Abilitazione di studi di espressione transgenica ad alto rendimento mediante la manipolazione automatizzata dei liquidi per protoplasti di foglie di mais eziolati

Summary

Questo protocollo descrive la creazione di un layout di trasfezione randomizzato utilizzando un gestore di liquidi automatizzato, un protocollo di isolamento di protoplasti per foglie di mais eziolate e una procedura di trasfezione a 96 pozzetti utilizzando un gestore di liquidi.

Abstract

Il campo della biotecnologia vegetale ha assistito a notevoli progressi negli ultimi anni, rivoluzionando la capacità di manipolare e ingegnerizzare le piante per vari scopi. Tuttavia, poiché la ricerca in questo campo aumenta in termini di diversità e diventa sempre più sofisticata, è più evidente la necessità di soluzioni di screening transitorio precoci, efficienti, affidabili e ad alto rendimento per restringere le strategie che procedono verso una trasformazione stabile. Un metodo che è riemerso negli ultimi anni è l'utilizzo di protoplasti vegetali, per i quali sono disponibili metodi di isolamento e trasfezione in numerose specie, tessuti e stadi di sviluppo. Questo lavoro descrive un semplice protocollo automatizzato per la preparazione randomizzata di plasmidi all'interno di una piastra a 96 pozzetti, un metodo per l'isolamento di protoplasti di foglie di mais eziolati e una procedura di trasfezione automatizzata. L'adozione di soluzioni automatizzate nelle biotecnologie vegetali, esemplificata da questi nuovi protocolli di manipolazione dei liquidi per la trasfezione di protoplasti vegetali, rappresenta un progresso significativo rispetto ai metodi manuali. Sfruttando l'automazione, i ricercatori possono facilmente superare i limiti dei metodi tradizionali, migliorare l'efficienza e accelerare il progresso scientifico.

Introduction

La trasfezione di protoplasti vegetali, l'introduzione di materiale genetico estraneo in cellule vegetali prive di pareti cellulari, è una tecnica cardine e, nell'ultimo mezzo secolo, ha coinvolto numerose specie a supporto della ricerca sulle biotecnologie vegetali. Tuttavia, l'utilizzo di questi metodi può essere doloroso e di portata limitata, anche con milioni di protoplasti prodotti per isolamento. I metodi tradizionali di trasfezione dei protoplasti vegetali sono spesso laboriosi, dispendiosi in termini di tempo, soggetti a variabilità e tecnicamente impegnativi, portando a sistemi di nicchia con bassa riproducibilità¹. Tuttavia, le potenzialità introdotte dalle soluzioni automatizzate negli ultimi anni illuminano la possibilità di dare nuova vita a questa tecnica giovane di 60 anni ^2,3. Con il potenziale di automatizzare passaggi cruciali ma ripetitivi come la preparazione del materiale, l'incubazione del polietilenglicole (PEG) e la successiva dispensazione dei reagenti di trasfezione, i ricercatori possono ridurre significativamente i requisiti di manipolazione fisica e altre potenziali fonti di errore umano⁴. Inoltre, il controllo preciso e l'uniformità offerti dai sistemi automatizzati di manipolazione dei liquidi garantiscono risultati di trasfezione coerenti e riproducibili.

Mentre l'isolamento dei protoplasti è un processo meticoloso che coinvolge il taglio, la digestione, l'incubazione, la filtrazione e la centrifugazione, la parte di trasfezione di questi protocolli è fatta su misura per i gestori automatizzati di liquidi. La procedura per la maggior parte dei protocolli di trasfezione dei protoplasti è mediata da PEG e la miscelazione del protoplasto isolato in presenza di PEG e DNA plasmidico purificato per una durata specificata a una concentrazione precisa (dipendente dalla specie e dal tessuto) consente a queste cellule di assorbire il DNA plasmidico⁵. Questa trasfezione è seguita da una serie di fasi di lavaggio, che culminano in un'incubazione notturna⁶. Dopo il periodo di incubazione, se tutto è stato progettato e consegnato correttamente, l'esperimento si traduce nell'espressione della componente di interesse e/o nella possibilità di valutare diverse componenti regolatorie⁷. Tutte le fasi di aspirazione, dispensazione e agitazione/miscelazione associate a questa procedura sarebbero normalmente gestite da una pipetta manuale. L'esecuzione manuale di un tale protocollo, una singola reazione alla volta, è laboriosa e introduce variazioni non necessarie tra i campioni, limitando anche la capacità che può essere valutata in un dato momento. I protocolli automatizzati per la manipolazione di cellule di mammiferi o insetti e la sintesi chimica nell'industria farmaceutica sono in pratica da diversi anni ^4,8,9. L'utilizzo di Protoplast e i protocolli che coinvolgono la gestione automatizzata dei liquidi dei materiali vegetali sono in aumento 10,11,12,13.

L'adozione di protocolli automatizzati di manipolazione dei liquidi per la trasfezione di protoplasti vegetali è molto promettente per le applicazioni di ricerca. I ricercatori possono esplorare librerie genetiche più ampie, esaminare funzioni geniche specifiche a un ritmo accelerato e studiare in modo più completo le complesse interazioni genetiche correlate allo stress delle piante¹⁴. La scalabilità degli approcci automatizzati che utilizzano pod a 96 pozzetti, combinati con lo screening a fluorescenza, consente la sperimentazione ad alto rendimento e consente agli scienziati di generare rapidamente dati e approfondimenti che possono alimentare i progressi nella biotecnologia vegetale¹¹. Tuttavia, con questo aumento della velocità effettiva, che porta alla generazione di centinaia, se non migliaia di punti dati, è necessario un ulteriore controllo di qualità che tenga conto di eventuali fonti di errore che possono confondere i risultati¹⁵. Un elemento che è stato identificato come un fattore che contribuisce a numerose discipline scientifiche è l'effetto limite. Alcune strategie di mitigazione suggeriranno la piastra migliore da utilizzare o riempire lo spazio tra i pozzetti o i pozzi più esterni con acqua per combattere questo fenomeno^16,17. Tuttavia, queste strategie aggiungono tempo e, se uno specifico usa e getta non è disponibile, l'unica opzione è accontentarsi di meno o posticipare. In alternativa, l'analisi di strategie che tengono conto di questo effetto tramite uno schema di blocco non comporta alcun sacrificio di throughput o ritardo nell'esecuzione.

