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Articolo metodologico

Chirurgia di bypass duodenale-digiunale in topi diabetici obesi indotti dalla dieta

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DOI:

10.3791/66049

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18 ottobre 2024

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1Jinshazhou Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, 2General Hospital of Southern Theatre Command, 3Department of Cardiovascular Surgery, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, 4Zhongshan Institute for Drug Discovery, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, 5School of Laboratory and Biotechnology, Southern Medical University, 6Guangzhou Hualiang Qingying Biotechnology Co. Ltd

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

La chirurgia di bypass duodenale-digiunale (DJB) può migliorare il metabolismo del glucosio e ridurre la resistenza all'insulina. Qui, presentiamo un protocollo per stabilire un modello murino stabile e affidabile di DJB.

Abstract

La prevalenza dell'obesità e del diabete di tipo 2 è un serio problema di salute globale. L'obesità è un importante fattore patogeno nel diabete di tipo 2, nelle malattie cardiovascolari e in alcuni tipi di cancro. La chirurgia bariatrica offre un'opzione di trattamento efficace e a lungo termine sia per l'obesità che per il diabete. La gastrectomia a manica (SG) e il bypass gastrico Roux-en-Y (RYGB) sono ampiamente riconosciuti come gli interventi di chirurgia bariatrica più popolari. Inoltre, diversi interventi di chirurgia bariatrica esplorativa hanno dimostrato promettenti effetti terapeutici. Il bypass duodenale-digiunale (DJB), specificamente studiato per i diabetici con basso indice di massa corporea, ha mostrato esiti metabolici benefici. Tuttavia, i suoi benefici metabolici indipendenti dal peso non sono completamente compresi a causa dei modelli animali limitati. In questo articolo, descriviamo i protocolli di cura ottimizzati e le tecniche chirurgiche per l'esecuzione della chirurgia DJB nei topi diabetici obesi indotti dalla dieta (DIO). L'utilizzo di un modello murino contribuisce a una migliore comprensione della natura dei cambiamenti indotti dalla chirurgia DJB, facilitando al contempo la pratica clinica correlata.

Introduzione

L'obesità e il diabete di tipo 2 sono le malattie croniche più comuni al mondo e la loro prevalenza è in aumento tra igiovani 1. La chirurgia bariatrica è il trattamento più efficace per l'obesità e il diabete, facilitando la stabilità della glicemia a lungo termine e migliorando anche le complicanze associate all'obesità 2,3. Esistono diversi tipi di chirurgia bariatrica, classificati in base al fatto che riducano il volume gastrico o l'assorbimento intestinale; Questi includono restrittivi, malassorbivi e combinazioni 4,5.

Il bypass duodenale-digiunale (DJB) è stato sviluppato per la prima volta da Rubino e Marescaux, che hanno dimostrato che il diabete di tipo 2 può essere alleviato collegando il duodeno e il digiuno piuttosto che riducendo il volume gastrico 6,7. La DJB preserva l'intero stomaco e bypassa l'intero duodeno e il digiuno prossimale. L'intestino è diviso in arti biliopancreatici, digestivi e comuni 6,8. Il DJB condivide alcune somiglianze con gli interventi di chirurgia bariatrica, tra cui il bypass gastrico Roux-en-Y (RYGB), il bypass mini-gastrico, il bypass biliopancreatico, la diversione duodenale e la DJB più la gastrectomia a manica9. Rispetto al RYGB, il DJB non richiede un'anastomosi gastrointestinale, il che riduce il tempo operatorio e migliora il tasso di successo della procedura. Il DJB è simile al RYGB nel migliorare il metabolismo del glucosio ma non influisce sul peso corporeo10. Dopo l'intervento chirurgico di DJB, la rapida somministrazione di cibo nell'intestino tenue distale stimola la secrezione del peptide-1 simile al glucagone (GLP-1), con conseguente miglioramento del metabolismo del glucosio11,12.

L'uso di modelli animali è essenziale per comprendere le vie metaboliche, cellulari e molecolari. I modelli animali di chirurgia bariatrica hanno contribuito alla nostra comprensione dei potenziali meccanismi alla base dell'obesità e del diabete13,14. Tuttavia, a causa delle differenze fisiologiche tra le specie, è impossibile replicare perfettamente le malattie umane nei modelli animali15. Tra i vari modelli animali disponibili per scopi di ricerca, il modello murino di obesità indotta dalla dieta (DIO) assomiglia più da vicino all'obesità umana e alla sindrome metabolica16. I topi sono stati selezionati per la chirurgia DJB per determinare la fattibilità dell'intervento chirurgico e per fornire tecniche per ulteriori ricerche. Questo manoscritto fornisce un riassunto completo sia degli aspetti tecnici che dei dettagli sperimentali della chirurgia DJB.

