Le microglia sono considerate alcune delle cellule più versatili del corpo, capaci di adattamento morfologico e funzionale. La loro eterogeneità e multifunzionalità consente il mantenimento dell'omeostasi cerebrale, pur essendo legata a diverse patologie neurologiche. Qui viene descritta una tecnica per purificare la microglia del midollo spinale.
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Articolo metodologico
Arricchimento rapido ed efficiente della microglia del midollo spinale del topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
La colonna vertebrale definisce un vertebrato e modella il canale spinale, una cavità che racchiude e protegge il midollo spinale. Il corretto sviluppo e la funzione del sistema nervoso centrale dei mammiferi dipendono in modo significativo dall'attività dei macrofagi residenti noti come microglia. Le microglia mostrano eterogeneità e multifunzionalità, consentendo un'espressione genica e un comportamento distinti all'interno del midollo spinale e del cervello. Numerosi studi hanno esplorato la funzione della microglia cerebrale, descrivendo in dettaglio i metodi di purificazione. Tuttavia, la purificazione della microglia dal midollo spinale nei topi manca di una descrizione completa. Al contrario, l'utilizzo di una collagenasi altamente purificata, al contrario di un estratto non raffinato, manca di segnalazione all'interno dei tessuti del sistema nervoso centrale. In questo studio, la colonna vertebrale e il midollo spinale sono stati asportati da topi C57BL/6 di 8-10 settimane. La successiva digestione ha impiegato una collagenasi altamente purificata e la purificazione della microglia ha utilizzato un gradiente di densità. Le cellule sono state sottoposte a colorazione per citometria a flusso, valutando la vitalità e la purezza attraverso la colorazione CD11b e CD45. I risultati hanno prodotto una vitalità media dell'80% e una purezza media del 95%. In conclusione, la manipolazione della microglia di topo ha comportato la digestione con una collagenasi altamente purificata, seguita da un gradiente di densità. Questo approccio ha effettivamente prodotto consistenti popolazioni di microglia del midollo spinale.
Introduzione
La caratteristica distintiva dei vertebrati è la colonna vertebrale o colonna vertebrale, in cui la notocorda è stata sostituita da una sequenza di ossa segmentate chiamate vertebre, divise da dischi intervertebrali. Questa successione di materiale osseo modella il canale spinale, una cavità che racchiude e protegge il midollo spinale1. Nel genere Rodentia, la colonna vertebrale è solitamente formata da sette vertebre cervicali, tredici vertebre toraciche, sei vertebre lombari e un numero variabile di vertebre caudali 2,3. La lunghezza del midollo spinale è simile a quella dell....
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Protocollo
Lo studio è stato condotto in conformità con lo standard ufficiale messicano NOM-062-ZOO-1999 e la guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. L'approvazione per lo studio è stata ottenuta dai Comitati di Ricerca, Etica e Biosicurezza dell'Ospedale Pediatrico del Messico (HIM/2023/006) e dal Comitato di Ricerca e Bioetica dell'Ospedale Generale del Messico Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62). Tre topi C57BL/6 di età compresa tra 6 e 8 settimane sono stati ottenuti dall'Ospedale Pediatrico del Messico, dove sono stati allevati in condizioni isolate in rack ventilati, in conformità con le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali.
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Risultati
Utilizzando il tessuto del midollo spinale di topo, la digestione enzimatica è stata eseguita utilizzando una miscela altamente arricchita con collagenasi e termolisina. Il tessuto digerito risultante è stato sottoposto a passaggio attraverso un filtro da 40 μm per eliminare il materiale non digerito. Le cellule raccolte sono state arricchite attraverso un gradiente di densità Percoll, con il 90% nella porzione inferiore e il 45% nella porzione superiore. Le cellule arricchite di microglia all'interno dell'interfaccia so.......
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Discussione
Numerosi protocolli sono stati sviluppati per lo studio della microglia a causa della loro importanza nell'omeostasi cerebrale. In questi metodi, le microglia provengono tipicamente dagli emisferi cerebrali di ratti e topi embrionali o neonatali17. Un numero limitato di studi ha affrontato la purificazione della microglia dal midollo spinale di topi adulti13,14. Queste tecniche prevedono la digestione enzimatica utilizzando collagenasi e/o.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della borsa di studio concessa dal Consiglio Nazionale della Scienza e della Tecnologia (CONACYT) (702361). Gli autori riconoscono il programma di dottorato di ricerca in Scienze Chimiche Biologiche della Scuola Nazionale di Scienze Biologiche del National Polytechnic Institute.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette da raccolta da 15 mL | Corning, USA | 430790 | |
| Microprovette da 2 mL | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| Provette da raccolta da 50 mL | Corning, USA | 430829 | |
| 70% etanolo | |||
| Antibiotico-Antimicotico (penicillina, streptomicina, amfotericina b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| Anticorpo CD11b eFluor 450 anti-topo | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Anticorpo CD45 PerCP anti-topo | BioLegend, USA | 103130 | |
| Soluzione salina bilanciata (PBS) senza calcio e magnesio | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Filtro cellulare blu 40 μ m | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6 pozzetti Trasparente Non trattato | Corning, USA | CLS3736 | |
| Vetrini coprioggetti | |||
| Riscaldamento digitale Agitazione Bagno a secco | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Pinze da dissezione per microchirurgia | FT di DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´ s Aquila modificata&acuto; s Glucosio medio-alto (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| Rasoio | |||
| FACS tubo | Thermo, USA | 352058 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Citometro a flusso Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank' s soluzione salina bilanciata | Merck, USA | H2387 | |
| L-glutammina | Corning, USA | ||
| Liberase TM | Roche, Stati Uniti | d'America 5401119001 | |
| Camera Neubauer Camere di conteggio | Cina | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | centrifugazione in gradiente di densità |
| Soluzione di poli-L-lisina | Merck, USA | P8920 | |
| Bisturi n. 25 | HERGOM, Messico | H23 | |
| Snaplock 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Microscopio stereoscopico | Velab, Messico | HG927831 | |
| Forbici chirurgiche diritte (10 cm) | HERGOM, Messico | ||
| Forbici diritte Vannas | HERGOM, Messico | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Trypan blu Macchia 0,4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Miscelatore a vortice | DLAB, Cina | 8031102000 | |
| Kit di vitalità fissabile Zombie Aqua | BioLegend, USA | 423102 | colorazione con colorante fluorescente reattivo all'ammina |
Riferimenti
- Schröder,, Moser,, Huggenberger, Neuroanatomy of the Mouse. , Springer, Switzerland. 59-78 (2020).
- Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
- Bab, I., et al.
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Ristampe e permessi
