Pseudomonas aeruginosa produce i biotensioattivi ramnolipidici. La cromatografia su strato sottile rileva e determina la proporzione di mono- e di-ramnolipidi prodotti da ciascun ceppo. La quantificazione dei ramnolipidi totali comporta la valutazione degli equivalenti di ramnosio presenti in questi biotensioattivi estratti dai surnatanti di coltura utilizzando il metodo dell'orcinolo.
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Articolo metodologico
Rilevamento e quantificazione di mono-ramnolipidi e di-ramnolipidi prodotti da Pseudomonas aeruginosa
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il batterio ambientale Pseudomonas aeruginosa è un patogeno opportunista con un'elevata resistenza agli antibiotici che rappresenta un pericolo per la salute. Questo batterio produce alti livelli di biotensioattivi noti come ramnolipidi (RL), che sono molecole con un significativo valore biotecnologico ma sono anche associate a tratti di virulenza. A questo proposito, l'individuazione e la quantificazione dell'RL possono essere utili sia per applicazioni biotecnologiche che per progetti di ricerca biomedica. In questo articolo, dimostriamo passo dopo passo la tecnica per rilevare la produzione delle due forme di RL prodotte da P. aeruginosa mediante cromatografia su strato sottile (TLC): i mono-ramnolipidi (mRL), molecole costituite da un dimero di acidi grassi (principalmente C10-C10) legato a una frazione ramnosio, e i di-ramnolipidi (dRL), molecole costituite da un dimero simile di acidi grassi legato a due frazioni ramnosio. Inoltre, presentiamo un metodo per misurare la quantità totale di RL basato sull'idrolisi acida di questi biotensioattivi estratti da un surnatante di coltura di P. aeruginosa e il successivo rilevamento della concentrazione di ramnosio che reagisce con l'orcinolo. La combinazione di entrambe le tecniche può essere utilizzata per stimare la concentrazione approssimativa di mRL e dRL prodotti da un ceppo specifico, come esemplificato qui con i ceppi tipo PAO1 (filogruppo 1), PA14 (filogruppo 2) e PA7 (filogruppo 3).
Introduzione
Pseudomonas aeruginosa è un batterio ambientale e un patogeno opportunista di grande preoccupazione a causa della sua produzione di tratti associati alla virulenza e della sua elevata resistenza agli antibiotici 1,2. Un caratteristico metabolita secondario prodotto da questo batterio è il biotensioattivo RL, che viene prodotto in modo coordinato con diversi tratti associati alla virulenza come la fenazina piocianina, un antibiotico con attività redox, e la proteasi elastasi3. Le proprietà tensio-attive ed emulsionanti dell'RL sono state sfruttate in diverse applicazioni industriali e sono attualmente commercializzate4.
La maggior parte dei ceppi di P. aeruginosa, appartenenti ai filogruppi 1 e 2, produce due tipi di RL: mRL, che consiste in una porzione di ramnosio legata a un dimero di acidi grassi composto principalmente da 10 atomi di carbonio, e dRL, che contiene un'ulteriore porzione di ramnosio legata al primo ramnosio4 (vedi Figura 1). Tuttavia, è stato riportato che due filogruppi minori di P. aeruginosa (gruppi 3 e 5) producono solo mRL 5,6. I due tipi di RL contengono una miscela di dimeri di acidi grassi, che, come detto, sono principalmente C10-C10, ma vengono prodotte anche proporzioni minori di molecole contenenti dimeri C12-C10, C12-C12 e C10-C12:1. La caratterizzazione dei congeneri RL prodotti da diversi ceppi utilizzando HPLC MS/MS è stata riportata 7,8. I metodi descritti in questo lavoro possono solo distinguere tra mRL e dRL, ma non possono essere utilizzati per la caratterizzazione dei congeneri RL.
