<ol><li> Costruire una camera di flusso, come mostrato nel video. Assicurarsi che la guarnizione parafilm è stretto e l&#39;utilizzo coprioggetto lavato. </li><li> Incubare actina-legante nella camera per &#39;5-10. </li><li> Blocco siti di legame non specifici sul vetrino di vetro con una proteina di blocco. </li><li> Actina polimerizzano all&#39;interno della camera di flusso in G-actina in polimerizzazione buffer. </li><li> Washout actina non polimerizzato da che scorre in tampone in eccesso. </li></ol>

monitoraggio actina smontaggio con time-lapse microscopia

Monitoraggio Actina Smontaggio con Time-lapse Microscopia

Ok, quello che vorrei fare oggi è mostrarvi come costruire una camera di flusso, una camera di fusione per l'imaging su un microscopio verticale. Quello che poi faccio è creare due spazi usando la pellicola. Quindi quello che faccio è prendere la pellicola para, tagliarla in piccole strisce.Successivamente, questo formerà fondamentalmente i canali per le pareti, e li asciugherò con aria inclinata. Ho messo il vetrino coprioggetti sopra il paragrafo, ed ecco il finito. Poi lo riscaldo su un blocco termico per sciogliere il parametro e creare sostanzialmente una tenuta.Quindi quello che è, è il vetro di copertura qui, e poi sopra il vetro di copertura ci sono due strati di phim come vedete proprio qui. E poi, in cima a questo, di nuovo, c'è un vetrino di 22 metri per due da due metri. Questo proprio qui, che ho premuto contro il param per far cadere il sigillo.Ok, quindi il liquido va in una direzione qui e posso aspirarlo con una carta da filtro qui in questa direzione. E tra un po' vi mostrerò come farlo. Quindi quello che mi piace fare è metterlo in una camera umidificata, che è molto semplice.Prendi due tipi di strisce rialzate e metti un filtro di carta sotto. E per mantenerlo rumoroso come me, ho messo il coperchio, il vetrino sulla camera di flusso. Ora, il modo in cui si introduce una soluzione alla camera è quello di mettere semplicemente la punta della pipetta all'ingresso della camera e si divide semplicemente.Ora quello che faccio è incubare la camera con il coperchio chiuso per 10 minuti. Quello che faccio di solito per aspirare il liquido dall'altra parte è usarlo, prendere una carta da filtro e tagliarlo a strisce sottili come questa. E prendo una di queste strisce sottili e contemporaneamente applico la soluzione all'ingresso mentre metto la carta da filtro all'uscita per aspirare lo scambio, la soluzione.Quindi vedrai il liquido scorrere attraverso la soluzione. E poi aspetto cinque minuti per la chiusura centrale. Ora quello che sono pronto a fare è mettere effettivamente l'actina e l'actina, in realtà devo polimerizzare, polimerizzo all'interno della camera di flusso e sono solo le stesse procedure di prima.Quindi, perché in questo modo, e quindi ora che l'azione è polimerizzata, lavo via tutta l'azione non polimerizzata in eccesso utilizzando un grande volume di solo tampone. Quindi qui ho circa un centinaio di microlitri e sono pochi volumi di camera di reazione di tampone. Solo, sai, quando la carta da filtro si satura, devo cambiare direzione. Ok?E quindi sono pronto a fare l'imaging con questo. Quindi camera di perfusione con actina attaccata ad essa. Ora prendo il vetrino, lo monto al microscopio e, dato che sto visualizzando con un obiettivo a olio, metterò un po' di olio da immersione sulla superficie superiore del coperchio, a contatto con l'erba, in modo da valutare la soluzione o le proteine o qualsiasi cosa sull'azione all'interno.Quindi quello che faccio è poter effettivamente scambiare il lato della soluzione mentre sto facendo l'imaging time lapse. In quanto tale.

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