Articolo metodologico

Isolamento in un'unica fase di vescicole extracellulari da campioni di grande volume con un dispositivo microfluidico A4F biforcato

DOI:

10.3791/66019

⸱

2 febbraio 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Latvian Biomedical Research and Study Centre, 2Institute of Solid-State Physics, University of Latvia, 3Cellbox labs LTD, Atari, 4Faculty of Materials Science and Applied Chemistry, Institute of General Chemical Engineering, Riga Technical university

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le vescicole extracellulari sono estremamente promettenti per le applicazioni biomediche, ma gli attuali metodi di isolamento richiedono molto tempo e non sono pratici per l'uso clinico. In questo studio, presentiamo un dispositivo microfluidico che consente l'isolamento diretto di vescicole extracellulari da grandi volumi di biofluidi in modo continuo con passaggi minimi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le vescicole extracellulari (EV) hanno un immenso potenziale per varie applicazioni biomediche, tra cui la diagnostica, la somministrazione di farmaci e la medicina rigenerativa. Tuttavia, le attuali metodologie per isolare i veicoli elettrici presentano sfide significative, come la complessità, il consumo di tempo e la necessità di apparecchiature ingombranti, che ostacolano la loro traduzione clinica. Per affrontare queste limitazioni, abbiamo mirato a sviluppare un innovativo sistema microfluidico basato su copolimero olefinico ciclico fuori stechiometria tiolo-ene (COC-OSTE) per l'isolamento efficiente di EV da campioni di grandi volumi in modo continuo. Utilizzando la separazione basata sulle dimensioni e sulla galleggiabilità, la tecnologia utilizzata in questo studio ha ottenuto una distribuzione dimensionale significativamente più stretta rispetto agli approcci esistenti da campioni di urina e terreni cellulari, consentendo il targeting di specifiche frazioni di dimensioni EV in applicazioni future. Il nostro innovativo design del dispositivo microfluidico COC-OSTE, che utilizza la tecnologia di frazionamento del flusso di campo a flusso asimmetrico biforcato, offre un approccio di isolamento EV semplice e continuo per campioni di grandi volumi. Inoltre, il potenziale per la produzione di massa di questo dispositivo microfluidico offre scalabilità e coerenza, rendendo fattibile l'integrazione dell'isolamento delle vescicole extracellulari nella diagnostica clinica di routine e nei processi industriali, dove l'elevata coerenza e produttività sono requisiti essenziali.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le vescicole extracellulari (EV) sono particelle legate alla membrana derivate dalle cellule che comprendono due tipi principali: esosomi (30-200 nm) e microvescicole (200-1000 nm)1. Gli esosomi si formano attraverso la gemmazione verso l'interno della membrana endosomiale all'interno di un corpo multivescicolare (MVB), rilasciando vescicole intraluminali (ILV) nello spazio extracellulare dopo la fusione con la membrana plasmatica1. Al contrario, le microvescicole sono generate dalla gemmazione verso l'esterno e dalla fissione della membrana cellulare2. Le vescicole extracellulari svolgono un ruolo cruciale nella comunicazione intercellulare trasportando proteine, acidi nucleici, lipidi e metaboliti, riflettendo lo stato fisiologico della cellula, tra cui la crescita, l'angiogenesi, le metastasi, la proliferazione e la resistenza alla terapia3. Di conseguenza, sono emersi come promettenti biomarcatori e bersagli terapeutici per malattie, incluso il cancro, evidenziando il loro potenziale nella diagnostica e nei sistemi di somministrazione dei farmaci4.

Per utilizzare appieno le vescicole extracellulari nella diagnostica e nella terapia delle malattie, è fondamentale un isolamento efficiente da vari biofluidi5. I metodi comuni includono l'ultracentrifugazione (UC), la centrifugazione a gradiente di densità, la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC), la filtrazione e l'immunoisolamento6. L'UC è una tecnica ampiamente utilizzata, ma può produrre particelle di densità simile che non sono EV e possono generare aggregati EV7. La SEC ha guadagnato popolarità grazie alla sua capacità di fornire campioni di purezza più elevata escludendo le particelle in base alle dimensioni piuttosto che alla densità8. Tuttavia, un'attenta selezione della dimensione dei pori appropriata per la colonna SEC e l'ottimizzazione delle condizioni cromatografiche sono essenziali per ridurre al minimo il co-isolamento di particelle indesiderate come i chilomicroni e le lipoproteine a bassa densità8. Nonostante la loro efficacia, entrambi i metodi richiedono molto tempo e sono difficili da automatizzare, soprattutto per campioni di volume maggiore come i terreni cellulari o le urine, limitandone la scalabilità per le applicazioni industriali9.

Negli ultimi anni, il frazionamento asimmetrico del campo di flusso di campo (A4F) si è evoluto come una potente tecnica di separazione per la separazione di particelle di dimensioni micro e nanometriche basata su dimensioni e galleggiabilità10. Il principio di funzionamento di A4F si basa su un canale microfluidico dotato di una membrana porosa alla sua base, che genera una forza esercitata verso la membrana chiamata cross-flow10. Se combinato con il moto browniano e il flusso di Poiseuille inerente al sistema, il flusso incrociato facilita un'efficiente separazione delle particelle grazie alla variazione della posizione delle particelle all'interno della dinamica del flusso11. Nonostante i vantaggi, questo metodo è limitato a volumi di campione nell'ordine dei microlitri12 e richiede un'ulteriore fase di messa a fuoco, prolungando la durata del processo10.

Nell'ultimo decennio, la microfluidica ha guadagnato importanza come strumento per una separazione rapida, efficiente e clinicamente affidabiledelle EV 13. Tuttavia, la maggior parte dei metodi microfluidici progettati per la separazione delle EV sono ottimizzati per campioni di piccole dimensioni e ad alta concentrazione o dipendono da procedure di separazione complesse14. Inoltre, nel campo della microfluidica, il polidimetilsilossano (PDMS) è riconosciuto come il materiale standard aureo grazie alla sua trasparenza ottica, alla biocompatibilità e alla facilità d'uso15. Tuttavia, la sua nota propensione ad assorbire piccole molecole lipofile, comprese le vescicole extracellulari, può essere problematica per la sua applicazione nel campo delle vescicole extracellulari13.

