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Articolo metodologico

Imaging a montaggio completo per visualizzare e quantificare la struttura periferica del cristallino, la morfologia e l'organizzazione cellulare

1.9K visualizzazioni

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DOI:

10.3791/66017

⸱

19 gennaio 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Delaware, 2School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University, 3Department of Biomedical Engineering, University of Delaware

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

I presenti protocolli descrivono nuove immagini a montaggio intero per la visualizzazione di strutture periferiche nel cristallino oculare con metodi per la quantificazione dell'immagine. Questi protocolli possono essere utilizzati negli studi per comprendere meglio la relazione tra le strutture su microscala delle lenti e lo sviluppo/funzione delle lenti.

Abstract

Il cristallino oculare è un tessuto trasparente e flessibile che altera la sua forma per focalizzare la luce da diverse distanze sulla retina. A parte una membrana basale che circonda l'organo, chiamata capsula, il cristallino è interamente cellulare costituito da un monostrato di cellule epiteliali sull'emisfero anteriore e da una massa di cellule in fibra del cristallino. Nel corso della vita, le cellule epiteliali proliferano nella zona germinativa all'equatore del cristallino e le cellule epiteliali equatoriali migrano, si allungano e si differenziano in cellule fibrose di nuova formazione. Le cellule epiteliali equatoriali alterano sostanzialmente la morfologia da cellule a forma di ciottoli impacchettate in modo casuale in cellule a forma di esagono allineate che formano file meridionali. Le cellule delle fibre del cristallino appena formate mantengono la forma esagonale della cellula e si allungano verso i poli anteriore e posteriore, formando un nuovo guscio di cellule che si sovrappongono alle precedenti generazioni di fibre. Poco si sa sui meccanismi che guidano la notevole morfogenesi delle cellule epiteliali del cristallino in cellule fibrose. Per comprendere meglio la struttura, lo sviluppo e la funzione delle lenti, sono stati sviluppati nuovi protocolli di imaging per l'imaging delle strutture periferiche utilizzando interi supporti di lenti oculari. Qui vengono mostrati i metodi per quantificare lo spessore della capsula, l'area delle cellule epiteliali, l'area e la forma del nucleo cellulare, l'ordine e l'impacchettamento delle cellule della fila meridionale e le larghezze delle cellule delle fibre. Queste misurazioni sono essenziali per chiarire i cambiamenti cellulari che si verificano durante la crescita del cristallino per tutta la vita e comprendere i cambiamenti che si verificano con l'età o la patologia.

Introduzione

Il cristallino oculare è un tessuto flessibile e trasparente situato nella regione anteriore dell'occhio che funziona per focalizzare finemente la luce sulla retina. La capacità di funzionamento dell'obiettivo può essere attribuita, in parte, alla sua intricata architettura e organizzazione 1,2,3,4,5,6. Intorno al tessuto del cristallino c'è la capsula, una membrana basale essenziale per mantenere la struttura del cristallino e le proprietà biomeccaniche 7,8,9. Il cristallino stesso è interamente cellulare, costituito da due tipi di cellule: cellule epiteliali e cellule fibrose. Lo strato epiteliale è costituito da un monostrato di cellule cuboidali che ricoprono l'emisfero anteriore del cristallino10. Nel corso della vita, le cellule epiteliali proliferano e migrano lungo la capsula del cristallino verso l'equatore del cristallino. Le cellule epiteliali anteriori sono quiescenti e a ciottoli in sezione trasversale e, vicino all'equatore del cristallino, le cellule epiteliali proliferano e iniziano a subire il processo di differenziazione in nuove cellule fibrose11,12. Le cellule epiteliali equatoriali si trasformano da cellule impacchettate in modo casuale in file meridionali organizzate con cellule a forma di esagono. La forma esagonale delle cellule viene mantenuta sul lato basale di queste cellule differenzianti, mentre il lato apicale si restringe e si ancora, al fulcro del cristallino o al modiolo 4,13,14,15. Quando le cellule epiteliali equatoriali iniziano ad allungarsi in cellule fibrose di nuova formazione, le punte apicali delle cellule migrano lungo la superficie apicale delle cellule epiteliali anteriori verso il polo anteriore mentre le punte basali si spostano lungo la capsula del cristallino verso il polo posteriore. Le nuove generazioni di celle in fibra si sovrappongono alle precedenti generazioni di celle, creando gusci sferici di fibre. Durante il processo di allungamento e maturazione cellulare, le cellule fibrose alterano sostanzialmente la loro morfologia 11,12,16. Queste cellule fibrose formano la maggior parte della massa del cristallino 11,12,16,17,18.