P. aeruginosa e alcune specie di Burkholderia sono produttori naturali di RL9, ma il primo batterio è il produttore più efficiente. Tuttavia, l'RL utilizzato commercialmente è attualmente prodotto in derivati di Pseudomonas putida KT2440 che esprimono geni di P. aeruginosa per evitare l'uso di questo patogeno opportunista10,11. La rilevazione e la quantificazione dei RL prodotti da P. aeruginosa sono di grande importanza per lo studio dei meccanismi molecolari coinvolti nell'espressione dei caratteri correlati alla virulenza12, nella caratterizzazione di ceppi appartenenti ai cladi 3 o 513 e per la costruzione di derivati di P. aeruginosa che sovraproducono questi biotensioattivi pur avendo una ridotta virulenza14. La produzione di biotensioattivi da parte di diversi microrganismi è stata rilevata sulla base di alcune caratteristiche generali di questi composti, come il metodo della goccia di collasso o l'indice di emulsione15, ma questi metodi non sono né accurati né specifici16.
Qui, descriviamo il protocollo per rilevare mRL e dRL utilizzando l'estrazione liquida di RL totale dai surnatanti di coltura di diversi ceppi di tipo P. aeruginosa e la separazione di entrambi i tipi di RL utilizzando TLC. In questo metodo, l'RL estratto dal surnatante di coltura viene separato dalla sua solubilità differenziale nei solventi utilizzati per la TLC, causando una migrazione differenziale sulla piastra di gel di silice. Pertanto, i mRL hanno una migrazione più rapida rispetto ai dRL e possono essere rilevati come punti separati quando le piastre vengono asciugate e colorate con α-naftolo.
Il metodo qui descritto per rilevare mRL e dRL mediante TLC si basa su un articolo17 pubblicato in precedenza, che è facile da eseguire e non richiede apparecchiature costose. Questo metodo è stato utile per rilevare RL in vari isolati di P. aeruginosa 13 utilizzando controlli appropriati, come un mutante derivato da P. aeruginosa incapace di produrre RL. Tuttavia, non è il metodo preferito per caratterizzare nuovi biotensioattivi prodotti da batteri diversi da Pseudomonas aeruginosa a causa della sua mancanza di specificità.
Inoltre, viene presentato un metodo per quantificare gli equivalenti ramnosio dell'RL totale estratto da un surnatante di coltura di P. aeruginosa . Questo metodo quantifica questi biotensioattivi sulla base della reazione dell'orcinolo con gli zuccheri riduttivi, ottenendo un prodotto che può essere misurato spettrofotometricamente a 421 nm, come descritto in precedenza18. Poiché la reazione con l'orcinolo non è specifica per il ramnosio, è importante eseguire questo metodo con RL estratto dal surnatante di coltura che non contiene quantità significative di altre molecole contenenti zucchero, come i lipopolisaccaridi (LPS). Per l'estrazione liquida di RL18 viene utilizzata una miscela acidificata di cloroformio/metanolo, ma può essere utilizzato anche l'acetato di etile e l'estrazione in fase solida (SPE) produce ottimi risultati19. Il metodo dell'orcinolo qui descritto non richiede apparecchiature sofisticate e può fornire risultati affidabili se eseguito con particolare cura nella preparazione dei campioni analizzati, come discusso. Per garantire un'adeguata preparazione del campione, è importante includere un mutante di Pseudomonas aeruginosa rhlA incapace di produrre RL20 ed eseguire tre repliche biologiche e tre repliche tecniche per ogni determinazione.
Ci sono state significative controversie in letteratura16,21 riguardo alla determinazione di RL con il metodo dell'orcinolo, con alcuni studi che suggeriscono che la produzione di RL è sovrastimata e che il test manca di specificità per il ramnosio, rilevando potenzialmente altri zuccheri. Tuttavia, dimostriamo qui che i metodi descritti possono essere accurati e specifici nelle condizioni appropriate. Inoltre, per il confronto con le procedure descritte in questo articolo, utilizziamo il rilevamento UPLC-MS/MS di uno standard dRL e dimostriamo che risultati simili si ottengono con il metodo orcinolo. Il protocollo dettagliato per quantificare l'RL utilizzando questo metodo è incluso nel file supplementare 1.