Il copolimero ciclico di olefine (COC) è un materiale frequentemente utilizzato in microfluidica a causa della biocompatibilità, del piccolo assorbimento delle molecole e dell'elevata resistenza chimica15. Tuttavia, la fabbricazione di dispositivi COC comporta spesso processi complessi o apparecchiature specializzate16. In alternativa, il tiolo-ene fuori stechiometria (OSTE) è un'alternativa promettente al PDMS grazie al ridotto assorbimento di piccole molecole, alla stabilità chimica superiore, alla facilità di fabbricazione e al processo di fabbricazione scalabile17,18. Tuttavia, a causa dei complessi collegamenti ai tubi, i dispositivi possono essere soggetti a perdite19.

Lo scopo di questo studio è stato quello di ingegnerizzare e fabbricare un dispositivo microfluidico che combinasse OSTE e COC e il principio A4F biforcato per la separazione delle EV da campioni di grandi volumi come urina o terreni cellulari.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La raccolta dei campioni è stata approvata dal Comitato etico per la ricerca sulle scienze mediche e della vita dell'Università lettone (decisione N0-71-35/54)

NOTA: I materiali utilizzati in questo studio sono inclusi nel file Tabella dei materiali .

1. Fabbricazione di stampi stampati tridimensionali (3D)

  1. Progettare uno stampo doppio negativo a forma di serpentina in un software CAD con le seguenti dimensioni per il canale superiore: altezza di 0,5 mm, larghezza di 1 mm e lunghezza di 210 mm. Per il canale inferiore, utilizzare lo stesso design con una larghezza di 1,5 mm, un'altezza di 0,6 mm e una lunghezza di 210 mm. Le dimensioni come la larghezza, la lunghezza, l'altezza dello stampo e l'illustrazione isometrica del design sono mostrate nella Figura 1. Salva il progetto come file .stl.
  2. Preparare il file in Z-Suite; Non è necessario aggiungere alcun supporto. Stampa gli stampi utilizzando una stampante 3D con display a cristalli liquidi ultravioletti (UV LCD) con resina nera resistente.
  3. Dopo la stampa, rimuovere con cautela gli stampi dalla superficie della stampante. Lavare gli stampini in isopropanolo (IPA) in sonicazione per 20 min.
  4. Asciugare gli stampi con N2.
  5. Esporre gli stampi all'esposizione all'allagamento utilizzando un filtro ND33 per 810 s, quindi metterli in forno a 60 °C per 48 h.

2. Preparazione degli stampi PDMS

  1. Peso PDMS in rapporto 10:1 p/p (per ogni stampo, utilizzare 16 g di base elastomerica e 1,6 g di agente reticolante). Miscelare i componenti in un mescolatore centrifugo planetario, mescolando per 1 min a 500 RPM.
  2. Colare il PDMS misto negli stampi stampati in 3D e degassare in un essiccatore sottovuoto a -800 mbar per 30 minuti o fino a quando non si osservano bolle.
  3. Posizionare con cautela un rivestimento in cloruro di polivinile di 100 μm di spessore sopra il PDMS liquido.
    NOTA: Applicare lentamente la fodera da un lato all'altro per evitare la formazione di bolle.
  4. Inserire lo stampo con PDMS in una maschera Mold-in-Place e serrare la maschera utilizzando una chiave dinamometrica impostata su 0.3 Nm.
  5. Mettere la maschera in forno a 60 °C per 3 ore per polimerizzare il PDMS.
  6. Smontare la maschera utilizzando una chiave esagonale e rimuovere lo stampo stampato in 3D dalla dima.
  7. Sformare con cura gli stampi PDMS dagli stampi master stampati in 3D, correndo intorno ai bordi dello stampo con un bisturi, quindi rimuovendo lo stampo con una pinzetta.
    NOTA: Per una più facile rimozione della muffa, è possibile utilizzare l'IPA; tuttavia, gli stampi devono essere riscaldati a 60 °C per 10 minuti per far evaporare l'IPA in eccesso.

3. Preparazione del canale superiore OSTE-COC

  1. Peso OSTE con rapporto 1,09:1 p/p (per 5 dispositivi sono necessari 1,56 g di parte A e 1,44 g di parte B). Miscelare i componenti in un mescolatore centrifugo planetario: miscelare per 5 min a 750 RPM, quindi degassare per 5 min a 750 RPM.
  2. Trasferire l'OSTE miscelato in una provetta da centrifuga e degassare a -800 mbar in un essiccatore sottovuoto per 30 minuti.
  3. Pulire i vetrini COC con 2 x 16 connettori mini Luer mediante sonicazione in alcool isopropilico per 10 min. Asciugare accuratamente i vetrini con N2.
  4. Posizionare i vetrini COC puliti nell'asher al plasma in modo che la superficie piana sia posizionata verso l'alto e trattare la superficie con plasma di ossigeno 800 SCCM per 2 minuti a una potenza di 700 W con una pressione di 0.133 mbar.
  5. Posizionare il vetrino COC ossidato sullo stampo PDMS per il canale superiore in modo che la superficie trattata sia a contatto con la superficie strutturata del PDMS. Posizionare il gruppo in una dima Mold-in-Place, serrando la dima con una chiave dinamometrica impostata su 0.3 Nm.
  6. Collegare il sistema di pressione alla linea dell'aria compressa a 6 bar. Prendere la provetta da centrifuga con OSTE degassata e assemblarla secondo le istruzioni del sistema a pressione utilizzando un tubo in politetrafluoroetilene (PTFE) con diametro interno (ID) di 0.8 mm.
  7. Collegare il tubo in PTFE all'ingresso dello stampo PDMS e, utilizzando una pressione di 1000 mbar mantenuta da una pompa piezoelettrica situata nel sistema di pressione, riempire il dispositivo. Posizionare la dima con il lato di vetro rivolto verso l'alto nell'allineatore della maschera ed esporre con una dose di 850 mJ utilizzando il filtro ND33.
  8. Dopo l'esposizione, smontare la maschera utilizzando una chiave esagonale e rimuovere con cautela il vetrino COC con lo strato OSTE strutturato dallo stampo PDMS.
  9. Portare l'OSTE strutturato a contatto con una membrana di 25 mm x 75 mm con pori di 50 nm e densità dei pori dell'11,8% in modo che i canali siano completamente ricoperti dalla membrana.
    NOTA: È particolarmente importante mantenere la membrana il più dritta possibile durante il processo di applicazione.
  10. Posizionare il gruppo su una piastra riscaldante impostata a 60°C con il lato della membrana rivolto verso l'alto, posizionare un vetrino pulito sopra la membrana e applicare una pressione di 1.6 kPa dall'alto per garantire un legame uniforme. Riscaldare il gruppo durante la notte.
    NOTA: Dopo questo passaggio, è particolarmente importante valutare le prestazioni di incollaggio e la deformazione del canale.