I meccanismi molecolari che contribuiscono a stabilire le intricate microstrutture del cristallino, la morfologia cellulare e l'organizzazione cellulare unica non sono del tutto noti. Inoltre, il contributo della capsula del cristallino e della struttura cellulare alla funzione complessiva del cristallino (trasparenza, cambiamento di forma del cristallino) non è chiaro. Tuttavia, queste relazioni sono state chiarite utilizzando una nuova metodologia di imaging e valutazioni quantitative delle caratteristiche strutturali e cellulari del cristallino 2,4,19,20,21,22. Sono stati sviluppati nuovi protocolli per l'imaging di lenti intere che consentono una visualizzazione ad alta risoluzione spaziale della capsula del cristallino, delle cellule epiteliali e delle cellule delle fibre periferiche. Ciò include la metodologia per quantificare lo spessore della capsula, la dimensione della cellula, la dimensione e la circolarità del nucleo cellulare, l'ordine delle file meridionali, l'impacchettamento delle cellule in fibra e le larghezze delle celle in fibra. Questi metodi di visualizzazione e quantificazione delle immagini consentono un esame morfometrico approfondito e presentano vantaggi rispetto ad altri metodi di visualizzazione (imaging di supporti piatti o sezioni di tessuto) preservando la struttura complessiva del tessuto 3D. Questi metodi hanno permesso di testare nuove ipotesi e consentiranno un continuo progresso nella comprensione dello sviluppo e della funzione del modello cellulare del cristallino.

Per i seguenti esperimenti, abbiamo utilizzato topi wild-type e Rosa26-tdTomato tandem dimero-Pomodoro (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23 (Jackson Laboratories) nel background C57BL/6J tra le 6 e le 10 settimane, di entrambi i sessi. I topi tdTomato consentono la visualizzazione delle membrane plasmatiche cellulari in lenti vive attraverso l'espressione della proteina tdTomato fusa con gli 8 amminoacidi N-terminali di una proteina MARCKS mutata che prende di mira la membrana plasmatica attraverso la miristilizzazione N-terminale e i siti interni di cisteina-palmitoilazione23. Utilizziamo anche topi NMIIAE1841K/E1841K 24 ottenuti originariamente dal Dr. Robert Adelstein (National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Come descritto in precedenza20, topi NMIIAE1841K/E1841K in background FvBN/129SvEv/C57Bl6 che hanno perdita della proteina del filamento intermedio CP49 (mantiene la morfologia delle cellule a fibra matura e la biomeccanica dell'intera lente), sono reincrociati con topi wild-type C57BL6/J. Abbiamo esaminato la prole per la presenza dell'allele CP49 wild-type.

L'imaging confocale è stato eseguito su un microscopio a fluorescenza confocale a scansione laser con un ingrandimento 20x (NA = 0,8, distanza di lavoro = 0,55 mm, zoom 1x), 40x (NA = obiettivo a olio 1,3, distanza di lavoro = 0,2 mm, zoom 1x) o 63x (obiettivo a olio NA = 1,4, distanza di lavoro = 0,19 mm, zoom 1x). Tutte le immagini sono state acquisite utilizzando una dimensione del foro stenopeico, che è un determinante dello spessore della sezione ottica, a 1 unità di Airy (gli spessori ottici risultanti sono indicati nelle legende delle figure). Le immagini sono state elaborate con il software Zen. Le immagini sono state esportate in formato .tif e poi importate in FIJI ImageJ Software (imageJ.net).

