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Articolo metodologico

Marcatura immunofluorescente in sezioni di tessuto della mucosa nasale di ratti con rinite allergica tramite test immunologico multicolore

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DOI:

10.3791/65937

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22 settembre 2023

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1Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Meishan Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive una tecnica di immunofluorescenza multicolore per la valutazione del modello di rinite allergica nel ratto.

Abstract

La rinite allergica (AR) è una malattia infiammatoria cronica e non infettiva della mucosa nasale, mediata principalmente da immunoglobuline E specifiche (IgE), che colpisce circa il 10%-20% della popolazione mondiale. Mentre la colorazione a immunofluorescenza (IF) è stata a lungo una tecnica standard per rilevare l'espressione proteica specifica della malattia, le tecniche convenzionali di IF sono limitate nella loro capacità di rilevare i livelli di espressione di tre o più proteine nello stesso campione. Di conseguenza, negli ultimi anni sono state sviluppate tecniche di IF multicolore, che consentono la marcatura simultanea di più bersagli in cellule o tessuti.

Questo protocollo fornisce una panoramica completa del processo per stabilire un modello di ratto di AR, ottenere campioni di mucosa nasale e le procedure tecniche per l'immunofluorescenza multicolore. Tutti i ratti del gruppo AR hanno mostrato sintomi tipici come starnuti, naso che cola e prurito al naso, con osservazioni comportamentali che hanno ottenuto un punteggio di ≥5 punti. La colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) ha rivelato un aumento della conta delle cellule infiammatorie e un'integrità della mucosa nasale interrotta nel gruppo AR. L'immunofluorescenza multicolore (mIF) ha dimostrato un aumento dell'espressione di RORγt e TICAM-1, mentre l'espressione di Foxp3 è diminuita nel tessuto della mucosa nasale dei ratti AR.

Introduzione

La rinite allergica (AR) è una malattia infiammatoria cronica non infettiva della mucosa nasale, mediata principalmente da immunoglobuline E (IgE) specifiche1,2. È caratterizzata da sintomi come starnuti, naso che cola, congestione nasale e prurito nasale. Con l'industrializzazione e l'urbanizzazione, la prevalenza dell'AR sta gradualmente aumentando, colpendo circa il 10%-20% della popolazione mondiale1. La tecnica dell'immunofluorescenza (IF) è un metodo di colorazione fluorescente che utilizza una reazione di legame anticorpo-antigene. Può essere impiegato per rilevare e quantificare la distribuzione e i livelli di espressione di proteine specifiche nei tessuti biologici o nelle cellule. Nella ricerca AR, l'IF può rilevare simultaneamente più bersagli, tra cui citochine correlate all'AR, cellule infiammatorie, recettori e altro ancora, facilitando l'esplorazione della patogenesi dell'AR e degli effetti dei farmaci 3,4,5,6.

Il processo di colorazione a immunofluorescenza multicolore (mIF) assomiglia molto all'IF, con l'aggiunta di una fase di eluizione dell'anticorpo durante ogni ciclo di colorazione. Questa modifica consente il rilevamento simultaneo di più biomarcatori sulla stessa sezione di tessuto attraverso una singola marcatura sequenziale e più cicli di ricolorazione. mIF si basa sull'amplificazione del segnale della tiramide (TSA), che consente cicli ripetuti di colorazione fluorescente TSA e l'uso del riscaldamento a microonde per rimuovere gli anticorpi mantenendo i segnali fluorescenti 7,8. Rispetto all'IF convenzionale, l'mIF offre diversi vantaggi: (1) è in grado di rilevare antigeni debolmente espressi che sono difficili da identificare con l'IFconvenzionale 9,10; (2) fornisce una colorazione di alta qualità con un migliore rapporto segnale/rumore; (3) consente di quantificare le strutture e le regioni di interesse tessuto-specifiche11; (4) il multiplexing di percorsi multipli utilizza in modo efficiente i tessuti e conserva risorse patologiche limitate12; (5) l'analisi multiparametrica attraverso mIF offre informazioni più approfondite sui tessuti, scoprendo informazioni biologiche nascoste13.

Nel complesso, mIF consente l'osservazione di diverse espressioni e distribuzioni dell'antigene all'interno dello stesso campione, facilitando lo studio delle proteine bersaglio. In futuro, i ricercatori che cercano di comprendere l'espressione e la distribuzione di più proteine bersaglio troveranno questa tecnica una scelta preziosa. Questo studio dimostra l'applicazione di mIF per la colorazione di campioni di mucosa nasale di ratti con AR e valuta la creazione di un modello di AR nel ratto.