4. Preparazione del canale inferiore OSTE-COC e assemblaggio del dispositivo

  1. Miscelare OSTE con un rapporto p/p di 1,09:1 (per 5 dispositivi sono necessari 1,56 g di parte A e 1,44 g di parte B). Miscelare i componenti in un mescolatore centrifugo planetario: miscelare per 5 minuti a 750 RPM, quindi degassare per 5 minuti a 750 RPM.
  2. Trasferire l'OSTE miscelato in un tubo di falco e degassare a -800 mbar in un essiccatore sottovuoto per 30 minuti.
  3. Pulire i vetrini COC mediante sonicazione in alcool isopropilico per 10 minuti. Asciugare accuratamente i vetrini con N2.
  4. Posizionare i vetrini COC puliti nel plasma asher e trattare la superficie con plasma di ossigeno 800 SCCM per 2 minuti a una potenza di 700 W con una pressione di 0,133 mbar.
  5. Posizionare il vetrino COC ossidato sullo stampo PDMS per il canale inferiore in modo che la superficie trattata sia a contatto con la superficie strutturata del PDMS. Posizionare il gruppo in una dima Mold-in-Place, serrando la dima con una chiave dinamometrica impostata su 0.3 Nm.
  6. Prendere il tubo Falcon con OSTE degassato e assemblarlo secondo le istruzioni del sistema di pressione utilizzando un tubo in PTFE con ID di 0.8 mm.
  7. Collegare il tubo in PTFE all'ingresso dello stampo PDMS e utilizzando una pressione di 1000 mbar riempire il dispositivo. Posizionare la maschera con il lato di vetro rivolto verso l'alto nell'allineatore della maschera ed esporre con una dose di 1100 mJ utilizzando il filtro ND33.
  8. Dopo l'esposizione, smontare la maschera utilizzando una chiave esagonale e rimuovere con cautela il vetrino COC con lo strato OSTE strutturato dallo stampo PDMS.
  9. Combinare lo strato OSTE strutturato con l'assieme del canale superiore in modo che il design dello strato superiore e inferiore sia allineato tra loro e che lo strato inferiore OSTE sia a contatto con la membrana.
  10. Inserire il disegno in una dima Mold-in-Place e, utilizzando clip bulldog, applicare una pressione di 1,6 kPa al dispositivo in modo uniforme. Mettere la maschera in forno a 60°C per una notte.
    NOTA: Il posizionamento irregolare delle clip può causare un incollaggio irregolare.

5. Valutazione del dispositivo

  1. Dopo l'incollaggio, valutare visivamente i dispositivi con un microscopio per difetti visivi, ad esempio deformazione del canale o incollaggio non riuscito.
  2. Testare i dispositivi senza difetti facendo passare acqua deionizzata filtrata da 0,02 μm attraverso i canali con una pressione di 30 mbar. Osservare le perdite del canale di flusso e della porta Luer e il flusso d'acqua.
    NOTA: Se non è possibile rilevare alcuna perdita e il flusso del canale è ininterrotto, i dispositivi sono considerati utilizzabili per ulteriori esperimenti.

6. Configurazione del dispositivo

  1. Riempire due siringhe da 5 mL con 2 mL di 20 nm filtrati al 3% H2O2 e montarle su una pompa a siringa (utilizzare le frecce di movimento per la distanza necessaria, inserire le siringhe e fissarle in posizione con la barra superiore).
    CAUTELA! Prestare sempre attenzione quando si maneggia H2O2. Indossa un camice da laboratorio, guanti di gomma protettivi e protezione per gli occhi.
  2. Collegare il tubo in PTFE ID 800 μm lungo 14 cm alle siringhe utilizzando gli aghi della siringa e agli ingressi del dispositivo utilizzando i connettori Luer.
  3. Collegare un tubo in polietere etere chetone (PEEK) con ID da 20 cm e 200 μm alle uscite.
  4. Collegare l'altra estremità del tubo in PEEK a un contenitore per rifiuti. La configurazione può essere illustrata nella Figura 3.
  5. Avviare la pompa a siringa alla velocità di flusso di 500 μL/min per ciascun ingresso (sullo schermo dello strumento: Impostazioni > Sistema Set > Siringa (produttore: siringa medica, siringa: 5 mL) > Pulsante Indietro > Parametri (Selezionare: infusione, Ripetizione: 1, Volume: 1,5 mL, Flusso: 500 μL/min) > Pulsante Indietro > Pulsante Indietro ). Raccogliere il flusso passante in un contenitore per rifiuti.
  6. Riempire due nuove siringhe da 5 mL con 2 mL di etanolo filtrato al 70% a 20 nm.
  7. Sostituire le siringhe precedenti con le siringhe riempite di etanolo e avviare la pompa a siringa utilizzando gli stessi parametri descritti al punto 6.5.
  8. Utilizzare nuove siringhe da 5 mL e riempirle con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato filtrato (PBS) a 20 nm.
  9. Sostituire le siringhe precedenti con le siringhe riempite di PBS e sciacquare il dispositivo con 4 mL di PBS ripetendo i passaggi 6.1. e 6.5.
    NOTA: Assicurarsi di modificare i parametri di configurazione del sistema su Volume: 4 mL (sullo schermo dello strumento: Impostazioni > Parametri > (Selezionare: Volume: 4 mL).
  10. Scollegare il tubo dal dispositivo e chiudere ogni ingresso e uscita con spine Luer.
    NOTA: Lasciare il PBS nel dispositivo ed evitare di intrappolare l'aria aggiungendo ulteriore PBS su ciascun ingresso e uscita utilizzando una micropipetta prima della chiusura.
  11. Lasciare il dispositivo per una notte in un luogo buio a temperatura ambiente (RT).
  12. Il giorno seguente, lavare il dispositivo riempito di PBS con 4 mL di PBS filtrato a 20 nm (come descritto al punto 6.8).
  13. Raccogliere l'ultimo 1 mL del flusso da entrambe le uscite in una provetta da 2 mL a basso legame con proteine e conservare a 4 °C come bianco per le particelle introdotte dal dispositivo.
  14. Rimuovere le siringhe riempite di PBS e sostituirle con nuove siringhe da 5 ml riempite d'aria.
  15. Spurgare il dispositivo con 4 ml di aria fino a quando tutto il liquido non è uscito dal dispositivo e dal tubo.

