5 volte, 10 min per lavaggio, con 400 μL di tampone di lavaggio della sonda a 37 ° C, nutando nell'incubatrice.
    NOTA: La preparazione per il passaggio 6.4 può iniziare. Vedere la nota al punto 6.4.
  2. Lavare i campioni 2 volte, 5 minuti per lavaggio, con 400 μL di citrato salino-sodico contenente il 10% di Tween-20 (SSCT) a temperatura ambiente. Scongelare il tampone di amplificazione a temperatura ambiente su un piano di lavoro.
  3. Preparare il tessuto per l'amplificazione incubando con 400 μL di tampone di amplificazione per 10 minuti a temperatura ambiente. A causa della viscosità del tampone di amplificazione, i tessuti potrebbero non essere completamente sommersi. Mescolare pipettando delicatamente il tampone di amplificazione sotto il tessuto ed espellendo il tampone sopra il tessuto fino a quando non sono sommersi.
  4. Preparare separatamente 18 pM di forcina h1 e 18 pM di forcina h2 riscaldando 6 μL di pasta da 3 μM a 95 °C per 90 s e raffreddare a temperatura ambiente in un cassetto buio per 30 min. Assicurarsi che le provette PCR siano ben chiuse per evitare l'evaporazione delle forcine durante il riscaldamento in un termociclatore.
    NOTA: Per risparmiare tempo, il passaggio 6.4 può essere avviato durante il 4° passaggio di lavaggio nel passaggio 6.1. Le forcine devono essere riscaldate separatamente per evitare reazioni crociate. Le forcine non devono essere diluite con alcun tampone in questa fase. Le forcine possono essere acquistate dal produttore della sonda insieme alle sonde.
  5. Sostituire il tampone di amplificazione aggiunto al punto 6.3 con una miscela contenente le forcine riscaldate (dal punto 6.4) insieme a 100 μL di tampone di amplificazione. Una reazione tipica conterrà 6 μL di h1, 6 μL di h2 e 100 μL di tampone di amplificazione.
    NOTA: Le forcine h1 e h2 possono essere combinate dopo il raffreddamento a temperatura ambiente e quindi aggiunte a 100 μL di tampone di amplificazione. Per evitare il trasferimento dei campioni di tessuto da una provetta all'altra, il tampone di amplificazione nella fase 6.3 può essere rimosso e sostituito dalla miscela di forcine diluita nel tampone di amplificazione.
  6. Incubare il tessuto durante la notte e nutare al buio a temperatura ambiente utilizzando la velocità predefinita del nutator.

7. Montaggio del campione di tessuto

  1. Diluire il tampone di amplificazione nel tessuto incubato con 300 μL di 5x SSCT (cloruro di sodio-citrato di sodio diluito in Tween-20).
    NOTA: La diluizione è utile per ridurre la viscosità e facilita la rimozione del tampone di amplificazione dal tessuto. Abbiamo usato Triton-X 100 per il pre-fissativo e Tween-20 per il post-fissativo a causa delle differenze nelle loro azioni come agenti per permeabilizzare la membrana cellulare.
  2. Lavare il tessuto 5 volte con 400 μL di 5x SSCT a temperatura ambiente.
    NOTA: Conservare temporaneamente il tessuto a 4 °C fino al momento del montaggio, se necessario. Non abbiamo superato i 2 giorni prima dell'imaging.
  3. Formare 5 goccioline di soluzione di montaggio su un vetrino. Tagliare la punta di una pipetta da 200 μL per allargarla e trasferire il tessuto su un nuovo vetrino.
  4. Afferrare i campioni di tessuto dalla base con una pinza e immergerli delicatamente e risciacquarli in una serie di goccioline di soluzione di montaggio. Fare attenzione a non rompere i tessuti in questa fase.
  5. Montare con la soluzione di montaggio, posizionare il vetrino coprioggetto e sigillare con lo smalto. Visualizzazione di campioni di tessuto in situ utilizzando un microscopio confocale.