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Protocollo

Il protocollo e le procedure sperimentali hanno ricevuto l'approvazione del Comitato amministrativo e di ricerca sugli animali dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu (Numero di registrazione: 2022DL-010). I ratti maschi di Sprague Dawley (SD) di otto settimane, del peso di 180-200 g, sono stati ottenuti commercialmente (vedi Tabella dei materiali) e alloggiati in un ciclo naturale luce/buio con temperatura controllata (23 ± 2 °C) e umidità relativa (55% ± 10%). Dodici ratti sono stati divisi in modo casuale in due gruppi: il gruppo di controllo e il gruppo AR. Tutti i ratti sono stati acclimatati a queste condizioni e hanno avuto libero accesso a cibo e acqua per una settimana prima della sperimentazione.

1. Creazione di un modello di ratto di AR

  1. Preparazione della soluzione sensibilizzante: sospendere 30 mg di ovoalbumina (OVA) e 3 g di Al(OH)3 in 100 mL di soluzione fisiologica (vedi Tabella dei Materiali)14,15.
  2. Sensibilizzazione di base: afferrare e tenere il ratto completamente sveglio con l'addome rivolto verso l'alto. Disinfettare l'addome utilizzando batuffoli di cotone imbevuti di alcol al 75%. Utilizzare una siringa da 1,5 mL per iniettare 1 mL della soluzione sensibilizzante preparata nella fase 1.1 nella cavità addominale sinistra dei ratti del gruppo AR. Ripeta l'iniezione una volta ogni due giorni per 14 giorni (Figura 1A).
    NOTA: Assicurarsi che la testa del ratto sia posizionata più in basso rispetto alla coda per evitare danni all'intestino crasso e tenue durante l'inserimento della siringa. Il sito di iniezione si trova a 1,5 cm dalla linea mediana ventrale. I ratti del gruppo di controllo devono ricevere iniezioni intraperitoneali di 1 mL di soluzione fisiologica normale una volta ogni due giorni per 14 giorni.
  3. Provocazione nasale: somministrare 50 μL di OVA al 5% tramite gocce nasali utilizzando una pipetta da 100 μL (Figura 1B) il giorno successivo alla sensibilizzazione basale, ripetendo questa procedura per 7 giorni (Figura 1C).
    NOTA: Preparare la soluzione di OVA al 5% mescolando 5 g di OVA con 100 mL di soluzione fisiologica. Per il gruppo di controllo, somministrare gocce dello stesso volume di soluzione fisiologica.

2. Punteggio comportamentale dei ratti

  1. Entro 30 minuti dal completamento della sfida nasale finale, osservare e registrare i ratti utilizzando una fotocamera digitale per identificare sintomi come grattarsi il naso, starnutire e naso che cola, in base ai criteri di punteggio delineati nella Tabella 1 (Figura 1D).
    NOTA: La conferma del successo della modellazione AR si basa sul raggiungimento di un punteggio totale di ≥5 punti14.

3. Acquisizione di campioni di mucosa nasale

  1. Sacrificare i ratti: sacrificare i ratti esponendoli a un'overdose di CO2 . Successivamente, disinfettare i ratti con etanolo al 75% (vedi Tabella dei materiali). Utilizzare un bisturi per praticare un'incisione lungo i due angoli della bocca per esporre il tessuto muscolare (Figura 2A). Successivamente, tagliare le articolazioni dell'osso zigomatico e della mandibola su entrambi i lati del cranio utilizzando delle forbici per tessuti (Figura 2B) e rimuovere la mandibola (Figura 2C).
  2. Esposizione della cavità nasale: separare la pelle della mascella utilizzando un emostatico (Figura 2D) per esporre la cavità nasale (Figura 2E). Tagliare la connessione ossea tra la cavità nasale e la mascella con delle forbici per tessuti (Figura 2F). Quindi, recidere la connessione tra la cavità nasale e le ossa orbitali su entrambi i lati del forame infraorbitale (Figura 2G) e rimuovere la cavità nasale (Figura 2H).
  3. Fissazione: porre la cavità nasale estratta in paraformaldeide al 4% per il fissaggio e conservarla a temperatura ambiente per 24-72 h (vedi Tabella dei Materiali).
    NOTA: Assicurarsi che la quantità di fissativo paraformaldeide utilizzata sia sufficiente a coprire completamente le sezioni per un corretto fissaggio.