7. Test del dispositivo con perline di lattice standardizzate

  1. Preparare un campione standardizzato di microsfere utilizzando polistirene da 1,0 μm e perle di carbossilato da 0,1 μm. A una provetta da 15 mL, aggiungere 500 μL di standard di microsfere di polistirene da 1,0 μm, 1 μL di standard di microsfere di carbossilato da 0,1 μm e 9499 μL di PBS filtrato da 20 nm (la concentrazione finale della miscela di microsfere da 1,0 e 0,1 μm sarà rispettivamente di 5 × 108 perline/mL e di 3,6 × 1010 perline/mL).
  2. Vorticare il campione di microsfere per 30 s e conservarlo a +4 °C quando non è in uso.
  3. Riempire una nuova siringa da 5 mL con 1,5 mL della miscela di microsfere standardizzata e un'altra con 1,5 mL di PBS filtrato a 20 nm.
  4. Rimuovere le siringhe precedentemente collegate e collegare la siringa della miscela di perline al primo tubo di ingresso e l'altro al secondo ingresso.
  5. Rimuovere il contenitore dei rifiuti e preparare almeno cinque provette per microcentrifuga da 0,5 mL per ciascun tubo di uscita.
  6. Modificare i parametri di avvio del sistema della pompa a siringa su Volume: 1 mL; Portata: 250 μL/min.
    NOTA: A seconda delle esigenze dell'utente, è possibile impostare diverse velocità di flusso come 250 μL/min, 200 μL/min, 150 μL/min, 100 μL/min e 50 μL/min. Si raccomanda uno studio preliminare per scegliere la velocità più favorevole per il risultato desiderato.
  7. Avviare la pompa a siringa e raccogliere il deflusso - da 5 a 6 goccioline in ciascuna provetta per microcentrifuga.
    NOTA: Se lo stesso dispositivo viene utilizzato più volte, sciacquare il dispositivo come descritto al punto 6.8 e sostituire tutti i connettori, le spine e gli aghi. Lavare i connettori, le spine e gli aghi usati lasciandoli in etanolo filtrato al 70% a 20 nm per almeno 30 minuti. Quindi, spostare tutte le parti in una provetta contenente acqua deionizzata filtrata a 20 nm, agitare accuratamente la provetta e trasferirle in una capsula di Petri contenente 20 mL di acqua deionizzata filtrata a 20 nm. Lasciare la capsula di Petri sullo shaker per almeno 30 minuti a 100 giri/min, quindi lasciare asciugare le cose in una capsula di Petri asciutta (per almeno 12 ore) prima di riutilizzarla.

8. Test del dispositivo con campioni di urina

  1. Preparare il dispositivo come descritto nei passaggi 6.1-6.15.
  2. Raccogliere 100 ml di urina mattutina per donatore utilizzando contenitori sterili per urina e consegnarla al laboratorio per l'elaborazione entro 2 ore dalla raccolta.
  3. Separare ogni campione di urina in due provette da 50 mL e centrifugare a 2'000 x g per 15 minuti a RT.
  4. Raccogliere il surnatante e gettare il pellet.
  5. Centrifugare il surnatante a 10'000 x g per 30 minuti a RT per eliminare le particelle di grandi dimensioni e i detriti cellulari.
  6. Raccogliere il surnatante e gettare il pellet.
  7. Lavare il dispositivo come descritto al punto 6.6.
  8. Sostituire le siringhe da 5 mL con una siringa da 20 mL riempita con il campione di urina preparato per l'ingresso del campione e un'altra siringa da 20 mL riempita con 20 mL di DEPC-PBS filtrato da 20 nm per l'ingresso del tampone. Modificare le impostazioni della pompa a siringa in BDPlastipak; Siringa: cc; Capacità: 20 mL; Portata: 250 μL/min (portata ottimale), analogamente a quanto descritto al punto 6.2. Avviare la pompa a siringa e raccogliere il flusso da ciascuna uscita in provette separate da 50 ml.
  9. Concentrare ogni flusso a flusso singolo utilizzando 100.000 provette di concentrazione cut-off a peso molecolare a 100 μL ciascuna a 3.000 x g a 4 °C.
  10. Trasferire i concentrati in provette per microcentrifuga da 0,5 mL.
  11. Agitare i campioni concentrati per 30 secondi, quindi ruotare per 10 secondi.
  12. Aliquotare i campioni trasferendo 25 μL di campione per provetta, etichettarli e congelarli a -80 °C per la conservazione a lungo termine.

9. Test del dispositivo con mezzi condizionati

  1. Preparare il dispositivo come descritto nei passaggi 6.1-6.15.
  2. Cellule di coltura in un ambiente umidificato al 5% di CO2 a 37 °C fino a quando il conteggio totale raggiunge i 100 milioni secondo Bajo-Santos et al.20 Passaggio delle cellule in un singolo pallone di sospensione T175 in 100 mL di terreno privo di siero integrato con integratore sostitutivo del siero B-27 al 2% e coltura in un ambiente umidificato al 5% di CO2 a 37 °C per ulteriori 48 ore.
  3. Raccogliere la sospensione cellulare e centrifugarla a 300 x g per 5 minuti a RT per eliminare le cellule.
  4. Raccogliere e centrifugare nuovamente il surnatante a 3.000 x g per 30 minuti a +4 °C per eliminare le particelle di grandi dimensioni e i detriti cellulari.
  5. Raccogliere il surnatante e conservarlo a +4°C fino a quando la separazione può avvenire, ma non più di 3 ore.
  6. Sostituire le siringhe da 5 mL con siringhe da 20 mL riempite con il terreno condizionato preparato per l'ingresso del campione e riempite con 20 mL di PBS filtrato da 20 nm per l'ingresso del tampone.
  7. Impostare le impostazioni nella stazione di pompaggio come descritto al punto 7.8.
  8. Avviare la pompa a siringa e raccogliere il flusso da ciascuna uscita in una provetta separata da 50 ml.
  9. Concentrare ogni flusso in modo separato utilizzando 100.000 provette di concentrazione cut-off a peso molecolare da 150 μL ciascuna a 3.000 x g a +4 °C.
  10. Trasferire i concentrati in provette per microcentrifuga da 0,5 mL.
  11. Campioni concentrati a vortice per 30 s.
  12. Centrifugare i campioni concentrati per 10 s.
  13. Aliquotare i campioni trasferendo 25 μL di campione per provetta, etichettarli e congelarli a -80 °C per la conservazione a lungo termine.

