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Articolo metodologico

Induzione della plasticità a lungo termine dell'eccitabilità neuronale intrinseca nei neuroni del nucleo genicolato laterale dorsale

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DOI:

10.3791/65950

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20 settembre 2024

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1Unité de Neurobiologie des canaux Ioniques et de la Synapse (UNIS), UMR1072, INSERM, Aix-Marseille University

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo un protocollo per indurre la plasticità a lungo termine dell'eccitabilità intrinseca neuronale nei neuroni relè dal nucleo genicolato laterale dorsale mantenuto in fette di cervello ex vivo.

Abstract

Il nucleo genicolato laterale dorsale (dLGN) è stato a lungo ritenuto un relè di base per le informazioni visive che viaggiano dalla retina alle aree corticali, ma recenti scoperte suggeriscono una plasticità funzionale ampiamente sottovalutata delle cellule principali dLGN. Tuttavia, i meccanismi cellulari che supportano questi cambiamenti non sono stati completamente esplorati. Qui, riportiamo un protocollo per indurre il potenziamento a lungo termine dell'eccitabilità neuronale intrinseca (LTP-IE) nelle cellule dorsali dLGN relay da fette cerebrali acute di giovani ratti. La plasticità intrinseca è generalmente indotta in parallelo con la plasticità sinaptica. Tuttavia, nei neuroni dLGN, LTP-IE è indotto in modo affidabile da un'attività di picco a una frequenza di 40 Hz per 10 minuti. LTP-IE nei neuroni relè dLGN è di lunga durata in quanto può essere seguito fino a 40 minuti dopo il protocollo di induzione. In conclusione, i risultati di questo studio forniscono la prima evidenza dell'induzione di plasticità intrinseca nelle cellule relè dLGN, sottolineando così ulteriormente il ruolo dei neuroni talamici nella plasticità visiva dipendente dall'attività.

Introduzione

L'obiettivo generale di questo documento è fornire un modo semplice per indurre una plasticità duratura dell'eccitabilità neuronale nei neuroni talamici visivi del ratto in vitro, utilizzando la modalità standard current-clamp della tecnica patch clamp1,2. La logica alla base dello sviluppo di questa tecnica è la sua semplicità e riproducibilità. Il vantaggio rispetto alle tecniche alternative, come la stimolazione di input sinaptici abbinati o meno a potenziali d'azione postsinaptici erogati con una data tempistica, è la sua affidabilità.

Si pensa tradizionalmente che la plasticità nel sistema visivo si esprima esclusivamente a livello corticale, mentre il nucleo genicolato laterale dorsale (dLGN), una struttura primaria ricevente di input retinici a livello talamico, è tradizionalmente considerato solo un relè di informazioni visive3. Tuttavia, questa conclusione iniziale è stata messa in discussione da lavori recenti che indicano che questa visione semplicistica non regge più a lungo4,5,6. Ad esempio, deficit funzionali nella risposta visiva sono già stati osservati nei pazienti ambliopici allo stadio LGN7. Inoltre, un'ampia percentuale di neuroni relè dLGN in un dato territorio monoculare riceve input da ciascun occhio, indicando una potenziale binocularità per una grande percentuale di neuroni dLGN8,9,10. Inoltre, la deprivazione monoculare produce un cambiamento significativo nella dominanza oculare nei neuroni dLGN5,11,12.

Tra i meccanismi di plasticità funzionale che possono verificarsi nello spostamento della dominanza oculare, la plasticità dell'eccitabilità neuronale intrinseca è un potenziale candidato. Infatti, molte regioni del cervello, comprese le aree visive, esprimono plasticità intrinseca a seguito di vari compiti comportamentali13,14. È stata segnalata plasticità intrinseca a lungo termine nei neuroni centrali in seguito alla stimolazione degli input afferenti del glutammato15,16,17,18, attività di picking19,20, stimolazione sensoriale21 o successiva attività o deprivazione sensoriale20,22,23. Qui, descriviamo un protocollo che consente l'induzione del potenziamento a lungo termine dell'eccitabilità intrinseca (LTP-IE) nei neuroni relè dLGN a seguito di attività di picco a una frequenza di 40 Hz. La frequenza di attivazione di 40 Hz corrisponde a una frequenza osservata nella maggior parte dei neuroni dLGN in vivo dopo stimolazione visiva24,25.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo le linee guida europee e istituzionali (Direttiva del Consiglio 86/609/CEE e Consiglio Nazionale delle Ricerche francese e approvate dall'autorità sanitaria locale (Servizi Veterinari, Prefettura delle Bocche del Rodano, Marsiglia)).