Questo protocollo di protoplasti di foglie di mais eziolati e i suoi due metodi automatizzati illustrati nella Figura 1 cercano di affrontare la variabilità inerente agli esperimenti sui protoplasti automatizzando porzioni multiple del metodo canonico dei protoplasti, l'allocazione del materiale plasmidico al recipiente utilizzato per la trasfezione e la trasfezione stessa. Questi metodi sono dimostrati per la piattaforma di protoplasti di foglie di mais eziolata in quanto è una piattaforma di protoplasti ben caratterizzata, semplice ed efficiente. Tutti i passaggi descritti all'interno sono immediatamente accessibili ai protocolli di trasfezione dei protoplasti, che utilizzano soluzioni tampone simili o uguali. Tuttavia, prima dell'adozione di queste tecniche, è necessario prestare particolare attenzione alle caratteristiche uniche dei tessuti e delle specie di protoplasti. Questi miglioramenti attraverso l'automazione semplificano la preparazione del materiale per i singoli esperimenti e migliorano significativamente la produttività, passando dalla trasfezione sequenziale una per una a 96 trasfezioni gestite simultaneamente. Questo lavoro mostrerà anche la giustificazione per l'utilizzo di blocchi incompleti randomizzati per tenere conto del bias posizionale su piastra.

Protocol

1. Creazione della piastra di trasfezione

1. Creazione del layout del mazzo: per creare un metodo di randomizzazione della piastra del DNA, aprire il software di gestione dei liquidi. Fare clic sul pulsante Nuovo metodo dalla barra dei menu per creare un nuovo metodo. Aggiungere la riga di configurazione dello strumento tra le righe di inizio e fine premendo il pulsante di configurazione dello strumento nel pannello di sinistra.
   NOTA: Le schermate pertinenti che seguono insieme a questo protocollo automatizzato sono disponibili nella Figura 1 supplementare, nella Figura 2 supplementare e nella Figura 3 supplementare.
2. Fare clic sulla riga Impostazione strumento , trovare il materiale da laboratorio corretto dal menu della categoria Strumento da laboratorio e trascinarlo sul layout del ponte come mostrato nella Figura 1 supplementare.
   NOTA: Se il materiale da laboratorio non è stato definito in precedenza, dovrà essere programmato nel gestore di liquidi in base alle specifiche del produttore, ma tali istruzioni esulano dall'ambito di questo protocollo.
3. Trasferimento da file di configurazione: premere il pulsante Trasferisci da file nelle tavolozze dei passaggi e posizionare la riga Trasferisci da file sotto la riga di configurazione dello strumento. Assicurarsi che la selezione e la sostituzione della punta siano come mostrato nella Figura 3 supplementare.
4. Controlla che il file abbia una riga di intestazione e assicurati che le informazioni sulla colonna siano corrette.
5. Premere l'area Sorgente per attivarla e fare clic sulla Piastra Sorgente dal layout del ponte, definire la piastra di destinazione e inserire la quantità di DNA da pipettare.
6. Premere il pulsante Personalizza per definire in dettaglio la tecnica di pipettaggio, ad esempio i tocchi della punta sulla parete.
7. Specificare la quantità di DNA plasmidico da trasferire. Questo protocollo utilizza 20 μL di DNA plasmidico da 1 μg/μL per trasfezione (pozzetto).
   NOTA: la quantità di DNA plasmidico che viene trasferita alla piastra di trasfezione prima della trasfezione del protoplasto dipenderà dalla piattaforma del protoplasto utilizzata.
8. Creare un trasferimento da file .csv documento.
   1. Questo documento è composto da due colonne. Preparare la prima colonna, cioè la colonna Da, che indica la posizione del DNA plasmidico di serie all'interno del rack delle provette, cioè per il campione 1; questo sarebbe bene A01. Poiché questo trasferimento avviene tre volte (tre ripetizioni), tre righe dovrebbero indicare A01 nella colonna Da.
   2. Preparare la seconda colonna, cioè la colonna A, utilizzata per specificare il pozzetto di destinazione del costrutto plasmidico della piastra a 96 pozzetti. Ad esempio, il campione 1 (A01) potrebbe essere B02, D04 e H07. Salvalo come file di .csv per renderlo compatibile con il software di gestione dei liquidi.
9. Prima di eseguire il protocollo, verificare che le posizioni del ponte siano caricate, che il materiale di laboratorio sia definito correttamente, che il documento di randomizzazione includa le posizioni dei pozzetti per tutto il DNA del campione nel rack delle provette e che ci sia abbastanza campione di plasmidi nelle provette per eseguire il protocollo.
10. Espandere il menu Proprietà file del passaggio Trasferisci da file, selezionare il file .csv creato ed eseguire il protocollo.
11. Coprire le piastre di trasfezione con un foglio di alluminio quando il protocollo è stato completato con successo. Conservare le piastre di trasfezione a -20 °C fino al momento dell'uso. Il protoplasto isolato di foglie di mais eziolato sarà aggiunto a questa piastra di trasfezione nella fase 3.3.

