Articolo metodologico

Raccolta sul campo e identificazione di routine in laboratorio di Rhodiola crenulata

DOI:

10.3791/65947

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27 ottobre 2023

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1School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Meishan Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Qui descriviamo l'identificazione della Rhodiola Crenulata dall'habitat, dalla morfologia della pianta, dalle proprietà medicinali, dalle caratteristiche microscopiche e dalla cromatografia su strato sottile.

Abstract

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L'identificazione dei materiali medicinali è la premessa e la garanzia della sicurezza del farmaco. La maggior parte dei ricercatori scientifici è destinata a favorire il processo di identificazione semplice, veloce, efficace ed economico delle erbe. La Rhodiola crenulata è una medicina tradizionale tibetana coltivata ad alta quota, distribuita principalmente nelle regioni cinesi del Tibet, dello Yunnan e del Sichuan. La Rhodiola crenulate possiede molteplici bioattività, come proprietà antinfiammatorie, antiipossia e antiossidanti, e ha un grande potenziale di sviluppo. Con la crescente domanda del mercato e una rapida diminuzione del contenuto di risorse, un gran numero di prodotti confusi di Rhodiola crenulata hanno preoccupato le persone. Pertanto, questo protocollo introduce un processo standard per l'identificazione della Rhodiola crenulata sul campo combinato con test di laboratorio di routine. La combinazione di habitat, caratteristiche microscopiche e cromatografia su strato sottile identificherà senza dubbio la Rhodiola crenulata in modo rapido, efficiente ed economico, contribuendo al continuo sviluppo della medicina tibetana e al controllo della qualità dei materiali medicinali.

Introduzione

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L'erboristeria ha una lunga storia e una ricca esperienza applicativa in Cina, ed è stata la prima registrazione sistematica nel classico erboristico1 di Shennong. La scoperta dell'artemisinina applicata alla malaria ha promosso lo sviluppo della fitoterapia in un nuovo stadio1. L'uso della moderna tecnologia scientifica per scoprire l'esatto meccanismo della fitoterapia aumenta il tasso di utilizzo e la domanda di fitoterapia, aprendo un nuovo mercato internazionale per essa 2,3,4. Tuttavia, questo ha portato a una serie di effetti negativi. I non professionisti hanno una vaga comprensione delle caratteristiche della fitoterapia, il che rende l'uso della fitoterapia un enorme rischio per la sicurezza5.

La Rhodiola crenulata, una delle piante della specie Rhodiola, è distribuita principalmente in Tibet, nello Yunnan nord-occidentale e nel Sichuan occidentale della Cina (Figura 1)6,7. La Rhodiola crenulata comprende salidroside, tirosolo, acido gallico e altri composti per il trattamento delle malattie legate all'ipossia attraverso la funzione di "tonificare il qi e promuovere la circolazione sanguigna, eliminare il polso e calmare l'asma"8,9,10,11. L'indagine sul campo mostra che la Rhodiola crenulata può essere trovata nelle zone alpine dell'astragalo, nei pendii dei canaloni e nelle fessure rocciose ad un'altitudine di 4.000-5.600 m. Il suo ambiente di crescita è freddo, pieno di sole e radiazioni intense, e appartiene all'ecosistema dei prati alpini. La Rhodiola crenulata può essere distribuita in popolazioni lamellari e puntiformi in base al terreno di crescita e il flusso genico può essere effettuato attraverso l'impollinazione incrociata.

L'aborto pollinico del genere Rhodiola, l'illegalità degli scavi e la degenerazione dell'ambiente ecologico fanno della Rhodiola crenulata una specie in via di estinzione 6,12. In considerazione dell'elevato valore medicinale della Rhodiola crenulata, si prevede che i prodotti contraffatti entreranno nel mercato. Questo articolo presenta l'habitat della Rhodiola crenulata e alcuni metodi di identificazione in laboratorio. In primo luogo, abbiamo osservato l'ambiente di crescita della Rhodiola crenulata e le sue proprietà medicinali. In secondo luogo, la microstruttura della polvere medicinale è stata osservata al microscopio. L'ultimo passaggio è il punto chiave. I componenti rappresentativi della Rhodiola crenulata sono stati separati e identificati in base alle diverse proprietà di adsorbimento o dissoluzione di questi componenti in una determinata sostanza. L'autenticazione basata sul DNA o i metodi di analisi metabolomica delle piante medicinali sono complicati e costosi13. Questi metodi di base, convenienti ed economici possono identificare rapidamente la Rhodiola crenulata.