1. Animali

  1. Condurre esperimenti utilizzando ratti Long Evans di 19-25 giorni di entrambi i sessi (di peso compreso tra 50 e 90 g).
  2. Ospita gli animali in gabbie di plastica convenzionali, insieme alla madre e alla cucciolata. Mantenere costante la temperatura con un ciclo luce/buio di 12 ore e accesso ad libitum ad acqua e cibo.

2. Fette acute di dLGN di ratto

  1. Preparare soluzioni di taglio/recupero e registrazione extracellulare.
    1. Per preparare la soluzione di taglio/recupero, mescolare 92 mM di n-metil-D-glutammina, 30 mM di NaHCO3, 25 mM di D-glucosio, 10 mM di MgCl2, 2,5 mM di KCl, 0,5 mM di CaCl2, 1,2 mM di NaH2PO4, 20 mM di Hepes, 5 mM di ascorbato di sodio e 3 mM di piruvato di sodio e far bollire a bolle il 95%di O 2-5% di CO2 (pH 7,4). Mantenere fredda la soluzione di taglio durante la procedura di affettatura.
    2. Preparare la soluzione di registrazione (liquido cerebrospinale artificiale, ACSF) miscelando 125 mM di NaCl, 26 mM di NaHCO3, 2 mM di CaCl2, 2,5 mM di KCl, 2 mM di MgCl2, 0,8 mM di NaH2PO4 e 10 mM di D-glucosio e bilanciarla permanentemente con il 95% di O2-5% di CO2.
  2. Prepara gli strumenti di dissezione e due piattaforme di ghiaccio (Figura 1A).
  3. Mettere il ghiaccio nel serbatoio esterno e riempire la camera di affettatura del vibratomo con una soluzione di taglio ghiacciata (Figura 1B).
  4. Anestetizzare profondamente il giovane ratto Long Evans (età: P19-P25) con isoflurano (5%). Dopo aver confermato che l'animale è profondamente anestetizzato (pizzicando con forza il piede senza risposta), sopprimere l'animale mediante decapitazione con forbici o ghigliottina (a seconda dell'età/taglia dell'animale) a livello del midollo. Posizionare la testa sulla prima piattaforma ghiacciata e innaffiare il tessuto isolato ogni 10 s con la soluzione di affettatura ghiacciata ossigenata.
    NOTA: Le procedure di anestesia ed eutanasia devono essere eseguite in una stanza separata della struttura per animali.
  5. Taglia il cuoio capelluto in direzione caudale e, usando piccole forbici, taglia il cranio bilateralmente. Usando una pinza smussata, apri il cranio ed estrai rapidamente il cervello dal cranio con una spatola e mettilo sulla seconda piattaforma di ghiaccio><. NOTA: Il tempo non deve superare i 2 minuti dalla decapitazione all'estrazione del cervello.
  6. Fai 2 tagli nel piano frontale del cervello su tutto il cervello; il primo per rimuovere la parte anteriore della corteccia e i bulbi olfattivi (vedi Figura 1C) e il secondo a livello del collicolo inferiore per rimuovere la parte posteriore della corteccia e il cervelletto.
  7. Incolla il blocco cerebrale sulla piastra del vibratomo con il lato rostrale rivolto verso l'alto (vedi Figura 1D,E). Innaffiare il cervello regolarmente (ogni 10 s) durante l'intera procedura fino a quando non viene immerso nella camera di affettamento del vibratomo.
  8. Realizzare fette sottili da 350 μm contenenti il dLGN con il vibratomo (Figura 1G). Rimuovere la corteccia e l'ippocampo dal mesencefalo con una matita tirando delicatamente queste strutture.
  9. Aspira le fette con una pipetta Pasteur rotta collegata a una ventosa di gomma flessibile (Figura 1H).
  10. Lasciare che le fette si riprendano per 20-30 minuti nella soluzione di recupero (Figura 1I).