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Protocollo

Tutte le fasi del protocollo descritte di seguito seguono le linee guida del Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Ospedale Generale del Comando del Teatro Meridionale con il numero di approvazione 2020112501.

1. Preparazione preoperatoria generale

NOTA: Sono stati acquistati trenta topi maschi C57BL/6 di 6 settimane. I topi sono stati alloggiati in un laboratorio privo di patogeni specifici (SPF) con un ciclo luce/buio di 12 ore; temperatura, 22 ± 2 °C; e umidità, 55-65%. Ai topi è stato dato libero accesso all'acqua e sono stati alimentati con una dieta a base di grassi al 60% di kcal per 6 settimane per indurre l'obesità. Un'iniezione intraperitoneale di 40 mg/kg di streptozotocina è stata somministrata per 5 giorni per indurre il diabete17. Tra i trenta topi, ventidue topi sono stati sottoposti a screening per la glicemia casuale > 300 mg/dL e assegnati in modo casuale ai gruppi DJB (n=15) e chirurgia fittizia (n=7). Otto topi sono stati esclusi dall'esperimento a causa della glicemia scadente.

  1. Digiunare i topi per 8 ore prima dell'intervento. Prelevare l'acqua 2 ore prima dell'intervento.
  2. Somministrare una soluzione di pentobarbital sodico all'1% (6 mL/kg) e buprenorfina (1 mg/kg) per via intraperitoneale. Tocca le dita dei piedi o la coda dei topi con una pinza e assicurati che i topi non mostrino contrazioni o tremori evidenti. In anestesia adeguata, i topi possono respirare liberamente senza ossigeno supplementare.
  3. Posizionare i topi in posizione supina su una tavola sterile e sotto uno stereomicroscopio. Applicare un unguento per gli occhi sugli occhi. Usa una coperta elettrica per mantenere i topi caldi durante la procedura. Utilizzare procedure sterili, inclusi camici chirurgici, guanti sterili e strumenti autoclavati.
  4. Nei topi di controllo fittizi, praticare le due incisioni rispettivamente nel duodeno 1 cm sotto il piloro e nel digiuno 5 cm sotto il Treitz e quindi suturare le incisioni.

2. Bypass digiunale duodenale: procedura chirurgica

  1. Applicare la pasta depilatoria dallo xifoide all'addome per rimuovere i peli da questa regione. Pulisci la crema e assicurati che la pelle sia pulita. Strofinare l'area tre volte con uno scrub alternato di soluzioni di iodio e alcol.
  2. Coprire il topo con un telo sterile, lasciando scoperta l'area operativa, e praticare un'incisione di 2 cm dallo xifoide all'addome.
  3. Utilizzare un divaricatore addominale per esporre la cavità addominale. Spingere via il grasso addominale usando un batuffolo di cotone umido e spostare il fegato sul lato cefalico per esporre completamente lo stomaco e l'intestino.
  4. Lo stomaco e il piloro si trovano al di sotto del fegato e il legamento di Treitz si trova al duodeno distale. Doppia legatura del digiuno, 5 cm distalmente al legamento di Treitz con una sutura di seta 6-0 (Figura 1A). Tagliare il digiuno nel punto medio delle due legature e suturare il moncone digiunale con una sutura di seta 10-0 (Figura 1B).
    NOTA: Evitare di torcere i vasi sanguigni mesenterici.
  5. Tirare l'incisione digiunale prossimale di 5 cm lungo l'intestino fino al digiuno per creare un'anastomosi digiunale-digiunale. Allineare i due intestini orizzontalmente, quindi utilizzare una sutura di seta 10-0 per creare l'anastomosi laterale (Figura 1C).
    NOTA: Durante l'intervento chirurgico, mantenere l'intestino umido con soluzione fisiologica per ridurre la perdita di acqua. Ciò impedirà all'intestino di arricciarsi e renderà più facile la sutura.
  6. Fissare entrambe le estremità dell'intestino e tagliare l'incisione alla stessa lunghezza (Figura 1D). Sutura il secondo strato della parete intestinale posteriore con una sutura continua a tutto spessore.
    NOTA: La lunghezza dell'incisione è di circa 0,5-0,6 cm e la distanza dell'ago è di ~0,5 mm.
  7. Fissare entrambe le estremità dell'intestino e suturare la parete anteriore dell'intestino. Sutura il primo strato della parete anteriore con una semplice sutura continua e il secondo strato con una sutura varo orizzontale (Figura 1E-F).
    NOTA: Tamponare il contenuto intestinale con tamponi di cotone per prevenire l'infezione della cavità addominale.
  8. Tirare l'incisione digiunale distale nel duodeno 1 cm sotto il piloro per creare un'anastomosi duodenale-digiunale (Figura 1G). Suturarlo utilizzando lo stesso metodo dei passaggi 2.6-2.7 (Figura 1H-K).
    NOTA: Controllare la sutura nell'angolo anastomotico per ridurre le perdite anastomotiche.
  9. Legare l'intestino con la micro pinza e tagliare l'intestino con le micro forbici. Legare due volte il duodeno con una sutura di seta 6-0, a 2 mm dall'estremità distale dell'anastomosi duodenale-digiunale. Tagliare nel punto medio con micro forbici e suturare il moncone con una sutura di seta 10-0 (Figura 1L).
    NOTA: I vasi gastroduodenali si ramificano perpendicolarmente alla testa del pancreas e sono adiacenti al piloro, richiedendo un'attenta esplorazione dei vasi nella sezione trasversale. La confluenza del dotto biliare comune e del duodeno è stata localizzata, facendo attenzione a non danneggiare il pancreas o il dotto biliare comune.
  10. Sciacquare la cavità addominale con soluzione fisiologica a 30 °C. Riporta l'intestino nella cavità addominale. Sutura il muscolo e la pelle separatamente con una seta 6-0. Quindi, disinfettare la pelle con iodoforo.
  11. Dopo l'intervento chirurgico, iniettare soluzione fisiologica a 30 °C (30 ml/kg) per via sottocutanea nella parte posteriore per prevenire la disidratazione. Iniettare la penicillina (10 mg/kg) per via intramuscolare per prevenire l'infezione.