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Protocollo

I topi sono ospitati nella struttura per animali dell'Università del Delaware, mantenuti in un ambiente privo di agenti patogeni. Tutte le procedure sugli animali, compresa l'eutanasia per inalazione di CO2 , sono state condotte in conformità con i protocolli sugli animali approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Delaware.

1. Preparazione e imaging dell'intero innesto dell'obiettivo

  1. Fissaggio di lenti per l'imaging a montaggio intero
    1. Dopo l'eutanasia, enucleare gli occhi e sezionare le lenti come descrittoin precedenza 25. Dopo la dissezione, trasferire immediatamente le lenti in soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS; 1,1 mM KH2PO4, 155 mM, NaCl, 3,0 mM Na2HPO 4-7H2O; pH 7,4) a temperatura ambiente.
      NOTA: La morfologia cellulare può essere alterata se le lenti vengono conservate in PBS per un lungo periodo di tempo, pertanto si consiglia di fissarle immediatamente entro ~10 minuti dalla dissezione.
    2. Per l'imaging a montaggio completo della regione anteriore del cristallino, fissare le lenti intere immergendole in 0,5 mL di paraformaldeide al 4% (PFA) appena prodotta in 1x PBS in una provetta per microcentrifuga a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, lavare le lenti 3 volte (5 minuti per lavaggio) con 1x PBS. Procedere al passaggio 1.2 o conservare in 1x PBS a 4 °C. Le lenti fisse possono essere conservate per un massimo di 5 giorni.
    3. Per l'imaging a montaggio completo della regione equatoriale del cristallino, fissare le lenti intere immergendole in 0,5 mL di PFA al 4% appena prodotto in 1x PBS in una provetta per microcentrifuga a temperatura ambiente. Dopo 1 ora, lavare le lenti 3 volte (5 minuti per lavaggio) con 1x PBS. Procedere al passaggio 1.3 o conservare in 1x PBS a 4 °C. Le lenti fisse possono essere conservate per un massimo di 5 giorni.
  2. Montaggio completo della regione anteriore del cristallino (fisso o sotto tensione)
    1. Per l'imaging a montaggio intero di obiettivi fissi, procedere al punto 1.2.3.
    2. Per l'imaging a montaggio intero di lenti vive, trasferire le lenti in un pozzetto di una piastra a 48 pozzetti contenente 1 mL di Medium 199 (privo di rosso fenolo) contenente l'1% di antibiotico/antimicotico. Incubare le lenti a 37 °C e al 5% di CO2 fino all'imaging. Prima dell'imaging, incubare le lenti in una soluzione contenente Agglutinina di germe di grano marcata con fluorescenza (WGA-640, 1:500) e Hoechst 33342 (1:500) in Medium 199 per almeno 10 minuti. Procedere al passaggio 1.5.
    3. Per colorare la capsula del cristallino, la F-actina e i nuclei di lenti fisse, posizionare le lenti in una soluzione di 500 μL contenente WGA-640 (1:500), rodamina-falloidina (1:50) e Hoechst 33342 (1:500) in tampone di permeabilizzazione/blocco (1x PBS contenente lo 0,3% di tritone, lo 0,3% di albumina sierica bovina (frazione V) e il 3% di siero di capra) in una provetta per microcentrifuga. Colorare le lenti a 4 °C durante la notte.
    4. Dopo l'incubazione notturna, lavare le lenti 3 volte (5 minuti per lavaggio) con 1 ml di PBS 1x. Passare alle lenti per immagini.
    5. Per stabilizzare la lente fissa per l'imaging confocale, creare dei solchi di immobilizzazione della lente in agarosio su una piastra di imaging come descritto in precedenza21 (Figura 1).
      1. Scaldare e mescolare delicatamente l'agarosio al 2% nel PBS usando un microonde fino a quando la soluzione non si sarà liquefatta. Pipettare 250 μL di agarosio liquefatto al 2% in un piatto con fondo di vetro (Figura 1A) e appiattire l'agarosio sul piatto utilizzando un vetrino coprioggetti di plastica flessibile (Figura 1B). Una volta che l'agarosio si è raffreddato e completamente solidificato, rimuovere il vetrino coprioggetto utilizzando una pinza a punta fine (Figura 1C) e utilizzare un punzone da biopsia da 3 mm per creare un foro nell'agarosio al centro della piastra (Figura 1D).
      2. Rimuovere l'agarosio in eccesso utilizzando una salvietta delicata (Figura 1E). Mantenere idratata la muffa di agarosio con 1x PBS e mantenere a 4 °C fino all'uso. Le muffe di agarosio sono state conservate con successo per un massimo di 1 settimana.