3. Elettrofisiologia del patch-clamp a cellula intera

NOTA: Per le registrazioni di patch-clamp su cellule intere da neuroni relè dLGN, usa un amplificatore patch-clamp specifico.

  1. Accendere le pompe del rig per far circolare la soluzione salina di registrazione extracellulare (vedi composizione al punto 2.1) nella camera di registrazione.
  2. Preparare la soluzione intracellulare miscelando 120 mM di K-gluconato, 20 mM di KCl, 10 mM di Hepes, 0,5 mM di EGTA, 2 mM di MgCl2, 2 mM di Na2ATP e 0,3 mM di NaGTP (pH 7,4).
    NOTA: La soluzione intracellulare può essere preparata in anticipo e conservata congelata a -80°C. Una volta scongelata, la soluzione viene mantenuta a 4 °C.
  3. Aggiungere alla soluzione salina extracellulare il bloccante del canale GABAA, la picrotossina (concentrazione finale di 100 μM) e l'antagonista ionotropico del recettore del glutammato, chinurenato (2 mM, concentrazione finale).
  4. Trasferire la fetta in una camera sommersa montata su un microscopio verticale. La camera è a temperatura controllata a 30 °C e perfusa continuamente con aCSF bilanciato.
  5. Posiziona il filo di platino a forma di U sulla fetta e posiziona la fetta per visualizzare il dLGN (Figura 2A).
  6. Preparare le pipette per cerotti da provette di vetro borosilicato estratte con un estrattore. Assicurarsi che le pipette per cerotti abbiano una resistenza di 5-10 MΩ quando vengono riempite con la soluzione intracellulare.
  7. Visualizzare il dLGN ad alto ingrandimento (40x o 60x) e selezionare un neurone per la registrazione patch-clamp utilizzando la video-microscopia a infrarossi con contrasto di interferenza differenziale (Figura 2B). Seleziona i neuroni in base al loro aspetto sano (cioè leggermente gonfio con contorni netti della membrana).
  8. Posizionare la pipetta patch sul neurone selezionato con una pressione positiva costante utilizzando il micromanipolatore.
    1. Impostare l'amplificatore in modalità VC e iniettare un passo di tensione di 5 mV. Impostare la tensione a -65 mV. Quindi, rilasciare la pressione positiva per ottenere una tenuta di alta resistenza (corrispondente alla riduzione della corrente in risposta ai gradini di tensione). Aspirare leggermente attraverso la pipetta per ottenere transienti chiari.
    2. Imposta l'amplificatore in modalità CC, bilancia il ponte per compensare la resistenza di accesso e mantieni il neurone a -65 mV.

4. Acquisizione dati

  1. Acquisisci segnali a 20 KHz per rilevare meglio i potenziali d'azione rapidi. Impostare il filtro passa-basso su 10 kHz per i segnali di tensione e corrente.
  2. Monitorare l'eccitabilità neuronale durante un periodo di controllo di circa 10 minuti iniettando un impulso positivo di corrente (tipicamente ~80-250 pA durante 500 ms) sufficiente a suscitare 3-5 potenziali d'azione in condizioni di controllo a una frequenza di 0,1 Hz.
  3. Monitorare la resistenza di ingresso del neurone durante l'esperimento con un breve impulso negativo di corrente (tipicamente -20 pA durante 100 ms). Mantenere costante l'ampiezza dell'impulso di corrente prima e dopo l'induzione di LTP-IE.

5. Induzione di LTP-IE

  1. Dopo il periodo di controllo, indurre LTP-IE provocando treni di 15 picchi evocati da 15 brevi passi (2-5 ms) di corrente depolarizzante erogata a 40 Hz per 10 minuti.
  2. Scegliere l'ampiezza dell'impulso di corrente per suscitare ogni volta un singolo potenziale d'azione (cioè 15 potenziali d'azione per treno).
    NOTA: Ogni treno di 15 picchi viene generato a una frequenza di 0,1 Hz (cioè 60 treni e 900 picchi).

6. Analisi dei dati

NOTA: La procedura di analisi è la stessa prima (condizioni di controllo) e dopo l'induzione LTP-IE.