2. Isolamento di protoplasti di foglie di mais eziolate

1. Per iniziare l'isolamento del protoplasto eziolato della foglia di mais, ottenere un background genetico compatibile con i protoplasti come NP222 che è stato utilizzato qui¹⁸. Preparare solo 3 tamponi, vale a dire i tamponi MMg, W5 e WI, elencati nella Tabella 1 prima dell'inizio dell'esperimento e mantenerli a 4 °C. Preparare la soluzione digestiva e il PEG il giorno dell'esperimento per ottenere i migliori risultati.
2. Sterilizzare in superficie 25 semi immergendoli prima in una soluzione di candeggina commerciale al 25% e agitandoli su un agitatore a piattaforma rotante per circa 15-20 minuti a temperatura ambiente.
3. Dopo l'agitazione, sciacquare accuratamente i semi con acqua sterile (DI). Ripetere la fase di risciacquo 5 volte. Immergere i semi in acqua sterile per una notte a temperatura ambiente.
4. Semina il seme su un terreno umido e autoclavato il giorno seguente. Aggiungi pellet di argilla secca per eliminare l'umidità in eccesso dal terreno e prevenire la contaminazione fungina.
5. Coltivare le piantine di mais in una camera di crescita leggera di 16 ore a 28 °C (umidità relativa (RH) del 30%) per circa 3 giorni fino a quando il coleoptile si trova a 1-2 cm sopra il terreno e poi trasferirle in una camera buia con la stessa temperatura e RH per altri 5 - 7 giorni.
6. Raccogli il primo vero tessuto fogliare tagliandolo appena sopra il primo colletto.
7. Sterilizzare brevemente il tessuto fogliare in superficie con candeggina commerciale al 25% e 250 μL di soluzione Tween 20 al 20% per 1 minuto. Sciacquare accuratamente il materiale fogliare 5 volte con acqua deionizzata.
8. Asciugare (delicatamente) il tessuto fogliare di mais con fazzoletti privi di lanugine e, utilizzando una lama affilata, rimuovere ~1,5 cm sia dalla punta che dalla base di ciascuna lamina fogliare.
9. Tagliare il tessuto fogliare rimanente in strisce trasversali strette (0,5 mm - 1 mm) e metterlo in una capsula di Petri da 100 x 25 mm.
10. Filtrare-sterilizzare 25 mL di soluzione digestiva attraverso un filtro per siringa da 0,22 μm direttamente nella piastra di Petri contenente il tessuto affettato.
11. Vacuum infiltrare il tessuto fogliare con la soluzione digestiva applicando il vuoto per 30 minuti a temperatura ambiente in un essiccatore sottovuoto a circa -75 mbar di pressione.
    NOTA: La pressione del vuoto domestico per numerosi laboratori accademici e privati dovrebbe essere sufficiente per questo passaggio.
12. Posizionare su uno scuotitore a piattaforma rotante e agitare a 25 °C al buio a 60 giri/min per 2,5-3 ore. Alla fine del periodo di digestione mancano 10 minuti, aumentare la velocità a 90 giri/min.
13. Versare la soluzione di digestione e l'eventuale materiale vegetale non digerito attraverso un imbuto sopra un filtro a setaccio da 40 μm in una provetta da 50 mL.
14. Centrifugare la soluzione all'interno della provetta da 50 mL a 150 x g per 4 minuti per pellettare il protoplasto. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 10 - 15 mL di soluzione tampone MMg.
15. Ripetere la centrifugazione e rimuovere il surnatante. Risospendere in 5 - 10 mL di tampone MMg fresco.
16. Utilizzando un emocitometro, misurare attentamente la densità del protoplasto isolato. Risospendere a una densità approssimativa di 5 x 10⁵ protoplasti per mL.
17. Lasciare riposare l'isolato sul ghiaccio per ~30 minuti prima della trasfezione. Durante questo periodo, preparare la soluzione PEG. Sciogliere completamente il PEG in una soluzione a bagnomaria a 37 °C e lasciarlo lì fino alla trasfezione.

3. Trasfezione automatizzata di protoplasti

NOTA: I passaggi da 3.6 a 3.15 sono gestiti completamente dal gestore automatico di liquidi, ad eccezione delle due pause utente ai passaggi 3.10 e 3.13, che richiedono la centrifugazione manuale. Gli screenshot pertinenti che seguono insieme a questo protocollo automatizzato sono disponibili nel supplemento, nella Figura supplementare 1, nella Figura supplementare 3, nella Figura supplementare 4 e nella Figura supplementare 5.