    6. Utilizzando una pinza per embrioni, trasferire delicatamente la lente viva o fissa nel cavo dell'agarosio (Figura 1F), contenente ~2 mL di PBS 1x (lente fissa) o Medium 199 privo di rosso fenolo (lente live), quindi posizionare la piastra su un tavolino da microscopio invertito. Per confermare che il cristallino si trova con la regione anteriore rivolta verso l'obiettivo, visualizzare la colorazione dei nuclei. Se non si osservano nuclei, la regione posteriore potrebbe essere rivolta verso l'obiettivo.
    7. Per invertire la lente, utilizzare una pinza curva e ruotare delicatamente la lente ~180° in modo che la regione anteriore sia rivolta verso l'obiettivo. Acquisire immagini utilizzando un microscopio confocale.
    8. Per la visualizzazione delle capsule dell'obiettivo, acquisire immagini z-stack utilizzando un obiettivo 40x con una dimensione del passo di 0,3 μm. Acquisire la prima immagine prima della superficie della capsula del cristallino (indicata dalla colorazione WGA) e l'ultima immagine dopo la superficie apicale delle cellule epiteliali. Per visualizzare le cellule epiteliali, acquisire immagini z-stack utilizzando un obiettivo 63x con una dimensione del passo di 0,3 μm per la visualizzazione delle cellule epiteliali del cristallino.
      NOTA: Questi parametri del microscopio consentono un'adeguata ricostruzione tridimensionale (3D) delle immagini, essenziale per la quantificazione dello spessore della capsula o dell'area delle cellule epiteliali. È anche possibile visualizzare le suture nelle lenti tdTomato con lenti vive eseguendo l'imaging oltre il monostrato di cellule epiteliali come descritto in precedenza4.
  3. Colorazione epiteliale equatoriale del cristallino e delle cellule delle fibre
    1. Posizionare le lenti fisse in una soluzione 0,5 mL di rodamina-falloidina (1:300), WGA-640 (1:250) e Hoechst 33342 (1:500) in una soluzione di permeabilizzazione/blocco (3% BSA, 3% siero di capra e 0,3% Tritone) all'interno di una provetta per microcentrifuga. Mantenere a 4 °C per una notte.
    2. Dopo l'incubazione notturna, lavare le lenti 3 volte in 1 ml 1 PBS (5 minuti per lavaggio).
    3. Creare cunei di agarosio per l'immobilizzazione della lente come descritto in precedenza 4,10.
      1. In breve, creare spicchi di agarosio in piatti con fondo di vetro (FD35-100, WPI) versando ~5-6 mL di agarosio fuso al 2% in 1x PBS nei piatti (Figura 2A). Una volta che l'agarosio si è solidificato (Figura 2B), creare un avvallamento triangolare con una lama affilata (Figura 2C). Rimuovere lo spicchio di agarosio e inserire 1 ml di PBS 1x nel piatto di agarosio (Figura 2D).
      2. Aspirare l'agarosio residuo che potrebbe essere rimasto dal taglio dell'agarosio. È possibile creare più cunei per piatto per adattarsi a più dimensioni diverse di lenti (non mostrate). Per conservare lo stampo di agarosio, posizionare 1 ml di 1x PBS sullo stampo di agarosio e conservare a 4 °C. I cunei possono essere conservati fino a 1 settimana.
    4. Utilizzando una pinzetta curva, posizionare la lente all'interno di uno spicchio di agarosio contenente 1 ml di PBS 1x e regolare in modo che la regione equatoriale della lente sia rivolta verso il basso sul vetro del microscopio sopra l'obiettivo confocale (Figura 2E-F). Per confermare che la regione equatoriale è a fuoco, visualizzare i nuclei e assicurarsi che i nuclei siano allineati in file all'equatore. Le cellule epiteliali equatoriali possono anche essere identificate in quanto sono impacchettate e di forma irregolare. Inoltre, le cellule della fila meridionale sono allineate con precisione e di forma esagonale, indicate dalla colorazione della F-actina sulle membrane cellulari.
    5. Se i nuclei nel campo visivo sono impacchettati in modo casuale, il lato anteriore del cristallino è rivolto verso l'obiettivo. Se i nuclei non possono essere osservati, è molto probabile che il lato posteriore della lente sia rivolto verso l'obiettivo. Se la lente non si trova sull'equatore, riorientare la lente e utilizzare la pinzetta curva per ruotare la lente fino a quando non si osservano i nuclei allineati con precisione all'equatore della lente.
    6. Acquisizione di immagini dell'epitelio equatoriale e delle cellule in fibra utilizzando un microscopio confocale a scansione laser (obiettivo 20x, NA = 0,8, passo 0,5 μm e/o obiettivo a olio 40x, NA = 1,3, passo 0,4 μm). Ruotare le immagini prima della raccolta z-stack, in cui le cellule epiteliali equatoriali sono in alto, seguite dalla fila meridionale e dalle cellule in fibra subito sotto.

