Un metodo comportamentale versatile per studiare gli effetti dell'ormone tiroideo sulla funzione cerebellare

Summary

Qui presentiamo un protocollo per un test comportamentale versatile sviluppato di recente, il ladder beam test. Questo test ha il vantaggio di rilevare una sottile atassia cerebellare causata da un difetto dell'azione dell'ormone tiroideo nel sistema nervoso centrale rispetto ai test comportamentali convenzionali che valutano le prestazioni motorie.

Abstract

L'azione dell'ormone tiroideo (TH) è essenziale durante lo sviluppo del sistema nervoso centrale, compreso il cervelletto. In caso di deficit di TH nei primi anni di vita, come l'ipotiroidismo congenito, i pazienti mostrano disturbi neurologici come ritardo cognitivo e deficit motori. Esistono vari studi che utilizzano modelli murini con deficit di TH tessuto-specifico o cellulare per studiare il ruolo di TH nel cervelletto. Rispetto ai topi ipotiroidei congeniti generalizzati, i topi con deficit di TH specifico delle cellule cerebellari mostrano caratteristiche atassiche più lievi e sottili, rendendo difficile la valutazione della funzione motoria quando si utilizzano test convenzionali come il test rotarod.

A causa della necessità di uno strumento alternativo per valutare la funzione motoria nei modelli animali correlati al TH, abbiamo sviluppato un metodo comportamentale versatile chiamato "ladder beam test", in cui possiamo progettare i vari test ladder a seconda della gravità dell'atassia nei topi modello. Abbiamo utilizzato topi transgenici che esprimono un recettore TH dominante-negativo specificamente nella cellula cerebellare di Purkinje, un unico neurone di uscita nella corteccia cerebellare che modula le prestazioni motorie. Il test del raggio a scala di nuova costruzione ha rilevato con successo robuste compromissioni delle prestazioni motorie nei topi transgenici a un livello maggiore rispetto al test del rotarod. L'interruzione dell'apprendimento motorio è stata rilevata anche nel test della trave a scala ma non nel test del rotarod. Il protocollo con questo nuovo apparato comportamentale può essere applicato ad altri modelli animali che possono mostrare un lieve fenotipo atassico per esaminare sottili cambiamenti nella funzione cerebellare.

Introduction

L'ormone tiroideo (TH) è indispensabile per lo sviluppo del cervello¹. In particolare, il suo ruolo nel cervelletto è fondamentale perché il deficit di TH nei primi anni di vita causa uno sviluppo cerebellare aberrante ^1,2. Ad esempio, nell'ipotiroidismo congenito, i pazienti presentano una serie di ritardi neurologici che includono deficit cognitivi e motori³. Per svelare il ruolo dell'TH nello sviluppo funzionale cerebellare, alcuni studi hanno limitato la carenza di TH in modo specifico per le cellule cerebellari⁴. Tuttavia, rispetto ai topi ipotiroidei congeniti generalizzati, in cui tutti i tessuti e le cellule sono affetti da deficit di TH, tali modelli cerebellari specifici mostrano un'atassia così sottile che i test comportamentali convenzionali, come i test di rotarod, impronta e trave di equilibrio, rilevano a malapena le differenze. Pertanto, per studiare a fondo gli effetti della TH sulla funzione cerebellare, è necessario un nuovo strumento di valutazione per rilevare un sottile cambiamento nella coordinazione motoria dei topi modello.

Il test del rotarod è lo strumento più comune per valutare la coordinazione motoria, originariamente sviluppato da Dunham e Miya⁵ e successivamente applicato a una versione accelerata da Jones e Roberts⁶. La latenza di caduta dall'asta rotante è interpretata come il test per la coordinazione motoria, e la sua semplicità e concisione lo rendono comunemente usato tra i ricercatori comportamentali che studiano la funzione motoria⁷. Tuttavia, la facilità d'uso di questo test è un'arma a doppio taglio. Poiché l'asta ruota automaticamente, i topi possono aggrapparsi e rimanere sull'asta rotante senza muoversi. Inoltre, i topi potrebbero avere l'intenzione di cadere piuttosto che rimanere in equilibrio sull'asta rotante. In entrambe le situazioni, la validità e l'affidabilità del test sono discutibili per valutare la "coordinazione motoria pura"⁷. In altre parole, non mira con precisione alla funzione cerebellare e coinvolge altri fattori come la forza muscolare per la presa.