1. Preparare il layout del ponte del gestore di liquidi per la trasfezione secondo il metodo di trasfezione del protoplasto descritto nei passaggi seguenti. Assemblare i seguenti materiali: piastra di destinazione (in questo caso, sarebbe una nera a 96 pozzetti con una micropiastra a fondo trasparente per la misurazione della fluorescenza), una scatola di puntali di automazione a foro largo da 25 - 250 μl per la fase di aspirazione PEG, cinque scatole di puntali di automazione per pipette da 25 - 250 μl per le restanti fasi di manipolazione dei liquidi, tre vasche di plastica come serbatoi di reagenti, una piastra vuota a 96 pozzetti per la raccolta dei rifiuti, le restanti soluzioni di lavaggio tampone di trasfezione, W5 e WI.
2. Immediatamente prima dell'inizio della procedura di trasfezione, sterilizzare la soluzione PEG con filtro attraverso un'unità filtrante sottovuoto monouso sterile da 0,22 μm in una provetta fresca da 50 mL.
3. Dal protoplasto risospeso in tampone MMg, aggiungere 100 μl (circa 50.000 protoplasti) a ciascun pozzetto della piastra di trasfezione pre-preparata e scongelata. A tale scopo, versare la soluzione tampone contenente protoplasti in un trogolo sterile da 10 mL e utilizzare una pipetta multicanale. Continuare ad agitare delicatamente la vasca per evitare che il protoplasto si depositi dalla soluzione durante questa fase di trasferimento manuale.
4. Versare la soluzione PEG nell'apposito trogolo e deporre la piastra di trasfezione, ora contenente protoplasto e DNA plasmidico contenente piastra di trasfezione, preparata utilizzando il passaggio 1, nella posizione specificata in base al layout del ponte.
5. Per creare un metodo di trasfezione del protoplasto, aprire il software di gestione dei liquidi ed eseguire i passaggi descritti di seguito.
   1. Spostamento di materiale da laboratorio tra i mazzi: Sostituisci la scatola delle punte vuota sul piano di caricamento delle punte con una nuova utilizzando il comando Sposta materiale da laboratorio. Selezionare i deck Da e A dalla vista Configurazione .
   2. Per volumi superiori a 200 μl: non sostituire i puntali tra i trasferimenti. Suggerimenti per il carico per la prima fase di trasferimento e scarico dopo l'ultima fase di trasferimento, che richiede che le opzioni di carico/scarico siano specificate correttamente per ogni fase di trasferimento, come nella Figura 3 supplementare.
6. Creazione del layout del ponte: come il metodo di creazione della piastra di trasfezione, per creare un metodo di trasfezione automatizzato del DNA, apri il software di gestione dei liquidi. Fare clic sul pulsante Nuovo metodo dalla barra dei menu per creare un nuovo metodo. Aggiungere la riga di configurazione dello strumento tra le linee di inizio e fine premendo il pulsante di configurazione dello strumento nel pannello di sinistra. Creare un layout del ponte in base al layout del ponte mostrato nella Figura 1 supplementare.
7. Miscelazione cellula/DNA: aggiungere un passaggio per mescolare protoplasto e DNA prima dell'aggiunta del PEG utilizzando il pulsante di azione del dispositivo e configurando il dispositivo (agitazione del posizionatore automatizzato da laboratorio o ALP), la velocità di agitazione (1500 giri/min) e il tempo di agitazione (10 s).
8. Aggiunta e miscelazione di PEG: per avviare la trasfezione, aggiungere una fase di trasferimento per aggiungere 110 μl di PEG dal serbatoio PEG utilizzando una pipetta da 96 baccelli. Assicurarsi che le posizioni di origine e di destinazione corrette siano programmate in base al layout del ponte specificato. Programmare la fase di trasferimento per aspirare il PEG a 1 mm dal fondo del serbatoio e depositare il PEG a 3 mm dalla base della piastra a 96 pozzetti contenente la miscela protoplasto/DNA. Aggiungere un altro passaggio di scuotimento dopo l'aggiunta del PEG copiando e incollando i passaggi precedentemente programmati.
9. Incubazione PEG: aggiungi una fase di pausa selezionando il pulsante Pausa , seleziona l'agitatore e inserisci il tempo di incubazione predeterminato, che inizia dall'aggiunta di PEG.
   NOTA: Il timer per la pausa continuerà a meno che non si verifichino interruzioni o interruzioni della barriera fotoelettrica che potrebbero causare un messaggio di errore. Assicurati che, se è necessaria la manipolazione del mazzo, questi messaggi vengano cancellati prima di allontanarti.
10. Aggiunta/miscelazione del tampone W5: aggiungere tre linee di trasferimento da 200 μl per trasferire un totale di 600 μl di tampone W5 alla piastra di trasfezione per estinguere la reazione di incubazione PEG. Seguire l'aggiunta del tampone W5 agitando e facendo una pausa all'utente per consentire la centrifugazione della piastra di trasfezione.
11. Pausa utente 1: centrifugare la piastra di trasfezione del protoplasto a 100 x g per 4 minuti. Riportare la piastra di trasfezione, ora con protoplasto pellettato, nella posizione appropriata del ponte. Aggiungi la pausa utente facendo clic sul pulsante Pausa , tranne ora con l'opzione Metti in pausa l'intero sistema e visualizza il messaggio selezionata.
    NOTA: il popup del messaggio di pausa deve essere cancellato prima che il gestore di liquidi continui con il resto del protocollo.
12. Rimozione del surnatante: aggiungere due linee di trasferimento per rimuovere 400 μl di surnatante e trasferirlo nella piastra di scarto. Per evitare l'aspirazione delle cellule durante la rimozione del surnatante, impostare la distanza dal fondo a 6 mm.
13. Aggiunta/miscelazione WI Aggiungere 3 linee di trasferimento per trasferire 580 μL di tampone WI alla piastra di trasfezione. Aggiungi un altro passaggio di scuotimento dopo l'aggiunta di WI copiando e incollando i passaggi precedentemente programmati. Passare alla pausa utente successiva.
14. Pausa utente 2: Centrifugare la piastra di trasfezione del protoplasto a 100 x g per 4 minuti. Riportare la piastra di trasfezione, ora con protoplasto pellettato, nella posizione appropriata del ponte.
15. Rimozione del surnatante: aggiungere quattro linee di trasferimento per rimuovere 680 μl di surnatante e trasferire nella piastra di scarto. Per evitare l'aspirazione delle cellule durante la rimozione del surnatante, impostare la distanza dal fondo a 6 mm.
16. Trasferimento di protoplasti su micropiastra: Il trasferimento finale di questo protocollo è composto da due fasi di trasferimento da 150 μL. Prima di ogni singola fase, aspirare ripetutamente i protoplasti a 50 μL/s a 2 mm dal fondo della piastra di trasfezione e dosare a 3 mm. Quindi, utilizzando gli stessi puntali della pipetta, trasferire sulla micropiastra di destinazione.
    NOTA: L'aspirazione e l'erogazione del volume del tampone al di sopra del pellet prima del trasferimento nella micropiastra disturberà tutti i protoplasti rimanenti pellettati sul fondo della piastra di trasfezione per garantire che non vi sia perdita di campione. Poiché la randomizzazione è stata eseguita durante la creazione della piastra di trasfezione, questo conclude il protocollo automatizzato.
17. Incubare la micropiastra a temperatura ambiente al buio per 24-48 ore prima della prima misurazione della fluorescenza.