2. Metodologia di analisi delle immagini

  1. Misurazione dello spessore della capsula del cristallino
    1. Utilizzando immagini z-stack ottenute con un obiettivo 40x (passo di 0,3 μm) di lenti tdTomato live marcate con WGA o lenti fisse marcate con WGA e rho-falloidina, ottenere una proiezione ottica 2D nella vista XZ della ricostruzione 3D e salvarla in formato .tif. Elabora le immagini utilizzando il software Zen.
    2. Aprire le immagini XZ slice (.tif) nel software FIJI ImageJ.
    3. Per misurare lo spessore della capsula dell'obiettivo, utilizzare la funzione di linea retta (illustrata nella Figura 3A,B). Impostare la larghezza della linea su 50 pixel selezionando Modifica > Opzioni > Larghezza linea. Questa larghezza di linea è stata determinata empiricamente per fornire un elevato rapporto segnale/rumore con le impostazioni del microscopio. La larghezza ottimale della linea può differire su altri microscopi/impostazioni del microscopio o quando si utilizzano lenti di altre specie. Successivamente, traccia una linea dalla superficie superiore della capsula a sotto la regione basale delle cellule epiteliali.
    4. Salvare la riga come area di interesse premendo CTRL + T.
    5. Separa i canali in schede per i canali immagine, colore e divisione.
    6. Misurare l'intensità lungo la linea per il canale della capsula premendo Ctrl + K.
    7. In un foglio di calcolo, traccia i valori di intensità in funzione della distanza e determina i picchi di intensità per la capsula e la F-actina, che rappresentano rispettivamente la superficie della capsula e la regione basale delle cellule epiteliali. Sull'asse x c'è la distanza della linea.
    8. Successivamente, calcolare lo spessore della capsula determinando la distanza tra la capsula e i picchi di intensità fluorescente epiteliale (Figura 3C, D).
  2. Analisi dell'area cellulare
    1. Utilizzando immagini z-stack ottenute utilizzando un obiettivo 63x (NA = 1,4; dimensione del passo 0,3 μm) su lenti tdTomato live o lenti fisse marcate con falloidina, analizzare una fetta di vista XY da un'immagine confocale z-stack corrispondente al punto in cui la regione centrale (laterale) delle cellule epiteliali è a fuoco. Si noti che le membrane laterali sono visibili utilizzando il colorante per membrane tdTomato o visualizzando le falloidine che sono presenti nelle membrane cellulari laterali.
      NOTA: A causa della curvatura dell'obiettivo (come si vede in una vista XZ; Figura 4A-C), non tutte le cellule epiteliali saranno a fuoco nell'immagine. La regione centrale dell'epitelio corrisponde alla regione in cui sono a fuoco sia le membrane laterali cellulari (Figura 4D-E) che i nuclei (Figura 4G-I).
    2. Esporta l'immagine come .tif e aprila in FIJI ImageJ.
    3. Per impostare la scala in FIJI ImageJ per l'analisi, utilizzare lo strumento linea per creare una linea della lunghezza di una barra di scala dall'immagine confocale.
    4. Registra la lunghezza in pixel della linea e la lunghezza della barra della scala. Vai su Analizza dal menu della barra degli strumenti e seleziona Imposta scala. Immettere il numero di pixel che corrisponde alla lunghezza della linea in Distanza in pixel e nell'immettere Distanza nota la lunghezza nota della barra della scala.
    5. Utilizzando la colorazione tdTomato o rodamina-falloidina come indicazione dei confini delle celle, delineare manualmente una popolazione di cellule che sono a fuoco all'interno dell'immagine utilizzando lo strumento poligonale. Tracciare le cellule solo dove le membrane laterali sono visibili (Figura 4E) ed evitare di tracciare cellule parzialmente visibili (cioè ai bordi delle immagini). Salvare il ROI premendo CTRL+T. Vai a Modifica nel menu della barra degli strumenti e seleziona Cancella esterno. Ora misura l'area totale della cella (ROI) premendo Ctrl + M in FIJI ImageJ.