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Protocollo

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La Rhodiola crenulata è raccolta dalla Zhuoda Snow Mountain, Contea di Ganzi, Prefettura autonoma tibetana di Ganzi, Provincia di Sichuan, Cina (N 31.44570°, E 99.96086°, 4892 m). Le piante sono autenticate come autentiche dal professor Yi Zhang presso la Scuola di Medicina Etnica dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu.

1. Raccolta di Rhodiola crenulata

  1. Fotografa la mappa dell'habitat di Rhodiola crenulata.
  2. Fotografa l'intera pianta, le foglie, il calice e il rizoma di Rhodiola crenulata.
  3. Utilizzare una vanga per eliminare le erbacce e le pietre rotte entro 1 m dalla Rhodiola crenulata per garantire la successiva estrazione senza intoppi.
  4. Scava il terreno con una zappa fino a quando non si vede l'intera rizosfera e raccogli il fittone.
    NOTA: Le radici e i rizomi di Rhodiola crenulata utilizzati nelle parti medicinali devono essere raccolti in autunno, quando gli steli dei fiori appassiscono.

2. Identificazione delle caratteristiche

  1. Osserva i tratti dell'aspetto della Rhodiola crenulata ad occhio nudo: fittoni e rizomi cilindrici e corti, superficie marrone, epidermide gialla membranosa con motivo rosa e fette rosso-arancio o bordeaux.
  2. Identificalo dall'odore: dà un odore fragrante quando è vicino al naso.
  3. Identificalo in base al gusto: prendi un pezzetto di radice in bocca, prima sorseggia e poi mastica, assaggia leggermente amaro, poi dolce.

3. Identificazione microscopica dei granuli di amido nella polvere medicinale

  1. Rimuovere il terriccio dalla superficie della Rhodiola crenulata con un pennello, infornare a 40 °C e girare le erbe ogni 24 ore.
    NOTA: La facilità di rottura dei materiali medicinali è considerata lo standard per l'essiccazione dell'umidità.
  2. Polverizzare i medicinali essiccati con una macchina per polveri e filtrare i medicinali con il setaccio medicato n. 3 (vedi Tabella dei materiali).
  3. Prendere un vetrino pulito (vedi Tabella dei materiali), scavare la polvere con un ago da dissezione (vedi Tabella dei materiali) e posizionarla uniformemente a un terzo del vetrino entro 2 mm.
  4. Utilizzare un contagocce di vetro (vedi Tabella dei materiali) per aggiungere una goccia di acqua deionizzata alla polvere. Utilizzare una pinzetta (vedere la tabella dei materiali) per tenere un'estremità del vetro di copertura (vedere la tabella dei materiali) per toccare rapidamente il livello del liquido e coprire la polvere.
    NOTA: Utilizzare un ago anatomico per mescolare delicatamente acqua e polvere medicinale per garantire una miscelazione uniforme del campione. Non dovrebbero esserci bolle d'aria tra il vetrino, la polvere e il vetro di copertura.
  5. Aprire il microscopio (vedere la tabella dei materiali) e posizionare il vetrino al punto 3.4 sulla piattaforma per fissarlo. Regolare la sorgente luminosa e la spirale di messa a fuoco grossolana per vedere la polvere. Regolare la spirale parafocale fine fino a quando i tessuti non sono chiaramente visibili. Passa a un obiettivo 40x e osserva i granuli di amido.
    NOTA: Amidare i grani che si presentano come grani singoli o multipli e il punto ombelicale appare a spina di pesce o a forma di crepa.

4. Identificazione microscopica di cateteri, cellule di sughero, fibre, cellule del parenchima del legno e masse di pigmento in polvere medicinale

  1. Prendi un vetrino pulito (vedi Tabella dei materiali), scava la polvere con un ago da dissezione (vedi Tabella dei materiali) e posizionalo a un terzo del vetrino.
  2. Utilizzare un contagocce di vetro (vedi Tabella dei materiali) per aggiungere una goccia di cloralio idrato (vedi Tabella dei materiali) alla polvere. Prendere il vetrino con una pinzetta (vedi Tabella dei materiali) e riscaldarlo nella lampada ad alcool tre volte, ogni volta per 1 s.
    NOTA: Le bolle devono essere evitate durante il riscaldamento. Il liquido rimane scorrevole, indicando che la penetrazione è completa.
  3. Utilizzare un contagocce di vetro per aggiungere una goccia di glicerina (vedi Tabella dei materiali). Usa una pinzetta per tenere un'estremità del vetro di copertura per toccare rapidamente il livello del liquido.
  4. Aprire il microscopio e posizionare il vetrino sulla piattaforma per fissarlo. Regolare la sorgente luminosa e la spirale di messa a fuoco grossolana per vedere la polvere. Regolare la spirale parafocale fine fino a quando i tessuti non sono chiaramente visibili. Osserva il catetere, le cellule di sughero, le fibre, le cellule del parenchima del legno e il blocco di pigmento passando a una lente dell'obiettivo 40x.
    NOTA: Poligonale o poligonale lungo di celle di sughero, vaso a spirale con evidente struttura elicoidale, parenchima xilematico contenente cristalli di sabbia di ossalato di calcio e blocco di pigmento rosso o rosso-brunastro.