4. Pre-trattamento di campioni di mucosa nasale

  1. Decalcificazione: iniziare fissando i tessuti rimossi dal punto 3.1. Lavali tre volte con PBS per 20 minuti ciascuno. Seguili lavandoli tre volte con acqua distillata, ogni volta per 20 minuti. Successivamente, decalcificare i tessuti in una soluzione di decalcificazione con un volume di 20-30 volte quello dei tessuti a temperatura ambiente.
    1. La soluzione di decalcificazione (vedi Tabella dei Materiali) deve mantenere un pH di 7,2-7,4. Infine, metti il tessuto decalcificato in una scatola di disidratazione.
      NOTA: La soluzione decalcificante deve essere cambiata settimanalmente. Il processo di decalcificazione può concludersi quando il tessuto si ammorbidisce (circa 2 mesi).
  2. Disidratazione e ceretta: trasferire la scatola di disidratazione in un disidratatore (vedi Tabella dei materiali). Inizia con il 75% di alcol per 4 ore, seguito dall'85% di alcol per 2 ore, dal 90% di alcol per 2 ore e dal 95% di alcol per 1 ora.
    1. Successivamente, immergere il tessuto in etanolo anidro per 30 minuti, ripetere il processo per altri 30 minuti, utilizzare lo xilene per 5-10 minuti, ripetere questo passaggio per altri 5-10 minuti, immergere il tessuto nella cera per 1 ora, ripetere questo passaggio per un'altra ora e, infine, immergere il tessuto nella cera per un'altra 1 ora.
  3. Incasso: posizionare il blocco di cera fusa nella scatola da incasso (vedi Tabella dei materiali) e conservarlo in un congelatore a -20 °C. Una volta che la cera si è solidificata, rimuoverla e tagliare il blocco di cera.
  4. Affettatura: inserire il blocco di cera rifilato in un microtomo di paraffina (vedi Tabella dei materiali) e tagliarlo a fette dello spessore di 3 μm. Mettere le fette a bagnomaria a 40 °C su uno spargivetrino. Appiattire il fazzoletto, quindi sollevarlo con un vetrino e cuocerlo in forno a 60 °C.
    1. Dopo che l'acqua è evaporata e la cera è stata fissata correttamente, rimuovere i vetrini e conservarli a una temperatura di 25 °C.

5. Colorazione H&E del tessuto mucoso nasale

  1. Deceratura e idratazione: mettere le fette in xilene per 20 min, ripetere il processo per altri 20 min, etanolo assoluto per 5 min, ripetere questo passaggio per altri 5 min, alcol al 75% per 5 min, e infine, lavare per 5 min.
  2. Colorazione con ematossilina: erogare 100 μL di soluzione colorante con ematossilina (vedere Tabella dei materiali) per 3-5 minuti utilizzando una pipetta da 100 μL, risciacquare per 5-10 s, aggiungere 100 μL di etanolo acido cloridrico allo 0,5% per 10-30 s, risciacquare per 5-10 s, aggiungere 100 μL di acqua ammoniacale allo 0,2% per 10-30 s e risciacquare per 30 s.
    NOTA: Dopo la colorazione con ematossilina, è necessaria la differenziazione con etanolo acido cloridrico allo 0,5% per rimuovere il colorante ematossilico in eccesso legato al nucleo e assorbito dal citoplasma. Quando viene eseguita la colorazione con eosina, i nuclei e il citoplasma saranno chiaramente colorati. Le fette appariranno rosse o rosa dopo la differenziazione con etanolo acido cloridrico allo 0,5%, quindi risciacquare immediatamente dopo la differenziazione per rimuovere l'acido dalle fette di tessuto per arrestare la differenziazione. Quindi, utilizzare lo 0,2% di acqua ammoniacale per migliorare la colorazione nucleare.
  3. Colorazione con eosina: utilizzare una pipetta da 100 μL per erogare 100 μL di soluzione colorante con eosina (vedere la tabella dei materiali) per 5 minuti e risciacquare per 30 s.
  4. Disidratazione e sigillatura: immergere le fette in etanolo assoluto per 5 minuti, ripetere il processo per altri 5 minuti, ripetere ancora una volta per 5 minuti, dimetile per 5 minuti e xilene per 5 minuti. Infine, sigillare con resina neutra (vedi Tabella dei Materiali).
  5. Posizionamento della sezione colorata sul microscopio: posizionare la sezione colorata sul microscopio, regolare la messa a fuoco del microscopio fino a quando l'immagine non è chiaramente visibile, impostare l'ingrandimento su 40x e acquisire l'immagine.