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Risultati

Rilevamento robusto di geni chemiosensoriali nell'antenna di Anopheles
Abbiamo studiato la sensibilità del metodo HCR FISH (Figura 1) per rilevare l'espressione dei recettori chemiosensoriali nei tessuti olfattivi delle zanzare. Guidati dai dati di trascrizione dell'RNA riportati in precedenza sull'antenna della zanzara femmina di Anopheles, abbiamo generato sonde per colpire una varietà di IR. I valori medi di trascrizione di quattro studi indipendenti ...

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Discussione

La terza generazione di reazione a catena di ibridazione (HCR) è notevole per la sua sensibilità e robustezza nel visualizzare diversi bersagli di RNA8. HCR WM-FISH è stato utilizzato con successo su embrioni di Drosophila, polli, topi e zebrafish, nonché sulle larve di nematodi e zebrafish 10,16,17. Le antenne delle zanzare e i palpi mascellari sono in genere soggetti a un'elevata autofluorescen...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Margo Herre e il laboratorio Leslie Vosshall per aver condiviso il loro protocollo di ibridazione in situ per le appendici olfattive di Aedes aegypti . Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health a C.J.P. (NIAID R01Al137078), da una borsa di studio HHMI Hanna Gray a J.I.R, da un Johns Hopkins Postdoctoral Accelerator Award a J.I.R. e da una borsa di studio post-dottorato del Johns Hopkins Malaria Research Institute a J.I.R. Ringraziamo il Johns Hopkins Malaria Research Institute e Bloomberg Philanthropies per il loro sostegno.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tampone di amplificazioneMolecular Instruments Molecular Instruments, Inc. | Ibridazione in situ + immunofluorescenza50 mL
cloruro di calcio (CaCl2) 1M Sigma-Aldrich 21115-100ML
ChitinasiSigma-AldrichC6137-50UN
ChimotripsinaSigma-AldrichCHY5S-10VL 
Dimetilsolfossido (DMSO)Sigma-Aldrich472301
Eppendorf tuboVWR20901-5511,5 mL
PinzeDumont11251Numero 5
Punta di caricamento gelCostar48531-200 &; Punta a L
ForcineStrumenti molecolariStrumenti molecolari, Inc. | Ibridazione in situ +divisioni dell'iniziatore h1 e h2
HEPES (1M)Sonda Sigma-AldrichH0887
IR25amolecolariID set di sonda: PRK149 AGAP010272
Sonda IR41t.1Strumenti molecolari  ID set di sonda: PRK978AGAP004432
sonda IR64aStrumenti molecolariID set di sonda: PRK700 AGAP004923
Sonda IR75dMolecular InstrumentsID set di sonde : PRK976AGAP004969
Sonda IR76bMolecular InstrumentsID set di sonde : PRI998AGAP011968
Sonda IR7tMolecular InstrumentsID set di sonde : PRL355AGAP002763
Sonda IR8a MolecularInstruments- ID set di sonde : PRK150AGAP010411
tubi LoBind VWR80077-2360,5 mL DNA/RNA Provette LoBind
Cloruro di Magnessio (MgCl2) 1MThermo FisherAM9530G
MetanoloFisherA412-500
Acqua priva di nucleasiThermo Fisher43-879-36
NutatorDenville ScientificModel 1353-D Mini rocker
Orco sondamolecolariSet di sonde ID PRD954AGAP002560
Paraformaldeide (20%)Servizi di microscopia elettronica 15713-S
Soluzione salina tamponata con fosfato (10X PBS)Thermo FisherAM9625
Tampone di ibridazione della sondaMolecular Instrumentshttps://www.molecularinstruments.com/50 mL
Tampone di lavaggio della sondaMolecularInstruments Molecular Instruments, Inc. | Ibridazione in situ + immunofluorescenza100 mL
proteinasi-KThermo FisherAM2548
Citrato salino-sodio (SSC) 20x Thermo Fisher15-557-044
Diamante SlowFadeThermo FisherS36972soluzione di montaggio
Cloruro di sodio (NaCl) 5MInvitrogenAM9760G
Triton X-100  (10%)Sigma-Aldrich 93443
Tween-20 (10%)TeknovaT0027
Orologio vetroCarolina742300  1 5/8" quadrato; trasparente
di in immunofluorescenza Strumenti Sonda Strumenti di

Riferimenti

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