10. Isolamento delle vescicole extracellulari mediante ultracentrifugazione

  1. Centrifugare 20 mL di urina o terreni cellulari condizionati a 100.000 x g per 70 minuti a +4 °C utilizzando una centrifuga con rotore ad angolo fisso.
  2. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 20 mL di PBS filtrato a 20 nm.
  3. Centrifugare di nuovo, come spiegato al punto 10.1.
  4. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 12 mL di PBS filtrato a 20 nm.
  5. Centrifugare a 100.000 x g per 70 minuti a +4 °C utilizzando un rotore oscillante.
  6. Scartare il surnatante.
    NOTA: Prestare attenzione quando si scarta il surnatante questa volta. Si consiglia di farlo con una pipetta.
  7. Risospendere il pellet in 100 μL di PBS filtrato a 20 nm.
  8. Aliquotare il campione e procedere alla sezione 12 per la caratterizzazione delle EV. In caso contrario, conservare a -80 °C fino al nuovo utilizzo.

11. Isolamento delle vescicole extracellulari mediante cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC)

  1. Concentrare 20 mL di urina o terreni cellulari condizionati a 500 μL utilizzando unità filtranti centrifughe a 100 kDa a 3.000 x g a +4 °C per 15 min.
  2. Trasferire il concentrato sulla colonna SEC (intervallo di carico di 35 nm).
  3. Versare il PBS filtrato a 20 nm sulla colonna e raccogliere 15 frazioni da 0,5 mL.
  4. Analizza le frazioni con un sistema di diffusione dinamica della luce (DLS) seguendo le istruzioni del produttore.
  5. Raggruppa le frazioni selezionate. Scegliere frazioni con un attenuatore inferiore a 11 e almeno il 30% delle particelle totali di dimensioni superiori a 40 nm.
  6. Concentrare le frazioni selezionate a 100 μL utilizzando unità filtranti centrifughe a 3 kDa con cut-off a peso molecolare (MWCO) a 14.000 x g a +4 °C per 15 min.
  7. Aliquotare il campione e passare alla sezione 12 per la caratterizzazione delle EV. In caso contrario, conservare a -80 °C fino al nuovo utilizzo.

12. Caratterizzazione delle EV

  1. Prelevare il campione da caratterizzare dal congelatore e scongelarlo lentamente (su un blocco di ghiaccio o a +4 °C).
  2. Eseguire l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) per determinare la distribuzione granulometrica e la quantità13. Eseguire il test di immunoassorbimento enzimatico legato all'enzima a doppio sandwich (dsELISA) della proteina di membrana delle cellule T ad alta affinità (TIM-4)14 per confermare la presenza di EV nei campioni.

13. NTA

  1. Vorticare il campione EV scongelato per 30 s e centrifugare per 10 s, quindi trasferire 1 μL a 999 μL di PBS filtrato da 20 nm in una provetta da microcentrifuga da 2 mL per diluirlo di 1000 volte. Conservare 1 mL di PBS extra utilizzato per la diluizione per verificare che non contenga particelle. Conservare il tutto a +4 °C fino alla misurazione.
    NOTA: Filtrare il PBS attraverso un filtro da 0.02 nm prima dell'uso.
  2. Agitare il campione EV o il bianco per 30 secondi e inserirlo nel modulo utilizzando una siringa. Riempire il modulo con circa 0,7 mL di campione e inserirlo nello strumento.
  3. Misurare il campione utilizzando lo strumento analizzatore di nanoparticelle seguendo le istruzioni del produttore.

14. dsELISA per marcatori EV

  1. Preparare una soluzione di 1 μg/mL di proteina TIM4-Fc. Rivestire i pozzetti di una piastra ELISA a 96 pozzetti trasferendo 100 μL di soluzione in ciascun pozzetto necessario e incubare per una notte a +4 °C agitando a 200 giri/min.
  2. Il giorno seguente, preparare la soluzione di lavaggio (1x TBS + 0,05% Tween20 + 2 mM CaCl2).
  3. Scartare tutto il liquido in ogni pozzetto. Lavare ogni pozzetto aggiungendo 200 μL di soluzione di lavaggio, agitando a 200 giri/min per 5 minuti a RT e scartando. Ripeti questo passaggio due volte.
  4. Preparare la soluzione bloccante (1x TBS + 0,05% Tween20 + 1% albumina sierica bovina. Aggiungere 200 μL di soluzione bloccante a ciascun pozzetto e incubare a RT per 1 ora agitando a 200 giri/min.
  5. Lavare ogni pozzetto come descritto al punto 14.3.
  6. Preparare 220 μL di ciascuna diluizione del campione nel tampone di lavaggio (la concentrazione ottimale di EV è 2,7 × 105 EVs/μL). Aggiungere 100 μL di campione diluito per pozzetto ed eseguire due repliche. Incubare a RT per 90 minuti agitando a 200 giri/min.
  7. Lavare ogni pozzetto come descritto al punto 14.3.
  8. Aggiungere 100 μL di anticorpi corrispondenti a ciascun pozzetto. Utilizzare marcatori EV appropriati per confermare la presenza di vescicole extracellulari e contaminanti4. Incubare a RT per 2 ore agitando a 200 RPM. NOTA: Se si utilizzano anticorpi secondari, ripetere i passaggi 14.7-14.8. Tuttavia, ridurre il periodo di incubazione degli anticorpi secondari a 1 ora.
  9. Lavare ogni pozzetto come descritto al punto 14.3.
  10. Aggiungere 100 μL di substrato di perossidasi di rafano in ciascun pozzetto, mescolare la piastra per 1 minuto e incubare a RT per 30 minuti.
  11. Aggiungere 1 M H2SO4 a ciascun pozzetto per arrestare la reazione.
  12. Utilizzando un lettore per micropiastre, misurare l'assorbanza a 450 nm.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbiamo fabbricato un dispositivo microfluidico utilizzando uno stampo a doppio negativo stampato in 3D (Figura 1) tramite litografia morbida (Figura 2A) per la separazione di EV ad alta produttività basata sul principio A4F biforcato (Figura 2B,C). La configurazione richiede una pompa e una stazione di flusso, come si può vedere nella Figura 3, per l'isolamento dei veicoli elettrici in modo automatizzato. In primo luogo, per valutare la prova di concetto dei dispositivi, è stata preparata una miscela di perle di polistirene con diametri di 100 nm e 1000 nm per rappresentare vescicole e detriti cellulari fini, rispettivamente10. Sono stati condotti esperimenti con portate variabili per la miscela di microsfere, sia con che senza flusso biforcato, per studiare l'effetto della velocità lineare sull'efficienza di separazione. In tutti gli esperimenti, il recupero di piccole perle è rimasto costante e superiore al 90%10, dimostrando il potenziale del dispositivo per il recupero delle vescicole extracellulari.