    6. Calcola l'area media delle celle dividendo l'area ROI per il numero totale di celle. Un modo semplice per determinare il numero di cellule è contare il numero di nuclei. Vai al canale dei nuclei (blu). Nel menu ROI, selezionare la struttura ROI salvata delle celle (Figura 4G). Cancella all'esterno del ROI selezionando Modifica e quindi facendo clic su Cancella all'esterno (Figura 4H). Utilizzando lo strumento Multipunto, contare i nuclei facendo clic sui singoli nuclei.
  3. Analisi dell'area e della forma del nucleo cellulare
    1. Per l'analisi dell'area e della forma dei nuclei, analizzare una sezione ottica della vista piana XY da un'immagine confocale z-stack corrispondente al punto in cui la regione centrale (laterale) delle cellule epiteliali tdTomato è a fuoco. Analizzare una fetta z-stack da un'immagine confocale in cui l'area nucleare è la più grande (Figura 5A); Questo rappresenta la porzione centrale dei nuclei.
      NOTA: Si noti che a causa della curvatura della lente, non tutti i nuclei saranno a fuoco, come si può vedere nella vista XZ (Figura 4G e Figura 5A).
    2. Selezionare una sottopopolazione di nuclei che sono a fuoco e salvare un ROI.
    3. Utilizzare la funzione Cancella esterno . All'interno del ROI, utilizzando lo strumento di selezione a mano libera (quarto pulsante del menu da sinistra), tracciare attentamente i bordi dei nuclei (Figura 5B). Salvare ogni traccia nucleare nella finestra ROI premendo CTRL+T. Delineare solo i nuclei in cui i nuclei completi possono essere visti e i nuclei non si toccano.
    4. Una volta delineati tutti i nuclei, misurare l'area nucleare e la forma (cioè la circolarità) delle singole cellule premendo Ctrl+M.
    5. Copia e incolla i dati in un foglio di calcolo e calcola l'area nucleare media e la circolarità (Figura 5C).
  4. Impacchettamento epiteliale della fila meridionale
    1. Per misurare il disturbo della fila meridionale, acquisire immagini utilizzando un obiettivo 20x (passo di 0,5 μm).
    2. Identificare il fulcro dell'obiettivo/modiolo sulle immagini. Il fulcro è la regione in cui le punte apicali delle cellule epiteliali allungate si restringono per formare un punto di ancoraggio durante la differenziazione iniziale delle cellule in fibra e l'allungamento all'equatore. Identificare il fulcro in base all'intensità luminosa della F-actina (indicata dalla punta della freccia nella vista XZ nella Figura 6A; indicata da una linea tratteggiata rossa nella Figura 6B) e al cambiamento nell'organizzazione cellulare in una singola sezione ottica nella vista XY.
      NOTA: Inoltre, la colorazione della F-actina delle regioni basali e apicali delle cellule epiteliali è evidente sopra il fulcro, mentre solo la regione basale delle cellule allungate è evidente sotto il fulcro (Figura 6A). Le cellule epiteliali al di sopra della linea del fulcro sono impacchettate in modo irregolare e tendono a formare rosette, mentre le cellule della fibra al di sotto del fulcro sono disposte in file parallele, indicate da una colorazione brillante di F-actina sulla membrana (Figura 6B).