Results

Ottenere dati osservazionali a sostegno di tali effetti di bordo che possono influenzare le misure di risposta; È stato condotto uno studio pilota per confermare questi sospetti. Per questo studio, i metodi di cui sopra sono stati applicati a tre piastre replicate da 96 pozzetti con un solo livello di trattamento; tutti i protoplasti sono stati trasfettati utilizzando pSYN11250¹⁹, un plasmide che esprime costitutivamente ZsGreen, con l'obiettivo di mostrare che esistono differenze sistematiche nel livello di risposta per le unità sul bordo della piastra rispetto alla seconda fila e alle regioni centrali della piastra. I 36 pozzetti sul bordo esterno della piastra sono definiti come blocco 1, i 28 pozzetti nella seconda fila dal bordo come blocco 2 e i 32 pozzetti centrali come blocco 3 - vedere la Figura 2A pannello in basso a destra. Questa disposizione può ospitare 28 livelli di trattamento come un disegno a blocchi completi randomizzati (RCBD) o 32 livelli di trattamento come un disegno a blocchi incompleti randomizzati (RIBD). Nella Figura 2A, per ogni replica (rep), i punti di dati grezzi per ciascun pozzetto sono stati normalizzati dalla media di quella rispettiva piastra. In tutte e tre le repliche dell'esperimento, le risposte sul bordo della piastra sono, in media, 1-1,5 volte più grandi del minimo. La Figura 2B illustra le medie dei blocchi come percentuale della media complessiva della piastra per ciascuna replica. La tabella 2 mostra le tabelle ANOVA unidirezionali derivanti dall'adattamento di un modello lineare con blocco come effetto fisso. Per ragioni legate alla randomizzazione ristretta coinvolta nei disegni a blocchi, l'inferenza basata sulla verifica delle ipotesi per il fattore di blocco è considerata approssimativa nel migliore dei casi e non valida nel peggiore. Tuttavia, l'adattamento di un modello con un fattore di blocco fisso è utile per valutare se uno schema di blocco è vantaggioso. Mn_Sq (blocco) rappresenta la deviazione quadratica media del blocco che corrisponde alla media complessiva. Mn_Sq (Errore) rappresenta la deviazione quadratica media delle singole osservazioni rispetto al rispettivo gruppo significa, in questo caso, la media complessiva poiché non esiste alcun fattore di trattamento nel modello. Quando Mn Sq (blocco) è maggiore di Mn Sq (errore), cioè il rapporto F è maggiore di uno, la dimensione dell'errore quadratico medio è stata efficacemente ridotta rispetto a un disegno completamente randomizzato (CRD), aumentando così la potenza statistica per confrontare i trattamenti di interesse e diminuendo l'ampiezza degli intervalli di confidenza che stimano i contrasti di trattamento. La Figura 2B mostra rapporti F che superano di gran lunga uno e la risposta misurata tende a diminuire man mano che si sposta verso il centro su tutte e tre le piastre replicate. In tutte e tre le repliche, si osservano intervalli di confidenza del 95% al livello 0,05 per almeno un blocco che non copre la media di piastra osservata. Si può pertanto concludere che lo schema di blocco aumenta notevolmente la precisione di tali stime. Oltre ad avere una minore precisione, la mancata considerazione della variabilità del fastidio spaziale può portare a risultati spuri a causa della possibilità di confondere gli effetti del trattamento con l'effetto bordo.

Sebbene esista una lunga storia di protocolli di isolamento e trasfezione di protoplasti di mais eziolati che risale ai primi anni '90, questo protocollo introduce alcune modifiche aggiuntive alla procedura tradizionale per facilitare meglio un isolamento riproducibile di protoplasti di massa ai fini della trasfezione di protoplasti ad alto rendimento²⁰. Le fasi di sterilizzazione della superficie del seme e del tessuto fogliare prima della digestione riducono la contaminazione fungina senza richiedere terreni asettici. L'utilizzo del terreno aiuterà anche a mantenere bassi i costi rispetto all'utilizzo di terreni di coltura speciali o all'acquisto di contenitori monouso sterili. Il protocollo in numerose fasi può essere scalato per adattarsi a vari livelli di velocità effettiva. Circa 2 g di tessuto della prima foglia si traducono in 5 x 10⁶ - 10 x 10⁶ protoplasti. Poiché sono necessari 5 x 10⁶ protoplasti per ogni trasfezione di piastre a 96 pozzetti, il protocollo di isolamento, così come è scritto, può ospitare 2 esecuzioni del protocollo di trasfezione. Questo protocollo utilizza anche MMg come soluzione di lavaggio invece della canonica soluzione W5. Questo è stato derivato originariamente dalle pubblicazioni per il protoplasto della radice di Arabidopsis come mezzo per ridurre il numero di soluzioni tampone utilizzate per ogni data fase della procedura di trasfezione del protoplasto²¹. Tuttavia, è stato impiegato anche per protoplasti di foglie di mais eziolati entro il 2022²². Un ulteriore miglioramento dell'isolamento e della trasfezione di qualsiasi protocollo di protoplasti sarebbe la semplificazione e la riduzione delle soluzioni tampone. Allo stato attuale, questo protocollo passa dal buffer di digestione canonico, al buffer W5, al buffer MMg e al buffer WI. Semplificare le soluzioni sarebbe molto utile per migliorare la riproducibilità degli esperimenti sui protoplasti e ridurre la variabilità da persona a persona o da lotto a lotto tra gli esperimenti. In particolare, l'ultima novità del protocollo è la mancanza di rimozione completa delle soluzioni tampone dopo la trasfezione PEG. La ragione per cui l'automazione è possibile è perché il protoplasto, il mais eziolato mostrato qui e altri che abbiamo testato, è che sembrano tollerare la diluizione come mezzo per estinguere la reazione piuttosto che la completa rimozione delle diverse soluzioni tampone¹¹. La produzione di reporter, come indicato dal nostro controllo di trasfezione GFP utilizzato qui, indica che il protoplasto può tollerare fino al 5% di PEG senza alcun impatto negativo sull'intensità della fluorescenza (Figura 6 supplementare). Tale valore è più del doppio di quello che sarebbe la concentrazione di PEG prevista al completamento del protocollo qui descritto.