Quindi, abbiamo valutato e confrontato il potenziale del dispositivo COC-OSTE nell'isolare le vescicole extracellulari da grandi volumi (>1 mL) da biofluidi complessi con una pre-elaborazione minima. Pertanto, l'urina di 10 donatori sani (Figura 4) e i terreni cellulari di due diverse linee cellulari prostatiche (Figura 5) sono stati utilizzati come modello per isolare simultaneamente le vescicole extracellulari seguendo tre diverse procedure: ultracentrifugazione (UC), cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) e il dispositivo OSTE-COC basato sulla microfluidica A4F. Dopo l'isolamento, il numero totale di particelle e la loro distribuzione dimensionale sono stati valutati utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA). In media, il dispositivo OSTE-COC ha mostrato un migliore recupero totale delle particelle dai biofluidi rispetto all'UC, ma la significatività statistica è stata raggiunta solo quando si combinano i numeri di particelle di entrambe le porte (Figura 4A). Al fine di confrontare le prestazioni del dispositivo con altri sistemi, è necessario prendere in considerazione l'uscita R & L insieme. Come mostrato nella Figura 4, le prestazioni dell'uscita L & R nel recupero delle EV superano UC e SEC. Separatamente, la porta L è stata progettata per catturare la piccola frazione EV, mentre la porta R è stata progettata per raccogliere la frazione EV più grande con altre molecole di dimensioni simili. È interessante notare che il recupero utilizzando l'R-PORT del dispositivo OSTE-COC è stato leggermente superiore a SEC e UC da soli (Figura 4A). L'espressione di CD63 ha mostrato un pattern simile (Figura 4C). Questo risultato indica che il dispositivo OSTE-COC è stato più efficace nel recupero totale delle vescicole extracellulari. È stata trovata una distribuzione granulometrica equivalente tra le diverse metodologie, ad eccezione della UC, che mostra una maggiore distribuzione granulometrica (Figura 4B).

Risultati comparabili sono stati osservati nelle colture di terreni cellulari. In entrambi gli scenari, il recupero totale delle particelle da entrambe le porte del dispositivo ha mostrato prestazioni superiori rispetto alle metodologie SEC o UC (come illustrato nella Figura 5A,B). In particolare, le vescicole extracellulari derivate da cellule PC3 hanno dimostrato una distribuzione dimensionale distinta, con una maggiore omogeneità nella distribuzione L-PORT rispetto ad altri gruppi sperimentali (Figura 5C,D). Inoltre, l'analisi dell'espressione di CD63 ha confermato i tassi di recupero delle EV più elevati ottenuti utilizzando il dispositivo COC-OSTE (come illustrato nella Figura 5E,F). Una sintesi che confronta le caratteristiche di isolamento delle diverse metodologie esaminate in questo studio è riportata nella Tabella 1.

figure-results-1
Figura 1: Dimensioni dello stampo doppio negativo a forma di serpentina 3DP e vista isometrica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Dispositivo microfluidico COC-OSTE. (A) Schema delle diverse fasi principali di fabbricazione del dispositivo OSTE-COC. (B) Principio di funzionamento del dispositivo. (C) Immagine del dispositivo finito. Barra graduata: 15 mm. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Priedols et al.10 e Bajo-Santos et al.20. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Configurazione sperimentale del dispositivo. La pompa a siringa è a sinistra, il dispositivo OSTE-COC è al centro e la stazione di recupero è a destra. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Priedols et al.10 e Bajo-Santos et al.20. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Distribuzione delle dimensioni delle vescicole extracellulari urinarie e recupero delle particelle da 10 donatori utilizzando l'ultracentrifugazione (UC), la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) e il dispositivo COC-OSTE. (A) Quantità di particelle recuperata da ciascun metodo di isolamento mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA). Dati rappresentati come deviazione standard media +/-. Significatività statistica indicata con * (p<0,05). (B) I boxplot mostrano la distribuzione granulometrica media tra tutti i campioni di urina valutati mediante NTA, con baffi che indicano i valori minimo e massimo. I valori P sono stati derivati da confronti con UC, con **** che indica un'elevata significatività statistica (p<0,0001). (C) La mediana e l'intervallo della quantità media di CD63, valutata utilizzando il test di immunoassorbimento enzimatico a doppio sandwich (dsELISA), per ciascun metodo di isolamento, sono stati calcolati su tutti i campioni. Porta L: porta sinistra; Porta R: porta destra. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Bajo-Santos et al.20. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-5
Figura 5: Caratterizzazione di EV isolate da cellule PC3 e LNCaP utilizzando metodi diversi. (A) Quantità di particelle recuperata dal mezzo PC3 utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) rappresentata dalla deviazione standard media+/-. (B) Quantità di particelle recuperate dal terreno cellulare LNCaP utilizzando NTA rappresentato come deviazione standard media +/-. (C) La distribuzione granulometrica mediana delle vescicole extracellulari delle colture PC3, insieme all'intervallo, è stata determinata mediante NTA. (D) Distribuzione dimensionale mediana di vescicole extracellulari isolate da colture LNCaP con range. (E) Mediana e range di espressione di CD63 per ciascun metodo di isolamento per EV derivate da linee cellulari PC3, utilizzando il test di immunoassorbimento enzimatico a doppio sandwich (dsELISA). (F) Mediana e range di espressione di EV CD63 derivata da LNCaP mediante dsELISA per ciascun metodo di isolamento. UC: Ultracentrifugazione; SEC: Cromatografia ad esclusione dimensionale; Porta L: porta sinistra; Porta R: porta destra. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Bajo-Santos et al.20. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

UCSECONDOCOC-OSTE
Tempo di lavorazione/campione++/+++++++
Velocità effettiva++++++
Costo/campione++++++
Purezza++++++
Automatizzazione++++++
Rendimento EV+++++++
Selezione della taglia+++++

Tabella 1. Confronto delle caratteristiche di isolamento delle vescicole extracellulari con i tre metodi: UC SEC e il dispositivo COC-OSTE. UC: Ultracentrifugazione; SEC: Cromatografia ad esclusione dimensionale. COC-OSTE: copolimero olefinico ciclico-off-stechiometria tiolo-ene. +: basso; ++: medio; +++: alto. * A seconda del dispositivo.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il dispositivo microfluidico presentato offre un metodo promettente per l'isolamento e l'estrazione di vescicole extracellulari da fluidi biologici, affrontando alcuni dei limiti critici dei metodi gold standard esistenti come UC e SEC12. UC e SEC sono noti per essere laboriosi, dispendiosi in termini di tempo e soffrono di un basso rendimento, il che li rende meno adatti per applicazioni ad alto rendimento in cui sono necessarie grandi quantità di veicoli elettrici21,22. Al contrario, il dispositivo microfluidico descritto è in grado di elaborare in modo continuo un volume sostanziale fino a 20 mL di fluido biologico con un input minimo da parte dell'utente, il che lo rende un potenziale punto di svolta per ambienti industriali o clinici. Uno dei principali vantaggi di questo dispositivo microfluidico è la sua capacità di standardizzare l'isolamento delle vescicole extracellulari e migliorare la riproducibilità rispetto ai metodi tradizionali che prevedono passaggi manuali. Riducendo la variabilità della produzione di dispositivi di isolamento EV attraverso la produzione di massa, le prestazioni del dispositivo possono essere meglio controllate e coerenti, il che è fondamentale per applicazioni come la terapia e la diagnostica basate su EV. Inoltre, la compatibilità del dispositivo con la produzione di grandi volumi tramite stampaggio a iniezione a reazione di substrati idonei ne migliora ulteriormente il potenziale di scalabilità e di adozione più ampia.