figure-protocol-1
Figura 1: Procedura di bypass duodenale-digiunale. (A) Posizione del digiuno 5 cm distalmente al legamento di Treitz. (B) Legare due volte il digiuno con seta 6-0, tagliato al centro della legatura. (C) Anastomosi digiunale-digiunale. (D) Praticare un'incisione di 0,5-0,6 cm e suturare la parete posteriore. (E-F) Anastomosi digiunale-digiunale completa. (G) Tirare il digiunale distale fino al duodeno 1 cm sotto il piloro. (H) Anastomosi duodenale-digiunale. (I) Tagliare l'anastomosi duodenale-digiunale con un'incisione di 0,5-0,6 cm e suturare la parete posteriore con una semplice sutura continua. (J-K) Anastomosi duodenale-digiunale completa. (L) A 2 mm dall'anastomosi distale a quella duodenale-digiunale, legare due volte il duodeno con seta 6-0 e tagliare al centro della legatura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Assistenza postoperatoria generale

  1. Dopo l'intervento chirurgico, posiziona i topi su una coperta elettrica per prevenire l'ipotermia. Lascia che i topi striscino liberamente fino a quando non si svegliano completamente prima di tornare nelle loro gabbie.
  2. Il giorno postoperatorio, limitare il cibo e l'acqua e iniettare 2 ml di soluzione salina per via sottocutanea nella parte posteriore dei topi. Il primo giorno postoperatorio, somministrare 10 ml di glucosio al 10% e una bevanda funzionale (rapporto 1:1) senza cibo e iniettare 1 ml di soluzione fisiologica per via sottocutanea.
  3. Il secondo e il terzo giorno postoperatorio, nutrire i topi con una miscela di 20 ml di glucosio al 10% e una bevanda funzionale. Dopo il quarto giorno, dai ai topi acqua pura e una dieta ricca di grassi. L'alimentazione di transizione deve essere eseguita in base allo stato di recupero postoperatorio nel seguente ordine: cibo in soluzione, semiliquido o solido.
  4. Analgesia postoperatoria: iniettare buprenorfina (0,1 mg/kg) ogni 12 ore dal giorno 1 al giorno 3, e poi una volta al giorno fino al giorno 5.
  5. Dopo l'intervento chirurgico, osservare le condizioni di alimentazione, l'attività, le feci e la guarigione delle ferite dei topi.

figure-protocol-2
Figura 2: Lo schema della chirurgia DJB. (A) Anastomosi duodenale-digiunale. (B) Anastomosi digiunale-digiunale. (C) Arto biliopancreatico. (D) Arto digestivo. (E) Arto comune. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-protocol-3
Figura 3: Anatomia della chirurgia DJB. (A) Anastomosi duodenale-digiunale. (B) Anastomosi digiunale-digiunale. (C) Arto biliopancreatico. (D) Arto digestivo. (E) Arto comune. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Valutazione postoperatoria dei parametri metabolici