Figura 1: Schema illustrativo della procedura di isolamento e trasfezione dei protoplasti. I passaggi in cui è stata introdotta l'automazione sono indicati dalle linee rosse tratteggiate e dalle caselle blu che le accompagnano. I numeri circondati da un cerchio rosso corrispondono ai tre metodi descritti. Creato con BioRender.com. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Effetto bordo e impatto della mitigazione dei layout di replica. (A) Mappe topografiche che mostrano la variazione di piegatura dell'intensità della fluorescenza per piastre a 96 pozzetti trasfettate con pSYN11250 rispetto alla media della piastra per 3 esperimenti di replica indipendente (Rep). La media di questi esperimenti è mostrata anche con lo schema di blocco, indicato dalle linee tratteggiate di colore diverso disposte sopra. (B) Grafici a strisce che mostrano le medie dei blocchi come percentuale della media complessiva delle lastre per le lastre replicate 1, 2 e 3 da sinistra a destra. I cerchi semitrasparenti rappresentano i punti dati grezzi dopo la divisione per la media della piastra. Le barre di errore sono intervalli di confidenza del 95% al livello 0,05, con il trattino centrale che indica la media. I colori marrone, dorato e grigio indicano rispettivamente il bordo, la seconda fila e la parte interna della targa. La linea rossa tratteggiata al 100% rappresenta la media complessiva della targa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Buffer	Reagente
Digestione	1,5% Cellulosa Rs
	0,3% Macroenzima
	0,6 M Mannitolo
	10 mM MES (ph 5,7)
	1 mM di CaCl2
	0,1% (p/v) BSA
	0,5 nM β-mercaptoetanolo o 0,5 mM DTT
Mmg	0,6 M Mannitolo
	15 mM di MgCl2
	4 mM MES, pH 5,7
W5	154 mM di NaCl
	125 mM CaCl2
	5 mM KCl
	2 mM MES, pH 5,7
WI	0,6 M Mannitolo
	4 mM MES, pH 5,7
	4 mM KCl
PIOLO	30% PEG (p/v)
	0,6 M Mannitolo
	100 mM CaCl2

Tabella 1: Soluzioni tampone per l'isolamento e la trasfezione di protoplasti di mais eziolati.

Rappresentante	Fonte	Df	Somma Sq	Mn Sq	Valore F	Pr (>F)
Replica 1	Blocco	2	0.26	0.13	10.64	<0,001
	Residuo	93	1.135	0.012
Replica 2	Blocco	2	0.507	0.25	21.41	<0,001
	Residuo	93	1.102	0.012
Replica 3	Blocco	2	0.179	0.09	4.48	0.014
	Residuo	93	1.861	0.02

Tabella 2: Tabella ANOVA a una via per le tre repliche dell'esperimento di trasfezione pSYN11250 a 96 pozzetti. Per ogni piastra replicata: la colonna Sorgente denota la fonte di variazione, Df denota i gradi di libertà, Somma Sq denota la somma dei quadrati, Mn Sq denota i quadrati medi (Somma Sq/Df), il valore F denota il rapporto tra Mn_Sq (blocco) e Mn_Sq (errore) e Pr(>F) denota il valore p del test F globale.