5. Preparazione di campioni cromatografici su strato sottile (TLC) di Rhodiola crenulata e suo riferimento

  1. Posizionare la carta per pesare sulla bilancia (vedi Tabella dei materiali) e pesare 3 g di polvere di Rhodiola crenulata.
  2. Versare la polvere in un flacone conico da 100 mL (vedere la Tabella dei materiali) e aggiungere 25 mL di metanolo con una pipetta a pancia grande (vedere la Tabella dei materiali). Inserire il flacone conico nello strumento ad ultrasuoni. Impostare la potenza a 250 W, la frequenza a 40 kHz e il tempo a 30 min (vedere la tabella dei materiali) e accendere lo strumento.
    NOTA: Lo scopo dello strumento ad ultrasuoni è quello di garantire che la polvere di Rhodiola crenulata sia completamente disciolta senza alterare i risultati dei successivi esperimenti cromatografici su strato sottile.
  3. Rimuovere il flacone conico e sciacquare il flacone esterno con acqua corrente a temperatura ambiente (RT).
  4. Aspirare 800 μL di liquido preparato nella fase 5.3 con una siringa da 1 mL. Filtrare con membrana filtrante microporosa da 0,22 μm (vedere Tabella dei materiali) e raccogliere 400 μL di soluzione di campione midstream di Rhodiola crenulata in un flacone per campioni cromatografici.
  5. Pesare e aggiungere 2 mg di salidroside, tirosolo e acido gallico (vedere Tabella dei materiali) in 3 flaconi conici separati da 100 ml, rispettivamente. Aggiungere 25 ml di metanolo con una pipetta a pancia grande in ogni flacone conico.
  6. Inserire il flacone conico nello strumento a ultrasuoni, impostare la potenza su 250 W, la frequenza su 40 kHz e il tempo su 30 min, quindi ripetere il passaggio 5.3 (vedere la tabella dei materiali).
  7. Aspirare 800 μL di liquido preparato nella fase 5.6 con una siringa da 1 mL. Filtrare con membrana filtrante microporosa da 0,22 μm (vedere la tabella dei materiali) e raccogliere 400 μL di soluzione standard di salidroside, tirosolo e acido gallico in corrispondenti flaconi per campioni cromatografici.

6. Identificazione TLC

  1. Pipettare triclorometano (5 mL), acetato di etile (4 mL), metanolo (2 mL) e acido formico (0,5 mL) (vedere Tabella dei materiali). Aggiungere su un lato del cilindro per cromatografia a doppio serbatoio (vedere Tabella dei materiali), agitare e mescolare uniformemente. Coprire la testata superiore.
  2. Posizionare l'acido gallico, il salidroside, la soluzione standard di tirosolo e la soluzione di Rhodiola crenulata sul rack dei campioni nelle posizioni A1-A4.
  3. Posizionare il foglio di silicone di 5 cm x 10 cm (vedi Tabella dei materiali) sul tavolo di campionamento. Avviare la macchina di campionamento automatica (vedere la tabella dei materiali) e aprire la valvola di controllo dell'aria.
  4. Aprire il software visionCATS (vedere la tabella dei materiali). Fare clic su Nuova > Nuova cartella (denominata Rhodiola crenulata sample test) > OK. Fare clic su Nuovo metodo (nome Rhodiola crenulata sample test) > OK > ATS 4.
  5. Fare clic su Termina definizione passo. Fare clic su Traccia assegnazione per modificare la descrizione (campione di acido gallico, salidroside, tirosolo e Rhodiola crenulata ).
  6. Fare clic su Passaggi HPTLC. Impostare i parametri dello strato sottile (5 cm x 10 cm). Selezionare Tipo di applicazione (banda), impostare i parametri (Tabella 1) e fare clic sul pulsante OK .
  7. Qualità di riempimento/risciacquo aperta. Selezionare Riempi solo volume programmato. Impostare il livello inferiore del flaconcino (mm) su 0,5 e fare clic sul pulsante OK.
  8. Fare clic su Esegui metodo.
  9. Fare clic sul pulsante Traccia assegnazione , selezionare Centro e impostare i parametri (Tabella 2).
  10. Fare clic sul pulsante Continua per il campionamento automatico.
  11. Spegnere la macchina di campionamento automatico e la valvola dell'aria. Rimuovere il foglio di silicone dalla campionatrice automatica.
  12. Mettere il foglio di silicone sull'altro lato del cilindro per cromatografia a doppio serbatoio nel passaggio 6.1, coprire la testa del cilindro superiore e presaturare per 20 minuti.
  13. Fissare delicatamente l'estremità superiore della piastra a strato sottile con una pinzetta, inserire rapidamente il foglio di silicone nell'agente di sviluppo e coprire la testa del cilindro superiore.
    NOTA: Estrarre il foglio di silicone quando il bordo anteriore che si apre si trova a 0.5-1.0 cm di distanza dall'estremità superiore della piastra a strato sottile.
  14. Dopo che il solvente organico è evaporato, spruzzare la soluzione cromogenica sulla superficie del foglio di silicone a temperatura ambiente per ottenere risultati cromogenici.
    NOTA: La soluzione cromogenica è una soluzione acquosa contenente il 2% di FeCl3 e l'1% di K3[Fe(CN)6].