Questi protocolli sono esemplificati utilizzando i ceppi tipo PAO1 (filogruppo 1), PA14 (filogruppo 2) e PA7 (filogruppo 3). Questi ceppi sono stati scelti perché sono ben caratterizzati e producono diversi profili RL.
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Protocollo
Questa procedura è schematizzata nella Figura 1 supplementare. I reagenti e le attrezzature utilizzate per lo studio sono elencati nella tabella dei materiali.
1. Rilevazione di mRL e dRL in surnatanti di coltura di P. aeruginosa mediante TLC
- Iniziare con il brodo centrifugato del ceppo di interesse P. aeruginosa , coltivato in terreno liquido per 24 ore (per raggiungere la fase stazionaria di crescita in cui viene prodotto RL). In genere, queste colture contengono 1 x 109 batteri per ml.
- Regolare il pH della coltura a 2 utilizzando HCl concentrato.
- Mettere 5 mL del surnatante di coltura acidificato in una provetta di polipropilene da 50 mL e aggiungere 5 mL di una miscela 2:1 di cloroformio: metanolo.
- Agitare il tubo per inversione tre volte, ogni volta per 10 s, e lasciare il tubo senza inversione per 2 minuti tra ogni agitazione.
- Lasciare la provetta senza agitazione per circa 3 ore fino a quando le due fasi non sono separate, oppure centrifugare la provetta per 10 minuti a 3.000 x g a 4 °C.
- Trasferire la fase organica (strato inferiore) in una provetta pulita e lasciare la provetta in una cappa di aspirazione fino a quando non si verifica la secchezza.
- Ripetere il processo a partire dal passaggio 1.3, inserendo la fase organica del secondo cloroformio: l'estrazione con metanolo, nella provetta utilizzata nella prima estrazione.
- Evaporare la fase organica fino a quando rimangono 1 mL o 1,5 mL. Trasferire questo volume in una provetta da centrifuga da 1,5 ml e far evaporare il solvente fino a renderlo asciutto durante la notte.
- Aggiungere 50 μl di metanolo alla provetta essiccata per risospendere l'RL.
- Eseguire cromatografia su strato sottile su piastre di gel di silice.
NOTA: La dimensione della lastra TLC deve essere tagliata in base al numero di campioni che verranno analizzati. Ogni campione deve essere applicato a 1,5 cm e il punto di applicazione deve essere a 1 cm dal bordo della lastra (tracciare una linea orizzontale con una matita). - Applicare 5 μl di ciascun campione utilizzando una micropipetta da 10 μl.
- La fase liquida TLC è costituita da una miscela 65:15:2 di cloroformio: metanolo: acido acetico. Per preparare 35 mL di questa miscela, mescolare 26 mL di cloroformio, 6 mL di metanolo e 0,8 mL di una soluzione madre al 20% di acido acetico. Mescolare questi solventi e metterli nella camera TLC chiusa per almeno 10 minuti prima di iniziare la cromatografia, in modo che l'atmosfera sia satura dei solventi volatili.
- Posizionare la piastra TLC nella camera, evitando il contatto con il punto in cui sono stati applicati i campioni.
- Chiudere la camera e lasciare il TLC fino a quando il solvente non raggiunge 1 cm prima del bordo della piastra. A questo punto togliete la piastra e lasciatela asciugare (si può applicare un flusso d'aria per accelerare il processo).
- Preparare una soluzione di α-naftolo sciogliendo 5 g di questo composto in 33 ml di etanolo. Una volta sciolto, aggiungere 127,5 ml di etanolo, 12,6 ml di acqua e 20,5 ml di H2SO4 freddo.
- Per rilevare la presenza di mRL e dRL, spruzzare la soluzione di α-naftolo sulla piastra della cappa di estrazione e porre la piastra spruzzata in forno a 85 °C per alcuni minuti fino a quando non è evidente il segno rosato di RL.
- Utilizza un'immagine del TLC per calcolare la proporzione di mono- e di-RL presente in ciascun campione utilizzando un software che rileva la densità di ogni spot.