Figura supplementare 1: Schermate della dashboard del software. Categorie di selezione che riguardano la creazione di un nuovo metodo, nonché i layout del mazzo per i protocolli di randomizzazione e trasfezione. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 2 supplementare: Passaggi chiave nella configurazione del protocollo di creazione della piastra di trasfezione. Screenshot acquisiti durante la creazione del protocollo di creazione della piastra di trasfezione. Il numero e il titolo di ciascun pannello corrispondono alle fasi del protocollo. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 3 supplementare: Screenshot per la manipolazione del materiale di laboratorio e il caricamento delle punte per la creazione del protocollo di trasfezione. Questi rappresentano passaggi che si verificano numerose volte durante il protocollo, quindi per evitare menzioni ripetute, vengono mostrati passaggi rappresentativi. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 4: Miscelazione cellula-DNA attraverso la pausa utente 1. Screenshot acquisiti durante la creazione del protocollo di trasfezione. Il numero e il titolo di ogni pannello corrispondono ai passaggi all'interno del corpo del protocollo. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 5 supplementare: Rimozione del surnatante dopo la pausa utente 1 attraverso il trasferimento dei campioni alla micropiastra. Screenshot acquisiti durante la creazione del protocollo di trasfezione. Il numero e il titolo di ogni pannello corrispondono ai passaggi all'interno del corpo del protocollo. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 6 supplementare: Protoplasto di foglia di mais eziolato trasfettato ZsGreen trattato con diverse concentrazioni di PEG nel decorso temporale del tampone WI. Grafico a barre che mostra l'intensità relativa di fluorescenza del protoplasto dopo il trattamento PEG a 24, 48 e 72 ore con misurazione da parte di un lettore di micropiastre. Barra di errore = SD, n = 4. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Questo manoscritto descrive un protocollo per automatizzare la creazione di piastre di trasfezione e l'isolamento di protoplasti di foglie di mais eziolate con una trasfezione automatizzata. Per completare con successo la parte del protocollo relativa alla creazione della piastra di trasfezione, è necessario un robot automatizzato per la manipolazione dei liquidi dotato di un pod a 8 canali. Per il protocollo di trasfezione, si consiglia una capsula a 96 pozzetti per una trasfezione completa e uniforme di piastre a 96 pozzetti. Il metodo di trasfezione può essere completato utilizzando un pod a 8 canali, ma è necessario prestare particolare attenzione alla quantità di tempo necessaria per le fasi di aspirazione e dispensazione, nonché al tempo che può essere attribuito alla sostituzione dei puntali tra le colonne. È ben documentato che le differenze nella durata dell'incubazione del PEG hanno un impatto significativo sull'efficienza e sull'espressione della trasfezione e, pertanto, è necessario prestare particolare attenzione a questi fattori che contribuiscono per prevenire disparità nella manipolazione del campione¹³. Prima di avviare il protocollo del gestore di liquidi, è importante considerare i passaggi del protocollo e se determinate attività possono essere completate contemporaneamente. Questo protocollo utilizza un dispositivo che carica le punte sul pod a 96 pozzetti da 1 posizione sul ponte. Il gestore di liquidi per questo protocollo include una funzione in cui il robot scambia le scatole dei puntali durante i periodi di incubazione o durante le fasi di pausa dell'utente per evitare di aggiungere ulteriore tempo al protocollo. Quando prendi la decisione di acquistare un movimentatore di liquidi, pensa alla funzionalità e ai potenziali vantaggi che fanno risparmiare tempo.

Sebbene questo protocollo sia stato sviluppato per utilizzare i dispositivi Beckman Coulter NXp e Biomek FX, questo protocollo può essere adattato a qualsiasi dispositivo di manipolazione dei liquidi comparabile. Tutti i gestori di liquidi dispongono di alcuni mezzi per indicare come trasferire i volumi da una posizione all'altra e quanto. Per questo protocollo, questi dispositivi utilizzavano un comando Trasferisci da riga file. Se il materiale di laboratorio è definito correttamente, un utente può trasferirlo da o verso qualsiasi recipiente. In circostanze eccezionali, ad esempio se i rack per provette o gli adattatori non sono disponibili in commercio, è possibile utilizzare la stampa 3D di tali connettori. Per i tipici protocolli di trasfezione dei protoplasti, la trasfezione di 20 μg di DNA a una concentrazione di 1 μg/μL è un volume standard di materiale per numerose piattaforme di protoplasti¹³_. Durante la creazione della piastra di trasfezione, come ulteriore precauzione, utilizzare puntali filtranti da 0,2 - 20 μl per ridurre al minimo il rischio di contaminazione dovuto al plasmide aerosolizzato durante il trasferimento. La rimozione della componente umana della preparazione riduce le variazioni nel tempo e migliora la riproducibilità di questi esperimenti ad alto rendimento. Inoltre, i piatti possono essere preparati con largo anticipo. Questa preparazione allevierà lo stress dello scienziato della trasfezione il giorno dell'esperimento. Tuttavia, è importante evitare di conservare queste piastre di DNA plasmidico a 4 °C per lunghi periodi di tempo, poiché i campioni potrebbero evaporare. I campioni devono essere conservati in un congelatore a -20 °C e possono quindi essere scongelati in frigorifero a 4 °C prima della trasfezione. Una volta programmato, questo protocollo di creazione della piastra di trasfezione dovrebbe essere facilmente ripetibile fornendo un nuovo .csv di trasferimento da file e occupando le stesse posizioni del ponte per i campioni, il materiale di laboratorio e i reagenti.

Per la procedura di trasfezione automatizzata (fase 3), viene preparato un surplus di soluzione PEG per garantire un'aspirazione uniforme del liquido viscoso dalla vasca, in genere un eccesso di 40 ml per tenere conto del volume morto. L'utilizzo della quantità esatta necessaria per la trasfezione può comportare l'aspirazione di aria nelle pipette e l'aspirazione di volumi irregolari di PEG attraverso la testa a 96 canali. Sebbene questa soluzione possa anche essere preparata in anticipo, si consiglia di prepararla il giorno della trasfezione. La sterilizzazione della soluzione PEG può essere effettuata utilizzando un filtro per siringa, ma a causa della viscosità può essere difficile. L'utilizzo di un'unità di filtraggio sottovuoto è più veloce e può alleviare qualsiasi frustrazione o dolore associato a questa attività. Come per la soluzione PEG, viene fornito anche un eccesso delle altre soluzioni tampone di trasfezione (W5, WI) per garantire un pipettaggio uniforme attraverso la testina a 96 canali. Le soluzioni tampone (W5 e WI) possono essere preparate in anticipo in blocco per essere utilizzate per le future esecuzioni dei gestori di liquidi. Sebbene i reagenti non siano costosi, c'è un buon sacrificio di soluzione tampone. Con l'aumento del numero di corse al giorno, potrebbe essere meglio utilizzare alternative al serbatoio che ridurrebbero l'eccesso scartato alla fine della corsa. Durante l'esecuzione del protocollo del gestore di liquidi, W5 e WI possono essere aggiunti ai rispettivi minimi prima dell'avvio del protocollo, durante l'incubazione di 15 minuti o durante le fasi di pausa dell'utente nel protocollo. Fai attenzione quando aggiungi tamponi durante il periodo di incubazione a causa di caratteristiche di sicurezza come una barriera fotoelettrica. Assicurarsi di cancellare tutti i messaggi di avviso dal software per evitare interruzioni involontarie del protocollo.

