<ol><li> Costruire una camera di flusso, come mostrato nel video. Assicurarsi che la guarnizione parafilm è stretto e l&#39;utilizzo coprioggetto lavato. </li><li> Incubare actina-legante nella camera per &#39;5-10. </li><li> Blocco siti di legame non specifici sul vetrino di vetro con una proteina di blocco. </li><li> Actina polimerizzano all&#39;interno della camera di flusso in G-actina in polimerizzazione buffer. </li><li> Washout actina non polimerizzato da che scorre in tampone in eccesso. </li></ol>

monitoraggio actina smontaggio con time-lapse microscopia

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Monitoraggio Actina Smontaggio con Time-lapse Microscopia

Ok, quindi quello che vorrei fare oggi è mostrarvi come costruire una camera a flusso, una camera di fusione per l'acquisizione di immagini su un microscopio eretto. Quello che faccio poi è creare due spazi utilizzando un film. Quindi prendo il film di parafilm e lo taglio in piccole strisce.Successivamente, formerò fondamentalmente i canali per le pareti e li asciugo con un flusso d'aria inclinato. Pongo il vetrino coprioggetto sopra il para e, a questo punto, il preparato è completo. Quindi lo riscaldo su un blocco termoregolato per fondere il para e creare fondamentalmente un sigillo.Ciò che abbiamo qui è il vetrino coprioggetto, e sopra di esso si trovano due strati di phim, come si vede proprio qui. E sopra a questo, nuovamente, c'è un vetrino da 22 per 22 millimetri. Questo qui, che ho premuto contro il param per formare il sigillo.Ok, quindi il liquido entra da una parte qui e posso aspirarlo con una carta da filtro da questa parte qui. E tra poco vi mostrerò come fare. Quello che mi piace fare è metterlo in una camera umidificata, che è molto semplice.Prendere due tipi di strisce rialzate e posizionare un filtro di carta al di sotto. Per mantenere il sistema sigillato, metto il coperchio, ovvero il coverslip, sulla camera di flusso. Ora, per introdurre una soluzione nella camera, è sufficiente posizionare la punta della pipetta all'ingresso della camera e lasciar defluire il liquido.Ora procedo incubando la camera con il coperchio chiuso per 10 minuti. Per aspirare il liquido dall'altro lato, di solito prendo una carta filtrante e la taglio in strisce sottili come questa. Prendo quindi una di queste strisce sottili e applico contemporaneamente la soluzione all'ingresso, posizionando la carta filtrante all'uscita per aspirare il liquido di scambio.Quindi vedrete il liquido scorrere attraverso la soluzione. Dopodiché attendo cinque minuti per la chiusura intermedia. Ora sono pronto per inserire effettivamente l'actina, che devo polimerizzare; la polimerizzo all'interno della camera di flusso, seguendo esattamente le stesse procedure di prima.Quindi, poiché è così, e ora che l'azione è polimerizzata, rimuovo tutto l'eccesso di azione non polimerizzata utilizzando un grande volume di solo tampone. Qui ho circa cento microlitri, pari a qualche volume della camera di reazione di tampone. Semplicemente, sapete, quando la carta da filtro è satura, devo cambiare direzione. Va bene?E quindi sono pronto per eseguire l'acquisizione di immagini con questo sistema. Quindi, camera di perfusione con actina fissata ad essa. Ora prendo il vetrino, lo monto sotto il microscopio e, poiché sto acquisendo le immagini con un obiettivo ad immersione in olio, metterò un po' di olio di immersione sulla superficie superiore del coprivetrino, a contatto con la soluzione tampone, in modo da poter analizzare la soluzione o la proteina o qualsiasi altra sostanza presente sull'actina all'interno.Quindi quello che faccio è scambiare effettivamente la soluzione durante l'acquisizione dell'immagine in time lapse. In questo modo.

Monitoraggio Actina Smontaggio con Time-lapse Microscopia

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