    3. Una volta identificato il fulcro nei topi di 2 mesi, selezionare la singola sezione ottica ~4,5-5 μm periferica al fulcro (verso la capsula del cristallino) nel piano XY. Questa distanza è selezionata in base all'osservazione che tutti i nuclei delle cellule della fila meridionale nei topi di 2 mesi sono a fuoco quando sono periferici di ~5 μm rispetto al fulcro. Salvare la singola sezione ottica (.tif). Apri l'immagine su FIJI.
      NOTA: Questa analisi è stata eseguita solo su topi di 2 mesi di età e quindi non è possibile concludere se questa distanza cambia con l'età.
    4. Prima di eseguire l'analisi dell'immagine, impostare la scala su μm in ImageJ utilizzando il passaggio 2.2.2.
    5. Delineare manualmente l'intera regione delle righe meridionali utilizzando lo strumento linea a mano libera (regione di interesse/ROI) identificando l'allineamento nucleare, come mostrato nella Figura 7A. Salvare il ROI premendo CTRL+T. Vai a Modifica nel menu della barra degli strumenti e seleziona Cancella esterno. Misura l'area totale della cella (ROI) premendo Ctrl + M in FIJI ImageJ.
    6. Identifica eventuali regioni di disturbo indicate dalla colorazione con F-actina delineandole utilizzando lo strumento linea a mano libera in FIJI ImageJ. I criteri per le regioni disordinate includono la ramificazione delle file, l'impacchettamento irregolare e il disallineamento delle file (Figura 7B), come mostrato in precedenza20.
    7. Misura l'area disordinata delineata/rattoppata premendo Ctrl + M in FIJI ImageJ. Somma l'area disordinata totale in un foglio di calcolo.
    8. Dividi l'area disordinata totale per l'area ROI, quindi moltiplica per 100 per ottenere una percentuale di area disordinata. Se non si osserva alcun disturbo, impostare un valore pari a 0% per l'area disordinata.
  5. Numero di riga meridionale delle celle adiacenti
    1. Per misurare il numero di cellule vicine, utilizzare immagini colorate con F-actina acquisite con un obiettivo a olio 40x (passo di 0,4 μm).
    2. Identificare una sezione ottica (piano XY) nella regione basale delle cellule della fila meridionale verso l'interno della capsula del cristallino in cui la F-actina è arricchita lungo l'intero perimetro delle cellule della riga meridionale, tutte le cellule della fila meridionale sono a fuoco e si trovano sullo stesso piano.
    3. Contare il numero di celle adiacenti di ciascuna cella di riga meridionale (Figura 8). Misura la percentuale media di celle con sei celle adiacenti in un foglio di calcolo.
      NOTA: Determinare il numero di celle adiacenti con un obiettivo 20x. Tuttavia, è molto più facile osservare la forma esagonale con un obiettivo 40x.
  6. Analisi delle immagini delle cellule in fibra equatoriale
    1. Acquisisci immagini confocali z-stack di lenti colorate con rodamina falloidina con un obiettivo 20x (passo di 0,5 μm).
    2. Identificare il fulcro come indicato al punto 2.4.2. Una volta individuato il fulcro, selezionare una singola sezione ottica. A scopo di standardizzazione e per confrontare le lenti, quantificare le larghezze delle celle delle fibre ~10 μm verso l'interno dal fulcro nel piano XY (Figura 9A).
    3. Esporta le immagini raw in FIJI ImageJ. In FIJI ImageJ, tracciare una linea (di solito lunga ~300-400 μm) attraverso diverse celle di fibre adiacenti per misurare la distanza tra i picchi colorati con F-actina (analisi di scansione lineare; Figura 9A; linea rosa).
    4. Ottenere l'intensità della fluorescenza sulla distanza di scansione lineare in FIJI premendo CTRL+K. Successivamente, esportare i dati nel foglio di calcolo per calcolare la distanza tra i picchi (esempio mostrato nella Figura 9A-B). Ciò corrisponde alle larghezze delle celle delle fibre.