2. Quantificazione della quantità totale di RL misurando gli equivalenti di ramnosio presenti nel biotensioattivo
- Porre 1,2 mL di coltura in fase stazionaria (coltivata per 24 ore) in una provetta da centrifuga da 1,5 mL e centrifugare per 3 minuti a 3.000 x g a 4 °C. Raccogliere il surnatante in una provetta pulita.
- Trasferire 333 μl in una provetta pulita (eseguire questo passaggio in triplice copia) e aggiungere 1 mL di etere.
- Mescolare energicamente a vortice per 30 s. Ripetere questa procedura con un tubo alla volta.
- Centrifugare per 2 minuti a 3.000 x g a 4 °C. Raccogliere la fase organica (fase superiore), trasferirla in una provetta pulita e lasciarla aperta nella cappa di aspirazione fino a quando non si verifica la secchezza.
- Ripetere l'estrazione con etere come descritto nel passaggio 2.2. Ripetere i passaggi 2.3 e 2.4.
- Una volta completamente asciugato, aggiungere 1 ml di acqua a ciascuna provetta. Lasciare i tubi per 12 ore per consentire all'RL di idratarsi, quindi agitare energicamente nel vortice.
- Mettere un pallone pulito nel ghiaccio per 5 minuti (poiché si tratta di una reazione esotermica). Preparare una soluzione al 60% di H2SO4 (proteggere il pallone dalla luce).
- In una provetta pulita, preparare una soluzione di orcinolo all'1,6% in acqua distillata. Per preparare il reagente orcinolo, mescolare 4,4 mL della soluzione di 60% H2SO4 con 0,6 mL della soluzione di orcinolo all'1,6%.
- Calcolare il volume finale del reagente orcinolo necessario. Aggiungere 900 μl di questo reagente a ciascun campione e a ciascuna concentrazione della curva di calibrazione, utilizzando diverse concentrazioni di ramnosio (in genere, vengono utilizzate 9 concentrazioni di ramnosio nell'intervallo da 1 μg/mL a 9 μg/mL) e una con 100 μL di acqua, assicurandosi che tutte vengano eseguite in triplice copia.
- Aggiungere 100 μl di ciascun campione di RL a 900 μl del reagente orcinolo in una provetta di vetro e mescolare le due soluzioni.
- Incubare per 30 minuti a bagnomaria preriscaldato a 80 °C.
- Lasciare raffreddare i tubi a temperatura ambiente.
- Leggere l'assorbanza dei campioni e la curva di calibrazione a 421 nm utilizzando una cella al quarzo.
- Calcolare la concentrazione di ramnosio in ciascun campione interpolando l'assorbanza sulla curva di calibrazione e considerando il volume utilizzato per la determinazione.
- Per calcolare la concentrazione di μM, dividere la concentrazione ottenuta in μg/mL per 182,2 (il peso molecolare del ramnosio) e moltiplicare per 1000.
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Risultati
In questo articolo, sono stati utilizzati tre diversi ceppi di tipo P. aeruginosa per rappresentare tre filogruppi, ciascuno con diversi livelli di produzione di RL e proporzioni di mRL e dRL. Questi ceppi includono PAO1 (un isolato di ferita proveniente dall'Australia, 195522), PA14 (un isolato vegetale proveniente dagli Stati Uniti, 197723) e PA7 (un isolato clinico proveniente dall'Argentina, 201024). Come controllo negativo, è stato impiegato il ...
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Discussione
Il metodo più accurato per rilevare e quantificare l'RL è l'HPLC accoppiato alla spettrometria di massa (MS)7,8,27; Tuttavia, richiede attrezzature specializzate e costose che potrebbero non essere accessibili a molti ricercatori. I metodi qui descritti possono essere eseguiti di routine con materiali e attrezzature di laboratorio di base per rilevare e stimare le concentrazioni di RL, ma presentano alcune limitazioni, in partic...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da rivelare.