6. Immunocolorazione multicolore del tessuto mucoso nasale

  1. Deceratura e idratazione: seguire le stesse indicazioni del punto 5.1.
  2. Trattamento tampone citrato-fosfato: mettere il tampone citrato-fosfato (pH 6,0) (vedi Tabella dei materiali) in un contenitore adatto al microonde. Scaldare fino a ebollizione, rimuoverlo e quindi aggiungere i vetrini al contenitore. Microonde a fuoco medio per 8 minuti fino a ebollizione, spegnere il fuoco per 8 minuti, quindi passare a fuoco medio-basso per 7 minuti.
    1. Dopo il raffreddamento naturale, trasferire le fette in PBS (pH 7,4), agitarle e lavarle tre volte con uno shaker decolorante, ogni volta per 5 min.
      NOTA: Assicurarsi che il tampone non evapori durante questo processo ed evitare che le fette si secchino.
  3. Bloccare la perossidasi endogena: asciugare le fette, tracciare un cerchio attorno al tessuto con una penna immunoistochimica (per evitare che l'anticorpo defluisca) e applicare una soluzione di perossido di idrogeno al 3% (acqua ossigenata: acqua pura = 1:9).
    1. Incubare a temperatura ambiente al buio per 15 min. Dopo il raffreddamento naturale, porre le fette in PBS (pH 7,4) e agitarle su uno shaker decolorante per tre cicli di 5 min ciascuno.
  4. Bloccante: applicare il siero di capra al 5% all'interno del cerchio e incubare per 30 min.
  5. Aggiunta di anticorpi primari: rimuovere delicatamente la soluzione bloccante, aggiungere FOXP3 (diluizione: 1:200, vedere la tabella dei materiali) alla fetta e porla in una camera umida. Incubare a 4 °C per una notte.
    NOTA: Aggiungere una piccola quantità d'acqua nella camera umida per evitare l'evaporazione degli anticorpi.
  6. Aggiunta di anticorpi secondari: porre le fette in PBS (pH 7,4) e agitarle su uno shaker decolorante per tre cicli di 5 minuti ciascuno. Asciugare delicatamente le fette e applicare l'anticorpo secondario (Goat Anti-Rabbit IgG H&L, vedi Tabella dei materiali) all'interno del cerchio. Incubare a temperatura ambiente per 50 minuti al buio.
  7. Preparazione della soluzione di diluizione di tiramide: combinare 100 μL di H 2 O2al 3% con 100 mL di 1x TBST (vedi tabella dei materiali).
  8. Aggiunta di soluzione di lavoro TSA: Miscelare 1 mL di diluente di tiramide con 2 μL di CY3-tiramide per preparare la soluzione di lavoro TSA. Applicare 100 μL di soluzione di lavoro TSA su ciascuna fetta e incubare a temperatura ambiente al buio per 10 minuti. Quindi, lavare le fette con PBS tre volte, 5 minuti ogni volta.
    NOTA: Preparare e utilizzare immediatamente la soluzione di lavoro TSA e conservarla al buio a 4 °C; È valido per un massimo di 24 ore.
  9. Ripetere i passaggi 6.2-6.8: passare a una diluizione 1:200 di RORγt (colorante fluorescente FICC) e poi a una diluizione 1:200 di TICAM1 (colorante TYP620) (vedi Tabella dei materiali).
  10. Nuclei controcolorati DAPI: agitare delicatamente le fette per asciugarle, applicare la soluzione colorante DAPI e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti al buio.
  11. Autofluorescenza di tempra: porre le fette in PBS (pH 7,4) e agitarle su uno shaker decolorante per tre cicli di 5 min ciascuno. Applicare il quencher di autofluorescenza (vedere Tabella dei materiali) sulle fette, attendere 5 minuti, quindi lavare per 10 minuti.
  12. Bloccaggio: porre le fette in PBS (pH 7,4) e agitarle su uno shaker decolorante per tre cicli di 5 min ciascuno. Agitare delicatamente le fette per asciugarle e sigillarle con il quencher antifluorescenza (vedi Tabella dei materiali).
  13. Microscopia: posizionare la sezione colorata sul microscopio, regolare la messa a fuoco del microscopio per una chiara visibilità, impostare l'ingrandimento su 20x e 40x e acquisire l'immagine.
    NOTA: DAPI ha una lunghezza d'onda di eccitazione UV di 330-380 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 420 nm (luce blu). FITC ha una lunghezza d'onda di eccitazione di 465-495 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 515-555 nm (luce verde). CY3 ha una lunghezza d'onda di eccitazione di 510-560 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 590 nm (luce rossa). TYP-690 ha una lunghezza d'onda di eccitazione di 630 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 690 nm (luce rosa).