Per garantire la riproducibilità e la costanza delle prestazioni, è necessario un protocollo esteso e ben definito, sia per produrre il chip che per il suo utilizzo negli esperimenti. Il chip è stato progettato pensando all'industrializzazione. Tuttavia, durante la fabbricazione del dispositivo nell'ambiente di laboratorio, è necessario prestare attenzione a evitare la formazione di bolle, garantire un legame preciso e robusto e condurre test approfonditi a velocità di flusso più elevate di quelle previste negli esperimenti reali. Questa precauzione è particolarmente importante per i dispositivi COC-OSTE, in quanto possono essere soggetti a perdite a causa di un collegamento non riuscito, soprattutto a portate più elevate. Inoltre, poiché l'OSTE è un materiale fotosensibile, la fabbricazione del dispositivo deve essere eseguita in luce gialla per evitare un'esposizione non necessaria ai raggi UV. Poiché questa tecnologia è ancora nelle sue fasi iniziali, i ricercatori dovrebbero sperimentare diverse velocità di flusso per identificare l'impostazione ottimale per la loro applicazione specifica, poiché i protocolli standardizzati per questo nuovo metodo devono ancora essere stabiliti e la viscosità del liquido può chiaramente influenzare l'efficacia dell'isolamento delle EV sulla base dei nostri risultati. Seguendo queste linee guida e affrontando le sfide della standardizzazione, il potenziale di questo dispositivo microfluidico per l'isolamento delle vescicole extracellulari può essere pienamente realizzato in varie aree di ricerca e applicazioni.

Il metodo di isolamento delle vescicole extracellulari utilizzando il dispositivo microfluidico consente ampie modifiche e risoluzione dei problemi per ottimizzare le prestazioni. Per migliorare la separazione delle particelle, i ricercatori possono esplorare canali più lunghi, diverse porosità della membrana e densità dei pori e dimensioni alterate. Se ci sono molte particelle di grandi dimensioni nell'uscita di piccole particelle, può essere utile testare una velocità di ingresso del tampone più elevata, mentre se ci sono molte particelle piccole nell'uscita di particelle grandi, si consiglia di sperimentare un canale più lungo o una membrana con pori più grandi. Affrontare l'assorbimento delle particelle può comportare la regolazione della velocità del flusso, delle modifiche superficiali e della composizione dell'OSTE o la modifica del tempo di esposizione ai raggi UV. Per i dispositivi che presentano instabilità e perdite, la riduzione della velocità di flusso e la garanzia di un corretto incollaggio sono passaggi cruciali. Per ridurre al minimo i danni causati dalle vescicole extracellulari, i ricercatori possono ridurre la velocità del flusso, lavare con PBS in modo più accurato dopo la sterilizzazione del dispositivo e prendere in considerazione l'utilizzo di pori della membrana più piccoli o tecniche e materiali alternativi per la progettazione di stampi. Attraverso queste regolazioni, il dispositivo microfluidico può essere messo a punto, liberando il suo potenziale per diverse applicazioni nella ricerca sui veicoli elettrici e nei campi correlati. Inoltre, per ottimizzare le prestazioni del dispositivo, è stato possibile incorporare la caratterizzazione del campione a monte, comprese le misure di densità e viscosità, per regolare i parametri di flusso. Inoltre, particolare enfasi deve essere posta sulla natura del campione, data la non sterilità accertata dei biofluidi23. Di conseguenza, la sterilizzazione dei campioni prima della loro somministrazione in applicazioni cliniche dovrebbe essere debitamente presa in considerazione.

Nonostante queste sfide, il dispositivo microfluidico ha un immenso potenziale in varie aree di ricerca. La sua capacità di isolare continuamente le vescicole extracellulari da grandi volumi di campioni altamente eterogenei apre le porte all'automazione, facilitando le applicazioni ad alto rendimento e consentendo un'analisi più approfondita delle vescicole extracellulari provenienti da fonti diverse. L'integrazione di questo modulo microfluidico in diversi dispositivi, come le cartucce di bioreattori a fibra cava o i citometri a flusso ad alta risoluzione, potrebbe rendere le applicazioni EV più favorevoli all'industria e guidare l'innovazione in campi come la somministrazione di farmaci, la diagnostica e i cosmetici4. Nel complesso, questo dispositivo microfluidico rappresenta un significativo passo avanti nel campo della ricerca sulle vescicole extracellulari, offrendo un metodo efficiente e standardizzato per l'isolamento delle vescicole extracellulari con applicazioni promettenti in un'ampia gamma di ambienti di ricerca e industriali.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.A., G.M. e R.R. sono fondatori, membri del consiglio di amministrazione e azionisti di Cellbox Labs, LLC