Al posto degli strumenti convenzionali per la valutazione della coordinazione motoria, qui presentiamo un nuovo test comportamentale chiamato "ladder beam test", che è stato recentemente sviluppato nel nostro laboratorio. Il test di camminata con scala orizzontale è stato progettato per valutare le complesse capacità motorie correlate al cervelletto: previsione feed-forward e integrazione del movimento⁸. Il dispositivo di prova era composto da quattro pezzi di plexiglass con fori (Figura 1). Le quattro piastre erano collegate in parallelo da viti e bastoncini inseriti nei fori delle piastre. Due piastre esterne sono state utilizzate per stabilizzare il dispositivo e due piastre interne sono state utilizzate per progettare i vari tipi di pioli della scala (Figura 2C). La larghezza del piolo è stata regolata in base alle dimensioni dell'animale per ridurre al minimo il movimento all'indietro degli animali (Figura 2B). La distanza dal punto di partenza alla porta era di 110 cm. Il dispositivo è stato posizionato a 60 cm sopra la panca e un cuscino di sicurezza è stato posizionato sotto il dispositivo (Figura 2A). La camera oscura è stata messa vicino all'obiettivo per motivare gli animali a muoversi verso l'obiettivo (Figura 2A).

Abbiamo esaminato gli effetti del TH sullo sviluppo funzionale cerebellare utilizzando topi transgenici che esprimono il recettore TH dominante-negativo (TR) nelle cellule cerebellari di Purkinje (topi Mf-1/FVB). Sia nel rotarod che nel ladder beam test, abbiamo osservato il fenotipo atassico cerebellare nei topi Mf-1/FVB; tuttavia, il test del fascio a scala è riuscito a rilevare differenze più significative rispetto al test del rotarod (Figura 3). Inoltre, la capacità di apprendimento motorio può essere valutata in modo più approfondito nel test del fascio a scala (Figura 3B, C). Come sfondo cellulare di un tale fenotipo comportamentale, l'induzione della depressione a lungo termine (LTD) è stata inibita e, invece, il potenziamento a lungo termine (LTP) è stato indotto a seguito di una stimolazione induttiva LTD nelle cellule di Purkinje Mf-1/FVB⁹. La LTD è essenziale per la coordinazione motoria e l'apprendimento motorio nel cervelletto¹⁰. Molti studi hanno riportato deficit motori e inibizione di LTD in topi knockout o mutati per geni regolatori chiave nella funzione cerebellare, tuttavia, nessuno studio ha mai riportato l'induzione di LTP a seguito di una stimolazione induttiva LTD^11,12. Nel complesso, questo fenomeno può essere unico per i topi Mf-1/FVB o per i topi carenti di TH (lo stesso fenomeno è stato osservato nei topi ipotiroidei ad esordio adulto), suggerendo che la TH regola la funzione cerebellare in modo diverso dalle altre proteine chiave. Se è così, è plausibile che i topi con azione TH anormale non mostrino atassia cerebellare allo stesso modo degli altri topi modello. Ciò sottolinea ancora una volta la necessità di un metodo specifico per valutare gli effetti dell'TH sulla funzione cerebellare. Questo articolo presenta un nuovo protocollo per studiare gli effetti della TH sulla funzione cerebellare utilizzando il test del fascio a scala di nuova costruzione.

Protocol

Il protocollo di sperimentazione animale nel presente studio è stato approvato dal Comitato per la cura e la sperimentazione animale dell'Università di Gunma. Tutte le procedure per la cura e il trattamento degli animali sono state eseguite secondo la legge giapponese sul benessere e la gestione degli animali e le linee guida per la corretta conduzione degli esperimenti sugli animali emesse dal Consiglio scientifico del Giappone. Il disegno di montaggio dell'apparecchio è riportato nella Figura 1.