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Risultati

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Questo protocollo sperimentale descrive l'identificazione e la raccolta della Rhodiola crenulata sul campo. La Rhodiola crenulate tende a vivere nelle zone alpine, nei pendii dei canaloni e nelle fessure rocciose ad alta quota. L'habitat, la pianta intera, il fiore e le foglie della Rhodiola crenulate possono essere mostrati nella Figura 2. La Rhodiola crenulate ha un rizoma bruno-rossastro (Figura 3A). Un'immagine rappresenta...

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Discussione

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Ci sono più di 90 specie di piante di Rhodiola nel mondo e più del 60% di tutte le specie si trovano in Cina, quelle comuni tra cui Rhodiola crenulata, Rhodiola rosea, Rhodiolas achalinensis e Rhodiola algida17. La Rhodiola crenulata, registrata nella prima parte della Farmacopea Cinese (2020), è una medicina tradizionale tibetana coltivata ad alta quota. La domanda del mercato per la Rhodiola crenulata aumenta di anno in anno, quindi garantire il corr...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81973569, 82274207 e 82104533), dallo Xinglin Scholar Research Promotion Project dell'Università di Chengdu di MTC (XKTD2022013) e dal Key Research and Development Program di Ningxia (2023BEG02012).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,22 μ m Filtro MilliporeMilliporeSLGP033RB
Campionatore automaticoCAMAGATS 4
Cloralio idratoFuzhou Brunei Technology Co., LtdST1002
Cromatografico  campione  bottiglieZhejiang ALWSCI Technology Co., LtdC0000008
Pallone conicoSichuan Shubo Co., Ltd1121
Coperchio in vetroCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd10211818c
Ago da dissezioneShanghai Bingyu Fluid Technology Co., LtdBY-5026
Bilancia elettronicaSHIMADZUATX124
Acetato di etileChengdu Kelong Chemical Co., Ltd2022120901
Acido formicoChengdu Kelong Chemical Co., Ltd2021110801
Acido gallicoChengdu Herbpurify Co., LtdM-017
GlycerolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10010618
Frantoio ad alta velocitàBeijing Zhongxingweiye Instrument Co., LtdFW-100
MetanoloChengdu Kelong Chemical Co., Ltd20230108
MicroscopioChongqing Oprec Nistrument Co.,  LtdB203
Vetrino per microscopioCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd7105P-G
FornoShanghai Yuejin Medical Equipment Co., LtdDHG-8145
Setaccio per farmacopeaHangzhou Xingrun setaccio fabbrica572423281330
PipettaChangde BKMAM Biotechnology Co., Ltd120302008
SalidrosideChengdu Herbpurify Co., LtdH-040
Serbatoio saturo Yancheng Liegu Technology Co., Ltd10*20 P-1
Piastra in gel di siliceYantai Jiangyou Silica Gel Development  Co., LtdHSG20211227
TriclorometanoChengdu Kelong Chemical Co., Ltd20221013-1
Pinzetta Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd130302027
TyrosolChengdu Herbpurify Co., LtdL-042
Apparecchiature ad ultrasuoniNingbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., LtdSB-8200DTS
Pipetta volumetricaChangde BKMAM Biotechnology Co., Ltd120301006

Riferimenti

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