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo tutti i donatori che hanno partecipato a questo studio, il personale del database del genoma lettone per aver fornito i campioni. L'Istituto di Fisica dello Stato Solido dell'Università della Lettonia come Centro di Eccellenza ha ricevuto finanziamenti dal Programma Quadro Horizon 2020 H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2 dell'Unione Europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. 739508, progetto CAMART2. Questo lavoro è stato sostenuto dal Progetto n. lzp-2019/1-0142 e progetto n.: lzp-2022/1-0373.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,1 µ m carbossilato FluoSpheresInvitrogen#F8803Concentrazione di riserva: 3,6 x 1013 perle/mL (dipendente dal LOTTO)
0,5 mL provette per microcentrifugaStarstedt72.704
1 mL Siringa a cono Luer monouso senza agoRAYSTUB1ML
1.0 &; m polistirene FluoSpheresInvitrogen#F13083Concentrazione di riserva: 1 x 1010 perline/mL (dipendente dal LOTTO)
10 mL Pipette sierologicheSarstedt86.1254.001
15 mL (100k) Filtri centrifughi Amicon UltraMerck MilliporeUFC910024
2,0 mL Provette Protein LoBindEppendorf30108132
siringhe da 20 mLBD PlastikPak
250 µ m ID polietere etere chetonetubo Darwin MicrofluidicsCIL-1581
3 kDa MWCO unità di filtraggio centrifugoMerck Millipore,UFC200324
5 mL siringa medica senza agoAnhui Hongyu Wuzhou Medical159646
50 mL provette conicheSarstedt62.547.254
70 Ti rotore per ultracentrifuga ad angolo fissoBeckman Coulter
800 µ m ID tubo in politetrafluoroetileneDarwin MicrofluidicsLVF-KTU-15
Micropiastra a 96 pozzetti, f-bottom, legatura medicaGreiner Bio-One655001piastra ELISA
B-27 Integratore (50x), senza sieroThermo Fisher Scientific17504044
Albumina sierica bovinaSigmaAldrichA7906-100G
COC Topas piattaforma per vetriniper microscopiaMicrofluidic Chipshop10000002
COC Topas piattaforma per vetrini per microscopia 2 x 16 Mini Luer Chipshop Microfluidic 10000387
Regolatore di pressione Elveflow OB1Gruppo
Connettori LuerDarwin Microfluidics  CS-10000095
Allineatore maschera Suss MA/BA6SUSS MicroTec Group
Mixer Thinky ARE-250Thinky Corporation
NanoSight NS300Malvern PanalyticalNS300analizzatore di nanoparticelle 
Microscopio ottico Nikon Eclipse LV150NNikon Metrology NV
OSTE 322 Crystal ClearMercene Labs
PBS TABLETS.Ca/Mg gratuito. Bioreagenti Fisher. 100 gFisher ScientificBP2944-100
Membrana PC (diametro dei pori 50 nm, densità 11,8%)it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgio
Piastre di Petri, steriliSarstedt82.1472.001
Plasma Asher GIGAbatch 360 MPVA TePla America, LLC
qEVoriginal/colonna 35 nmColonna
Izon SP5 SECQSIL 216 Kit elastomero siliconicoPP& S
Resin Tough BlackZortrax
SW40 Ti swing ultracentrifuge rotoreBeckman Coulter331301
Pompa a siringaDK InfusetekISPLab002
T175 pallone di sospensioneSarstedt83.3912.502
TIM4-Fc proteinaAdipogen LifeSciencesAG-40B-0180B-3010
TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina)SigmaAldrichT0440-100MLSubstrato di perossidasi di rafano
Tween20SigmaAldrichP1379-100ML
Ultracentrifuga Optima L100XPBeckman Coulter
Unità di pulizia ad ultrasuoni P 60 HElma Schmidbauer GmbH
Spettrofotometrouniversale per micropiastreBio-Tek instruments71777-1
Tazza per la raccolta delle urine, 150 ml, sterileAPTACA2120_SG
Filtro per siringa Whatman Anotop 25SigmaAldrich68092002
Zetasizer Nano ZSMalvern Sistema didiffusione dinamica della luce (DLS)
Zortrax Guglia d'inchiostroZortrax
10569215337922Elvesys panalitico.

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Colombo, M., et al. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
  2. Tricarico, C., et al. Biology and biogenesis of shed microvesicles. Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).
  3. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4 (1), 27066(2015).
  4. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  5. Wang, Z. Extracellular vesicles as an emerging drug delivery system for cancer treatment: Current strategies and recent advances. Biomed Pharmacother. 153, 113480(2022).
  6. Royo, F., et al. Methods for separation and characterization of extracellular vesicles: Results of a Worldwide Survey Performed by the ISEV Rigor and Standardization Subcommittee. Cells. 9 (9), 1955(2020).
  7. Sidhom, K., et al. A review of exosomal isolation methods: Is size exclusion chromatography the best option. Int J Mol Sci. 21 (18), 6466(2020).
  8. Reshi, Q. U. A., et al. Isolation of extracellular vesicles (EVs) using benchtop size exclusion chromatography (SEC) columns. Methods Mol Biol. 2273, 201-206 (2021).
  9. Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. J Chromatogr A. 1636, 461773(2021).
  10. Priedols, M., et al. Bifurcated asymmetric field flow fractionation of nanoparticles in PDMS-free microfluidic devices for applications in label-free extracellular vesicle separation. Polymers. 15 (4), 789(2023).
  11. Zhang, H., Lyden, D. Asymmetric-flow field-flow fractionation technology for exomere and small extracellular vesicle separation and characterization. Nat Protoc. 14 (4), 1027-1053 (2019).
  12. Talebjedi, B., et al. Exploiting microfluidics for extracellular vesicle isolation and characterization: Potential use for standardized embryo quality assessment. Front Vet Sci. 7, 620809(2020).
  13. van Meer, B. J., et al. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophys Res Commun. 482 (2), 323-328 (2017).
  14. Jia, Y., et al. Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications. Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).
  15. Bussooa, A., et al. Real-time monitoring of oxygen levels within thermoplastic Organ-on-Chip devices. Biosensors and Bioelectronics: X. 11, 100198(2022).
  16. Tang, L., Lee, N. Y. A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature. Lab Chip. 10 (10), 1274-1280 (2010).
  17. Borda, E., et al. Conformable neural interface based on off-stoichiometry thiol-ene-epoxy thermosets. Biomaterials. 293, 121979(2023).
  18. Sandström, N., et al. Reaction injection molding and direct covalent bonding of OSTE+ polymer microfluidic devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 25 (7), 075002(2015).
  19. Sticker, D., et al. Thiol-ene based polymers as versatile materials for microfluidic devices for life sciences applications. ACS Appl Mater Interfaces. 12 (9), 10080-10095 (2020).
  20. Bajo-Santos, C., et al. Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device. Int J Mol Sci. 24 (9), 7971(2023).
  21. Claridge, B., et al. Development of extracellular vesicle therapeutics: Challenges, considerations, and opportunities. Front Cell Dev Biol. 9, 734720(2021).
  22. Rezaie, J., et al. Review on exosomes application in clinical trials: Perspective, questions, and challenges. Cell Commun Signal. 20 (1), 145(2022).
  23. Aragón, I. M., et al. The urinary tract microbiome in health and disease. Eur Urol Focus. 4 (1), 128-138 (2018).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Extracellular VesiclesEV IsolationMicrofluidic DeviceAsymmetric Flow FractionationLarge Volume SamplesSize Based SeparationBiofluid ProcessingUrine Sample PreparationParticle RecoveryUltracentrifugation

Articoli correlati