Imaging in tempo reale della dinamica del calcio acrosomiale e dell'esocitosi in spermatozoi di topo vivi

Sommario

Il modello murino AcroSensE e i metodi di imaging di cellule vive qui descritti forniscono un nuovo approccio allo studio della dinamica del calcio nel compartimento subcellulare dell'acrosoma spermatico e di come regolano i passaggi intermedi che portano alla fusione della membrana e all'esocitosi dell'acrosoma.

Abstract

L'esocitosi acrosomica (AE), in cui la singola vescicola esocitotica dello spermatozoo si fonde con la membrana plasmatica, è un processo complesso e calcio-dipendente essenziale per la fecondazione. Tuttavia, la nostra comprensione di come la segnalazione del calcio regoli l'AE è ancora incompleta. In particolare, l'interazione tra la dinamica del calcio intra-acrosomiale e le fasi intermedie che portano all'AE non è ben definita. Qui, descriviamo un metodo che fornisce approfondimenti spaziali e temporali sulla dinamica del calcio acrosomiale e sulla loro relazione con la fusione di membrana e la successiva esocitosi della vescicola acrosomiale. Il metodo utilizza un nuovo topo transgenico che esprime un sensore per l'esocitosi mirato all'acrosoma (AcroSensE). Il sensore combina un indicatore di calcio geneticamente codificato (GCaMP) fuso con mCherry. Questa proteina di fusione è stata specificamente progettata per consentire l'osservazione simultanea della dinamica del calcio acrosomiale e degli eventi di fusione della membrana. Il monitoraggio in tempo reale della dinamica del calcio acrosomiale e dell'AE negli spermatozoi vivi AcroSensE si ottiene utilizzando una combinazione di imaging ad alta frequenza di fotogrammi e un sistema di somministrazione stimolante in grado di colpire singoli spermatozoi. Questo protocollo fornisce anche diversi esempi di metodi di base per quantificare e analizzare i dati grezzi. Poiché il modello AcroSensE è geneticamente codificato, il suo significato scientifico può essere aumentato utilizzando strumenti genetici prontamente disponibili, come l'incrocio con altri modelli genetici murini o metodi basati sull'editing genetico (CRISPR). Con questa strategia, è possibile risolvere il ruolo di ulteriori vie di segnalazione nella capacitazione e nella fecondazione degli spermatozoi. In sintesi, il metodo qui descritto fornisce uno strumento conveniente ed efficace per studiare la dinamica del calcio in uno specifico compartimento subcellulare - l'acrosoma spermatico - e come tali dinamiche regolano i passaggi intermedi che portano alla fusione della membrana e all'esocitosi dell'acrosoma.

Introduzione

Gli spermatozoi acquisiscono la capacità di fecondare durante un processo chiamato capacitazione¹. Un endpoint di questo processo è che gli spermatozoi acquisiscono la capacità di sottoporsi a AE. Oltre due decenni di dati supportano la presenza di un modello complesso e multi-step di AE negli spermatozoi dei mammiferi (riassunto in ^2,3). Tuttavia, lo studio dell'AE negli spermatozoi vivi è impegnativo e i metodi attualmente disponibili per monitorare questo processo con una risoluzione adeguata sono ingombranti e richiedono più fasi di preparazione⁴, sono limita....

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite secondo le linee guida e approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Cornell University (#2002-0095). Per il presente studio sono stati utilizzati topi AcroSensE² di 8-10 settimane. Le richieste di informazioni sulla disponibilità dei topi AcroSensE possono essere inoltrate all'autore corrispondente.

1. Raccolta e lavaggio degli spermatozoi

1. Raccogliere gli spermatozoi dell'epididimo della cauda (maggiori dettagli su questa procedura sono forniti in¹¹) da topi AcroSensE. Lasciare la procedura di....

Risultati

La Figura 2 fornisce un'illustrazione semplificata che mostra la sequenza di cambiamenti di fluorescenza previsti dopo la stimolazione riuscita degli spermatozoi. Il pannello superiore della Figura 2 illustra i cambiamenti nell'intensità della fluorescenza GCaMP3, dove il segnale è inizialmente debole (le concentrazioni di calcio acrosomiale al basale sono inferiori a GCaMP3 KD) e all'ingresso di ioni calcio attraverso i pori di fusione, la fluorescenza.......

Discussione

Qui, viene descritto un metodo basato sulla microscopia per utilizzare il modello murino AcroSensE appena generato per il monitoraggio in tempo reale di una singola cellula e l'analisi dell'interazione tra la dinamica del calcio acrosomiale e i passaggi intermedi che portano all'AE. Insieme ad approcci genetici prontamente disponibili, come l'incrocio con altri modelli genetici murini o l'editing genetico, questo modello e metodo forniscono un potente sistema per studiare il ruolo di vari componenti e percorsi che prendo.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Obiettivo olio 100x	Olympus Giappone
	Sigma	C0926
Piatto coprioggetti da 35 mm, spessore 1,5	MatTek Corp.	P35G-1.5-20-C
Provetta a fondo tondo da 5 mL	Falcon	352054
Capilarries in vetro borosilicato	Sutter Instrument Co. CA USA	B200-156-10
CaCl2	Sigma	C4901
Microscopio confocale	Olympus Japan	Olympus FluoView
Glucosio	Sigma	G7528
Punta graduata	TipOne, USA Scientific HEPES
	Sigma	H7006
ImageJ	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
KCl	Sigma	P9541
Acido lattico	Sigma	G5889
Sistemi di incubazione per microscopio per cellule vive	TOKAI HIT Shizuoka, Giappone	Modello STX
MgCl2	Sigma	M8266
Estrattore per micropipette	Sutter Instrument Co., CA, USA	Modello: P-97
NaCl	Sigma	S3014
NaHCO3	Sigma	S6297
Pipetta di trasferimento in plastica	FisherBrand	13-711-6M
Poli-D-lisina	Sigma	P7280
Acido piruvico	Sigma	107360
Sistema di rilascio a cellula singola	Parker, Hauppauge, NY	Picospritzer III

UPlanApo,2-idrossipropil-b-ciclodestrina, , , ,