Questo protocollo riflette un miglioramento affidabile, ripetibile e ampiamente applicabile rispetto ai protocolli automatizzati precedentemente documentati per la manipolazione del protoplasto^12,13. Questo metodo è adattabile al repertorio apparentemente infinito dei protocolli di protoplasti, poiché molti dipendono dalla stessa serie di passaggi di manipolazione del tampone. La mitigazione dell'effetto bordo attraverso il RICBD durante la creazione automatizzata della piastra di trasfezione riduce contemporaneamente la quantità di sforzo e la variabilità, applicando al contempo una correzione statisticamente significativa dell'effetto bordo. Una trasfezione di protoplasto in pod a 96 pozzetti elimina la possibilità di qualsiasi variazione associata al tempo di incubazione del PEG, conducendo la reazione all'interno di tutti i 96 pozzetti contemporaneamente. Sebbene il protocollo fosse destinato a realizzare l'automazione completa delle fasi di trasfezione, le pause dell'utente richiederanno l'intervento fisico dello scienziato della trasfezione. Negli ultimi anni, ci sono stati molti progressi nelle centrifughe tolleranti agli squilibri e compatibili con l'automazione. Con questa attrezzatura, sarebbe possibile automatizzare l'intero metodo senza il coinvolgimento dell'utente. In alternativa, altri protocolli hanno evitato la centrifugazione consentendo al protoplasto di depositarsi sul fondo del pozzo dopo la trasfezione^12,13. Tuttavia, ciò aggiungerà ulteriore tempo alla procedura di trasfezione e un eccesso di tempo di incubazione nel tampone W5 prima dell'incubazione notturna in WI.

In numerosi punti del metodo di trasfezione, descrive la manipolazione di volumi superiori a 200 μl in cui la manipolazione del liquido deve essere eseguita utilizzando trasferimenti multipli. A seconda dell'età e del modello del gestore di liquidi, questa fase potrebbe e dovrebbe essere eseguita in un unico volume. Per i gestori di liquidi più vecchi, come il modello qui descritto, il massimo che può essere aspirato utilizzando una testa a 96 pozzetti è di 200 μl. Un evidente miglioramento del metodo sia in termini di efficienza che di precisione sarebbe quello di ridurre il numero di trasferimenti per ridurre al minimo qualsiasi potenziale rischio di fuoriuscita, gocciolamento o contaminazione. Altre considerazioni per il miglioramento dei protocolli di manipolazione dei liquidi sono delineate nelle revisioni di queste tecnologie e del loro utilizzo nel campo delle biotecnologie²³.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2)β-mercaptoetanolo	Sigma	M6250
2-(N-Morpholino)acido etansolfonico (MES) monoidrato	Sigma	69892
Provette da centrifuga da 50 ml con tappo piatto sterile	Fisher	22-010-064
96 pozzetti Optical Btm Plt PolymerBase Black con coperchio Coltura cellulare sterile PS .4mL Pozzetto	Fisher	12-566-70
Axygen Biomek FX/NX Punte robotiche, non sterili, Wide Bore	Fisher	14-222-096
Axygen Robotic Tips 30uL filtro, sterile, rack	Fisher	14-222-103
Bel-Art SP Scienceware Lab Companion Essiccatori sottovuoto rotondi	Fisher	08-648-10
Bemis 2 IN. x 250 piedi rotolo di parafilm da laboratorio	Fisher	13-374-16
Biomek FXP	Beckman Coulter	902508
Cloruro di calcio diidrato	Sigma	C5080
Chemglass Emocitometro monouso per le scienze della vita	Fisher	50-131-1352
Clorox Germicida Candeggina, concentrato	Fisher	NC1871274
Corning Nastro sigillante in alluminio per micropiastre	Fisher	07-200-684
Blocchi di analisi Corning a 96 pozzetti, 2 ml, 96 pozzetti standard	Fisher	07-200-701
DL-Ditiotreitolo (DTT)	Sigma	10197777001
D-mannitolo	Sigma	M9546
Fisherbrand Siringa in plastica da 60 ml	Fisher	14-955-461
Fisherbrand Filtro per cellule sterili 40um	Fisher	22-363-547
Fisherbrand Piastre di Petri con coperchio trasparente, impilabili, 100 mm x 25 mm, confezione da 325	Fisher	FB0875711
Cloruro di magnesio esaidrato	Sigma	M2670
Unità filtrante a siringa Millex Sterile 33mm PES .22um	Fisher	SLGPR33RS
Unità filtrante a siringa Millex Sterile 33mm PVDF.45um	Fisher	SLHAR33SS
MillliporeSigma Steriflip Unità filtranti sottovuoto monouso sterili 50mL PES	Fisher	SCGP00525
Poli(glicole etilenico) 4000	Sigma	81240
Redi-Earth Spina & Mix di piantine	Wyatt Quarles	GP92747
Lame di rasoio a filo singolo per impieghi regolari con retro in acciaio .009RD	Fisher	12-640
Research Products International Corp Cellulase RS	Fisher	50-213-232
Research Products International Corp Macerozyme R-10	Fisher	50-213-444
Cloruro di sodio	Sigma	S7653
Inserto per vassoi - 36 celle - 6x6 annidato	Hummert	11635000
Tween-20	Sigma	P1379
VACUUBRAND ME1, 100-120V, 50/60 Hz, spina USA	VWR	97058-164