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Risultati

Sei ratti SD sono stati indotti con successo nel modello AR attraverso l'iniezione intraperitoneale OVA e la sfida nasale. L'AR è stata indotta in tutti i ratti del gruppo AR, che rappresentavano il 100% del gruppo. Tutti i ratti del gruppo AR hanno mostrato sintomi tipici come starnuti, naso che cola e prurito al naso. Tutte le osservazioni comportamentali hanno ottenuto un punteggio di ≥5 punti (Tabella 2).

I risultati della colorazione H&E al 21° giorno di mo...

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Discussione

La rinite allergica (AR) è una malattia infiammatoria non infettiva della mucosa nasale derivante da una combinazione di fattori ambientali e genetici. È diventato un problema di salute globale, che ha un impatto sull'efficienza lavorativa, diminuisce la qualità della vita, compromette il sonno, la funzione cognitiva e causa irritabilità e affaticamento. L'AR colpisce il 10%-20% della popolazione mondiale¹ e comporta costi economici considerevoli, causando perdite annuali fino a 30-50 miliardi di euro nei paesi dell'UE

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento provinciale di scienza e tecnologia del Sichuan (2021YJ0175).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Al(OH)3Sollerbauer Biotechnology Co., LtdA7130
75% etanoloAnhui Yiren An Co., Ltd20210107
AmmoniacaChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2021070101
Etanolo anidroChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2022070501 Sigillante
di estinzione antifluorescenzaSouthernBiotech0100-01
Macchina di tintura automaticaThermo scientificVaristain Gemini ES
Carrier diapositiveNantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd220518001
Tampone citrato-fosfato Servicebio biotechnology co., LtdG1201
Soluzione di riparazione dell'antigene dell'acido citrico (PH 6.0)Xavier Biotechnology Co., LtdG1201
Vetrino coprioggettiNantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.
Vetrino coprioggettiNantong Mewtech Life Science Co., LtdCS01-2450
CY3-TyramideSawell Biotechnology Co., LtdG1223-50UL
DAPISawell Biotechnology Co., LtdG1012
Agitatore decoloranteSCILOGEXS1010E
Soluzione di decalcificazione EDTAWuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd
Essiccatoio elettrico a riscaldamento rapido Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240A
Macchina per marcatura di scatole da incassoThermo scientific  PrintMate AS
Macchina per l'inclusioneWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
Macchina per la disidratazione rapida dei tessutiThermo scientificSTP420 ES
Sigillante per filmThermo scientificAutostainer 360
FITC-TyramideSawell Biotechnology Co., LtdG1222-50UL
Microscopio a fluorescenzaSunny Tecnologia ottica Co.LtdCX40
Foxp3Affinity Biosciences Co., Ltdbs-10211R
Tavolo di congelamentoWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-L5
Capra Anti-coniglio IgG H& L (HRP)Liankebio Co., LtdGAR0072
Siero di capraBiosharpBL210A
H& Kit di colorazione ELeageneDH0020
Pinze emostaticheShanghai Medical Devices Co., LtdJ31010
Acido cloridricoSichuan Xilong Science Co., Ltd210608
Penna immunoistochimicaBiosharpBC004
Forno a microondeMideaM1-L213B
Gomma neutraSinopharm Group Reagente chimico Co., Ltd10004160
OvoalbuminaSollerbauer Biotechnology Co., LtdA804010
FornoShanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240A
Centrifuga palmareSCILOGEXD1008E
ParaformaldeideBeyotime Biotechnology Co., LtdP0099-100ml
Scanner della sezione di patologia3DHISTECH KftPannoramic SCAN 
tampone PBSBiosharpG4202
Pipette DragoKE0003087/KA0056573
Rorγ tAffinity Biosciences Co., LtdDF3196
ScalpelQuanzhou Excellence Medical Co., Ltd20170022
Agente estinguente autofluorescente Sudan Black BBioengineering Co., LtdA602008-0025
AffettatriceThermo scientificHM325
AffettatriceThermo scientificHM325
SlideNantong Mewtech Life Science Co., LtdPC2-301
Sprague Dawley rattsSichuan Academy of Traditional Chinese MedicineSYX figure-materials-1 2023-0100
TICAM-1Affinity Biosciences Co., LtdDF6289
Forbici per tessutiShanghai Medical Devices Co., LtdJ22120
Macchina per teglie per spalmare tessutiWuhan Junjie Electronics Co., LtdJK-6
TYR-690 coloranti fluorescentiShanghai Rutron Biotechnology Co., LtdRC0086-34RM
Miscelatore a vorticeSCILOGEXSLK-O3000-S
acquaWuhan Junjie Electronics Co., LtdJK-6
TagliaceraWuhan Junjie Electronics Co., LtdJXL-818
XyleneChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2022051901
220518001CR2203047 Essiccatore a bagno-scivolo ad

Riferimenti

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