Ringraziamenti
Il laboratorio di GSCh è sostenuto in parte da sovvenzioni IN201222 da Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), Dirección General de Asuntos del Personal Académico -UNAM.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1-NAFTHOL | SIGMA-ALDRICH | 70442 | |
| ACIDO ACETICO | J.T. BAKER | 9508-02 | |
| CENTRIFUGA | Per provette da centrifugazione 1,5 mL e 50 mL | ||
| CLOROFORMIO | J.T. BAKER | 9180-02 | |
| DI ESSICCAZIONE | |||
| ETHER | J.T. BAKER | 9244-02 | |
| PIPETTA IN VETRO | SIGMA-ALDRICH | ||
| ACIDO CLORIDRICO | J.T. BAKER | 5622-02 | |
| LB | |||
| L-RAMNOSIO MONOIDRATO | SIGMA-ALDRICH | R-3875 | |
| METANOLO | J.T. BAKER | 9049-02 | |
| ORCINOLO MONOIDRATO | SIGMA-ALDRICH | O1875 | |
| PPGAS Brodo | Tris HCL (0.12M), Cloruro di potassio ( 0.02M) Cloruro di ammonio (0.02M), Peptone (1%), pH 7,4 Autoclavato. Aggiungi Glucosio (5%) e solfato di magnesio (0,0016 M) | ||
| CELLA DI QUARZO (CUVETTA) | SIGMA-ALDRICH | Z276669 | |
| TLC RETTANGOLARE VASCA DI SVILUPPO | FISHER SCIENTIFIC | ||
| RAMNOLIPIDI | SPETTROFOTOMETRO | ||
| SPRUZZATORE | VIS | ||
| > 80 ° E |
Riferimenti
- Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. A. Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence. Frontiers in Cell Infection and Microbiology. 7, 1-29 (2017).
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: New insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).
- Williams, P., Cámara, M. Quorum sensing and environmental adaptation in Pseudomonas aeruginosa: a tale of regulatory networks and multifunctional signal molecules. Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 182-191 (2009).
- Soberón-Chávez, G., González-Valdez, A., Soto-Aceves, M. P., Cocotl-Yañez, M. Rhamnolipids produced by Pseudomonas: From molecular genetics to the market. Microbial Biotechnology (MBT). 14 (1), 136-146 (2021).
- Freschi, L., et al. The Pseudomonas aeruginosa pan-genome provides new insights on its population structure, horizontal gene transfer, and pathogenicity. Genome Biology and Evolution. 11 (1), 109-120 (2019).
- Quiroz-Morales, S. E., García-Reyes, S., Ponce-Soto, G. Y., Servin-Gonzalez, L. Tracking the origins of Pseudomonas aeruginosa phylogroups by diversity and evolutionary analysis of important pathogenic marker genes. Diversity. 14 (5), 345(2022).
- Déziel, E., et al. Liquid chromatography/mass spectrometry analysis of mixtures of rhamnolipids produced by Paeudomonas aeruginosa strain 57RP grown on mannitol or naphthalene. Biochemistry and Biophysic Acta. 1440 (2-3), 244-252 (1999).
- Abdel-Mawgoud, A. M., Lépine, F., Déziel, E. Rhamnolipids: Diversity of structures, microbial origins, and roles. Applied Microbiology and Biotechnology. 86 (5), 1323-1336 (2010).
- Toribio, J., Escalante, A. E., Soberón-Chávez, G. Production of rhamnolipids in bacteria other than Pseudomonas aeruginosa. European Journal of Lipid Science and Technology. 112, 1082-1087 (2010).
- Filbig, M., et al. Metabolic and process engineering on the edge-Rhamnolipids are a true challenge: A review. Biosurfactants. Foundations and Frontiers in Enzymology. Soberón-Chávez, G., et al. , Academic Press. New York. Chapter 8 157-181 (2023).
- Noll, P., et al. Limits for sustainable biosurfactant production: Techno-economic and environmental assessment of a rhamnolipid production process. Bioresource Technology. 25, 101767(2024).