  1. Per ogni traccia registrata, calcolare la resistenza di ingresso (Rin) dalla risposta di tensione al piccolo impulso di corrente negativa iniettato prima della fase di prova della corrente (Rin =passo V/passo I). Se c'è un run-up o un run-down della resistenza di ingresso (più del 10%) durante il periodo di controllo, scartare l'esperimento.
  2. Selezionare le tracce registrate in base al potenziale della membrana prima di qualsiasi iniezione di corrente. Conservare solo le tracce con un potenziale di membrana a riposo da -67 a -63 mV.
  3. Quantificare LTP-IE in un periodo di 10 minuti, 20 minuti dopo l'inizio del periodo post-induzione misurando il numero di AP evocati da ciascun impulso corrente e calcolando la media di ogni minuto utilizzando una routine fatta in casa in un software di analisi dei dati (fare riferimento al file supplementare 1 per la routine Igor Pro). Rileva i picchi quando il segnale di tensione supera 0 mV.
    NOTA: LTP-IE è espresso come il numero di potenziali d'azione suscitati dall'iniezione di impulsi di corrente dopo il protocollo di induzione rispetto a prima (%). L'analisi è stata effettuata a -10-0 minuti per il basale e +20/+30 minuti per il test.

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Risultati

I neuroni del dLGN sono stati registrati in configurazione whole-cell e la LTP-IE è stata indotta mediante scariche di potenziali d'azione a 40 Hz per 10 min in presenza di antagonisti dei recettori ionotropici per il glutammato e per il GABA (Figura 3A). È stato osservato un aumento triplo nel numero di potenziali d'azione 20-30 min dopo l'induzione (Figura 3B), senza alcun cambiamento nella resistenza in ingresso, Rin (Figura 3C...

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Discussione

Riportiamo qui l'induzione di LTP-IE nei neuroni dLGN mantenuti in vita in fette cerebrali acute mediante stimolazione del neurone registrato per evocare potenziali d'azione ad una frequenza di 40 Hz per 10 minuti. Questo protocollo è semplice da implementare in qualsiasi laboratorio di neurofisiologia in quanto richiede un numero minimo di apparecchiature (affettatrice, microscopio, 1 amplificatore, 1 scheda di acquisizione e computer). Tuttavia, è necessario rispettare alcuni passaggi critici per raccogliere dati prezi...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Supportato da INSERM, CNRS (a DD), AMU (a MR), FRM (da DVS20131228768 a DD e da DEQ20180839583 a DD), NeuroSchool (programma "France 2030" tramite A*Midex (Initiative d'Excellence d'Aix-Marseille Université, AMX-19-IET-004) e finanziamento ANR (ANR-17-EURE-0029 a AW) e ANR (LoGiK, ANR-17-CE16-0022 a DD, Plastinex, ANR-21-CE16-013 a DD). Ringraziamo A Venture & K Milton per l'eccellente cura degli animali.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Microtomo a lama vibrante automatizzatoLeicaVT-1200Svibratomo/affettatrice
Tubo in vetro borosilicatoPhymepB-15086-10
Controller Typ VLuigs& Regolatore di temperatura NeumannTyp V
Software Igor Softwareanalisiwavemetrica
Videomicroscopia a infrarossiFotocameraXM-10
KynurenateMerk/SigmaK3375AMPA/NMDA
Sistema di acquisizione dati a basso rumoreAxon - Dispositivi molecolariDigidata 1440A
MicromanipolatoriLuigs& NeumannLN Mini25
Multiclamp 200BAxon - Molecular devicesN/AAmplificatore patch-clamp
Multiclamp 700BAxon - Molecular devicesN/AAmplificatore patch-clamp
PC-100 EstrattoreNarishigePC-100per micropipette
PClamp10Axon - Molecular devicesN/ASoftware
PicrotossinaAbCamab120315bloccante dei recettori GABAA
Slice mini camera Luigs& NeumannLN Chambre Slice mini I-IIMicroscopio verticale a camera sommersa
OlympusBX51 WI
di Olympus Blocco dei recettori Interfaccia analogica/digitale di registrazione patch-clamp

Riferimenti

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