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Risultati

Capsula anteriore del cristallino, area delle cellule epiteliali e area nucleare
Per analizzare lo spessore della capsula dell'obiettivo, abbiamo colorato le capsule dell'obiettivo, in lenti live o fisse, con WGA. Abbiamo identificato le cellule epiteliali del cristallino marcando le membrane con tdTomato in lenti vive (Figura 2A) o tramite la colorazione rodamina-falloidina per la F-actina sulle membrane cellulari nelle lenti fisse (Figura 2B

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Discussione

I protocolli descritti consentono la visualizzazione ad alta risoluzione spaziale delle strutture e delle cellule periferiche del cristallino nelle regioni anteriori ed equatoriali del cristallino. In questo studio, sono stati mostrati metodi per la visualizzazione di strutture periferiche dell'obiettivo utilizzando lenti intatte (sotto tensione o fisse) in cui l'architettura complessiva dell'obiettivo 3D è preservata. Inoltre, sono stati forniti metodi semplici per l'analisi quantitativa morfometrica utilizzando il soft...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Eye Institute Grant R01 EY032056 to CC e R01 EY017724 al VMF, nonché dal National Institute of General Medical Sciences con il numero di sovvenzione P20GM139760. S.T.I è stato supportato da NIH-NIGMS T32-GM133395 come parte del programma di formazione pre-dottorato Chemistry-Biology Interface e da un premio per studiosi laureati dell'Università del Delaware.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Punzone per biopsia da 3 mmAcuderm IncNC9084780
AgarosioApex BioResearch Products20-102GP
Antimicotico/AntibioticoCytivaSV30079.01
Siero bovino Albumina (Frazione V)Prometheus25-529
Salviette per attività delicateKimwipe
Piatto con fondo in vetro ( Fluorodish)World Precision InternationalFD35-100
Hoescht 33342Biotium40046
Microscopio confocale a scansione laser 880Zeiss
MatTek Imaging Dish MatTekLife SciencesP35G-1.5-14
Paraformaldeide Scienze della microscopia elettronica100503-917
PBSGenClone25-507B
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Rodammina-FalloidinaThermo Fisher00027
Triton X100Sigma-Aldrich11332481001
WGA-640BiotiumCF 640R

Riferimenti

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