- García-Reyes, S., Cocotl-Yañez, M., González-Valdez, A., Servín-González, L., Soberón Chávez, G. The PqsR-independent quorum-sensing response of Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 outlier-strain reveals new insights on the PqsE effect on RhlR activity. Molecular Microbiology. 116 (4), 1113-1123 (2021).
- Grosso-Becerra, M. V., et al. Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 is a non-virulent strain suitable for mono-rhamnolipids production. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (23), 9995-10004 (2016).
- Gutiérrez-Gómez, U., Soto-Aceves, M. P., Servín-González, L., Soberón-Chávez, G. Overproduction of rhamnolipids in Pseudomonas aeruginosa PA14 by redirection of the carbon flux from polyhydroxyalcanoate synthesis and overexpression of the rhlAB-R operon. Biotechnology Letters. 40 (11), 1561-1566 (2018).
- Zibek, S., Soberón-Chávez, G. Overview on glycosylated lipids produced by bacteria and fungi: Rhamno-, Sophoro-, Mannosylerythritol and Cellobiose Lipids. Biosurfactants for a Biobased. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. Hausmann, R., Henkel, M. , Springer. Berlin, Heidelberg. Chapter 4 181(2022).
- Twigg, M. S., et al. Microbial biosurfactant research: time to improve the rigour in the reporting of synthesis, functional characterization and process development. Microbial Biotechnology. 14 (1), 147-170 (2021).
- Matsuyama, T., Sogawa, M., Yano, I. Direct colony thin layer chromatography and rapid characterization of Serratia marscescens wetting agents. Applied and Environmental Microbiology. 53 (5), 1186-1188 (1987).
- Chandrasekaran, E. V., Bemiller, J. N. Constituent analyses of glycosaminoglycans. Methods on Carbohydrate Chemistry. 8, 89-96 (1980).
- Behrens, B., Engelen, J., Tiso, T., Blank, L. M., Hayen, H. Characterization of rhamnolipids by liquid chromatography/mass spectrometry after solid-phase extraction. Analytic and Bioanalytic Chemistry. 408 (10), 2505-2514 (2016).
- Rahim, R., et al. Cloning and functional characterization of the Pseudomonas aeruginosa rhlC gene that encodes rhamnosyltransferase 2, an enzyme responsible for di-rhamnolipid biosynthesis. Molecular Microbiology. 40 (3), 708-718 (2001).
- Irorere, V. U., Tripathi, L., Marchant, R., McClean, S., Banat, I. M. Microbial rhamnolipid production: A critical re-evaluation of published data and suggested future publication criteria. Applied Microbiology and Biotechnology. 101 (10), 3941-3951 (2017).
- Holloway, B. W. Genetic Recombination in Pseudomonas aeruginosa. Journal of General Microbiology. 13 (3), 572-581 (1955).
- Mathee, K. Forensic investigaction into the origin of Pseudomonas aeruginosa PA14-old but not lost. Journal of Medical Microbiology. 67 (8), 1019-1021 (2018).
- Roy, P. H., et al. Complete genome sequence of the multiresistant taxonomic outlier Pseudomonas aeruginosa PA7. PLoS ONE. 5, e8842(2010).
- Zhang, Y., Miller, R. M. Enhanced octadecane dispersion and biodegradation by a Pseudomonas rhamnolipid surfactant (biosurfactant). Applied and Environmental Microbiology. 58 (10), 3276-3282 (1992).
- Miller, J. Experiments in Molecular Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory. New York. 352-355 (1992).
- Abdel-Mawgoud, A. M., Lépine, F., Déziel, E. Liquid chromatography/mass spectrometry for the identification and quantification of rhamnolipids. Pseudomonas Methods and Protocols. 30, 359-373 (2014).
- Lee, D. G., et al. Genomic analysis reveals that Pseudomonas aeruginosa virulence is combinatorial. Genome Biology. 7 (10), 90(2006).
- Kubicki, S., et al. A straightforward assay for screening and quantification of biosurfactants in microbial culture supernatants. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 958(2020).
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