1. Configurazione della scala

1. Test della scala orizzontale (Figura 2C a sinistra)
   1. Inserire i bastoncini di alluminio (2 mm di diametro) nei fori sulle pareti in plexiglass.
      NOTA: La distanza dell'intervallo varia in base alle dimensioni del corpo a seconda del ceppo o del sesso del topo testato (vedere la Tabella 1).
   2. Regolare la larghezza dei pioli della scala allargando o restringendo la distanza delle pareti in plexiglass.
      NOTA: La larghezza può variare in base alle dimensioni del corpo a seconda della varietà o del sesso del mouse testato (vedere la Tabella 1).
2. Test della scala a zigzag (Figura 2C a destra)
   1. Inserire bastoncini di alluminio (diametro 2 mm) ogni terzo foro in direzione orizzontale e verticale sulle pareti in plexiglass.
      NOTA: La distanza dell'intervallo varia in base alle dimensioni del corpo a seconda del ceppo o del sesso del mouse testato (vedere la Tabella 1).
   2. Regolare la larghezza dei pioli della scala allargando o restringendo la distanza delle pareti in plexiglass.
      NOTA: La larghezza può variare a seconda delle dimensioni del corpo, della tensione o del sesso del mouse testato (vedere la Tabella 1).
   3. Posiziona la camera oscura nel sito bersaglio.
   4. Posizionare il cuscino (può essere costituito da un sacchetto di plastica imbottito con materiali tampone) 30 cm sotto la configurazione della scala per sicurezza.

2. Assuefazione (Giorno 0)

NOTA: Si consiglia di impiegare almeno 1 giorno per abituare i mouse alla configurazione della scala.

1. Posiziona il mouse sul bordo della scala (punto di partenza).
2. Usando un soffio d'aria, incoraggia il mouse a muoversi in avanti sul piolo della scala.
3. Ripeti fino a quando il topo non si abitua a camminare sui pioli della scala.

3. Misurazione delle prestazioni motorie

1. Posiziona il mouse sul bordo della scala (punto di partenza).
2. Registrare il tempo necessario per completare l'attraversamento della scala e il numero di scivolamenti dei piedi quando i topi non riescono a posizionare le zampe o scivolano dopo il posizionamento sui bastoncini di alluminio (vedere la Figura 2D). Se possibile, registra il video per controllare i passi falsi in seguito.
3. Dopo un intervallo di 15 minuti, ripetere la misurazione (4-5 prove al giorno).
4. Ripeti l'esperimento per 3-4 giorni per valutare l'apprendimento motorio.

4. Analisi

1. Calcola il valore medio del tempo e degli scivolamenti dei piedi al giorno.
2. Confrontare il valore medio tra i gruppi.

Results

Nel test rotarod, i topi Mf-1/FVB hanno mostrato una significativa diminuzione della latenza di caduta dall'asta rotante per 3 giorni consecutivi rispetto ai topi wildtype, indicando una compromissione della coordinazione motoria (Figura 3A). Tuttavia, in termini di risultati all'interno del gruppo, i topi Mf-1/FVB hanno migliorato significativamente le loro prestazioni dal giorno 1 al giorno 3, suggerendo la conservazione dell'apprendimento motorio (

Discussion

Il nostro progetto si è basato sullo studio precedente di Metz e Whishaw, che hanno riportato l'utilità del "test di camminata a pioli"^13,14. Hanno progettato il test di deambulazione a pioli per valutare l'abilità di camminare e misurare il posizionamento, il passo e la coordinazione tra gli arti anteriori e posteriori, richiedendo agli animali di camminare da un punto di partenza a un obiettivo su una scala orizzontale

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soffio d'aria	DAISO
Bastoncini in alluminio	CAINZ		diametro 2 mm, il numero di bastoncini può variare a seconda del design della scala. Potrebbero essere necessari circa 30 bastoncini per costruire la scala orizzontale (intervallo di 4 cm).
Blutack	Bostik
Plexiglass	CAINZ		110 cm x 20 cm, 110 cm x 10 cm, 2 parti ciascuno
Viti	CAINZ