  1. Misurazione del peso corporeo
    1. Digiunare i topi per 8 ore prima della misurazione. Pesare i topi settimanalmente il lunedì prima e dopo l'intervento chirurgico per 8 settimane.
  2. Misurazione dell'assunzione di cibo
    1. Ospita un topo in ogni gabbia. Misurare la quantità di cibo solido in ogni gabbia prima e dopo 24 ore. La differenza tra i due valori rappresenta l'assunzione giornaliera di cibo.
  3. Misurazione casuale della glicemia
    1. Alle 8:00 del lunedì settimanale di misurazione, raccogliere una goccia di sangue dalla punta della coda del topo e applicarla su una striscia di glucosio inserita nel glucometro.
  4. Test di tolleranza al glucosio orale
    1. Otto settimane dopo l'intervento chirurgico DJB, digiunare i topi per 8 ore prima del test di tolleranza al glucosio orale. Raccogli una goccia di sangue dalla punta della coda del topo e posizionala su una striscia di glucosio inserita nel glucometro. Somministrare una dose orale di D-glucosio al 20% (2 g/kg). Misurare i livelli di glucosio nel sangue a 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150 e 180 minuti dopo il gavage.

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Risultati

Condizioni generali
Il tempo operatorio medio per la procedura DJB è stato di 84,5 ± 2,6 minuti. Quindici topi sono stati sottoposti a chirurgia DJB, nove topi sono sopravvissuti. Come mostrato nella Tabella 1, la maggior parte dei decessi si è verificata durante l'intervento chirurgico o nei 7 giorni successivi. Le cause della morte postoperatoria sono state sanguinamento (n=2) il giorno 1 postoperatorio, perdita anastomotica (n=1) il giorno 4 postoperatorio, ostruzione anastomotica ...

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Discussione

Nel 1953, Varco et al.18 eseguirono il primo bypass digiuno-ileale come inizio della chirurgia bariatrica. Da allora, numerosi interventi di chirurgia bariatrica sono stati eseguiti da chirurghi. Questi interventi chirurgici hanno portato alla perdita di peso e al miglioramento delle complicanze metaboliche 4,19,20. Inoltre, nel 1967, Mason e Ito21...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione del Progetto di pianificazione scientifica e tecnologica della provincia cinese del Guangdong (n. 202002020069).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Divaricatore addominaleFST17000-03Divaricatore Colibrì -3 cm, gamma di divaricatori 1,5 cm / 3 cm di lunghezza
Soluzione di pentobarbital di sodio all'1%Fabbrica di reagenti chimici di Guangzhou  Disciolti 500 mg di polvere di pentobarbital sodico in 50 ml di soluzione salina normale per ottenere una soluzione di pentobarbital sodico all'1%.
Benzilpenicillina sodica per iniezioneNorth China Pharmaceutical Company Ltd.F2062121Penicillina
BuprenorfinaGuangzhou Chemical Reagent Factory/Analgesia
BuprenorfinaGuangzhou Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd/Analgesico
Acido citrico-tampone citrato di sodioLEAGENER00522Soluzione tampone
Cotton fiocHaoZheng Medical60220610Tamponi di cotone
Pasta depilatoriaVeetAAPR-S222Crema depilatoria
Marchio auricolareZEYASUS304Ear-mark
Coperta elettricaZOSENZS-CWDRTTermoforo
Bilancia elettronicaWETTLER TOLEDO20060902-6Misurare il peso
Polvere nutrizionale enteraleAbbott Laboratories/Polvere nutrizionale
Eye unguentoGuangzhou Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd/Proteggi gli occhi
GlucometroRoche6993788001Valutare la glicemia
Graphpad Prism versione 9.4.1GraphPad Softwareversione 9.4.1Software per l'analisi statistica
Dieta ricca di grassi (dieta purificata per roditori ad alto contenuto di grassi [60FDC])Dice11225260kcal% Dieta ad alto contenuto di grassi
Micro PinzeJinzhong Medical18-1140Micro pinze
Micro porta aghiJinzhong MedicalEMT-160-ZPorta aghi
Micro forbiciJinzhong MedicalYBC010Micro forbici
Fotocamera per microscopioLAPSUNE 2000Video
Forbici oftalmicheJinzhong MedicalY00030Forbici
PentobarbitalGuangzhou/Iniezione di
cloruro di sodioNarcosi Guangzhou Otsuka Pharmaceutical Co., LtdB21L0301NaCl 0,9%
StereomicroscopioZEISSStemi 305Stereomicroscopio binoculare
StreptozotocinSigmaS110910-1gSTZ
Linea di suturaLINGQIAO SUTUREZS-LQPMRZ5/ 0Prolene 6/0, Prolene 10/0
Pinze per tessutiJinzhong MedicalH1701Pinze chirurgiche
/ chirurgicheFabbrica di reagenti chimici

Riferimenti

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