Articolo metodologico

Modellazione della chirurgia della cataratta nei topi

DOI:

10.3791/66050

⸱

1 dicembre 2023

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Delaware

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo metodo modella la chirurgia della cataratta in vivo rimuovendo le cellule delle fibre del cristallino da topi adulti e lasciando dietro di sé la sacca capsulare con le cellule epiteliali del cristallino (LEC) attaccate. La risposta alla lesione viene quindi valutata in vari momenti post-operatorio utilizzando criteri molecolari e morfologici.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La chirurgia della cataratta (CS) è un trattamento efficace per la cataratta, una delle principali cause di disabilità visiva in tutto il mondo. Tuttavia, la CS porta all'infiammazione oculare e, a lungo termine, può provocare opacizzazione capsulare posteriore (PCO) e/o lussazione del cristallino guidata dalla crescita eccessiva post-chirurgica delle cellule epiteliali del cristallino (LEC) e dalla loro conversione in miofibroblasti e/o cellule di fibre aberranti. Tuttavia, i meccanismi molecolari attraverso i quali la CS provoca infiammazione e PCO sono ancora oscuri perché la maggior parte dei modelli in vitro non ricapitola la risposta di guarigione delle ferite delle LEC osservate in vivo, mentre i modelli animali tradizionali di chirurgia della cataratta, come i conigli, non consentono la manipolazione genetica dell'espressione genica per testare i meccanismi. Recentemente, il nostro laboratorio e altri hanno utilizzato con successo topi geneticamente modificati per studiare i meccanismi molecolari che guidano l'induzione della segnalazione proinfiammatoria e la transizione da epiteliale LEC a mesenchimale, portando a nuove intuizioni sulla patogenesi della PCO. Qui, riportiamo il protocollo stabilito per la modellazione della chirurgia della cataratta nei topi, che consente una robusta profilazione trascrizionale della risposta delle LEC alla rimozione delle cellule delle fibre del cristallino tramite RNAseq, la valutazione dell'espressione proteica mediante immunofluorescenza semiquantitativa e l'uso di moderni strumenti di genetica murina per testare la funzione di geni che si ipotizza partecipino alla patogenesi di sequele acute come l'infiammazione e la successiva conversione di LEC in miofibroblasti e/o cellule aberranti delle fibre del cristallino.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La lente è un tessuto trasparente altamente organizzato che rifrange la luce per produrre un'immagine chiaramente a fuoco sulla retina 1,2,3. Questo organo specializzato è circondato da una membrana basale ininterrotta (la capsula), che isola il cristallino dalle altre parti dell'occhio. La superficie anteriore interna della capsula ancora un monostrato di cellule epiteliali del cristallino (LEC), che poi si differenziano all'equatore del cristallino in cellule di fibre del cristallino, che comprendono la stragrande maggioranza del cristallino3. La cataratta si verifica quando il cristallino perde la sua trasparenza a causa di fattori come l'invecchiamento, la mutazione genetica, le radiazioni UV, lo stress ossidativo e il trauma oculare4. La cataratta è una delle principali cause di cecità in tutto il mondo, in particolare nei paesi con scarse cure mediche5. Tuttavia, questa condizione è ora prontamente trattata con la rimozione chirurgica delle cellule opache del cristallino mediante facoemulsificazione in cui la capsula centrale del cristallino e l'epitelio del cristallino attaccato vengono rimossi, seguiti dall'uso di una sonda vibrante per rompere la massa cellulare del cristallino in frammenti più piccoli che possono essere aspirati; lasciando dietro di sé una sacca capsulare con attaccate alcune LEC equatoriali1. La vista viene quindi più comunemente ripristinata mediante l'impianto post-chirurgico di una lente intraoculare artificiale (IOL).

Sebbene la chirurgia della cataratta (CS) sia un trattamento altamente efficace e minimamente invasivo per la cataratta, il recupero post-chirurgico di un paziente può essere acutamente ostacolato dallo sviluppo di infiammazione oculare 5,6,8. Questa infiammazione può causare dolore post-chirurgico, edema retinico che porta al distacco della retina, nonché esacerbazione di altre condizioni infiammatorie e fibrotiche come uveite e glaucoma 4,7,8,9. L'infiammazione oculare post-CS (PCS) è generalmente trattata con colliri antinfiammatori che sono afflitti da scarsa compliance del paziente o chirurgia della cataratta senza gocce che può portare a un aumento della prevalenza di miodesopsie 8,10,11. A lungo termine, gli esiti della CS possono essere compromessi dallo sviluppo dell'opacizzazione capsulare posteriore (PCO)12. La PCO si verifica quando le LEC residue rimaste dopo l'intervento chirurgico subiscono una risposta di guarigione della ferita, proliferano e migrano sulla capsula posteriore del cristallino a mesi o anni di PCS contribuendo all'ostruzione visiva secondaria13,14.

Comprendere i meccanismi molecolari con cui la CS provoca tali risposte acute e croniche rappresenta una sfida importante nel campo, poiché gran parte della letteratura che studia la PCO si basa sull'induzione della conversione di LEC in miofibroblasti in coltura attraverso il trattamento con fattore di crescita trasformante attivo beta (TGFβ)12,15. I modelli di sacchi capsulari umani creati da lenti da cadavere coltivate in vitro riflettono meglio la biologia del PCS del cristallino poiché le LEC sono coltivate sulla loro membrana basale nativa ma sono difficili da manipolare meccanicamente, non ricapitolano l'ambiente intraoculare e sono intrinsecamente variabili a causa della variabilità da lente a lente (o da donatore a donatore) 16,17. I modelli in vivo di chirurgia della cataratta di coniglio 1,18 e primate non umano19,20 superano alcuni di questi problemi, ma non sono ancora facili da manipolare per studi meccanicistici. In particolare, uno studio precedente sulla rigenerazione del cristallino nei mammiferi ha rilevato una significativa rigenerazione del cristallino entro quattro settimane dalla rimozione delle cellule delle fibre del cristallino dai topi, lasciando dietro di sé le cellule epiteliali del cristallino e la capsula, mentre non si è verificata alcuna ricrescita del cristallino quando l'intero cristallino è stato rimosso21,22. Successivamente abbiamo semplificato questa procedura e l'abbiamo ottimizzata per lo studio della risposta acuta delle LEC alla rimozione delle cellule delle fibre del cristallino e alla loro successiva conversione in una popolazione mista di cellule con proprietà di miofibroblasti e cellule delle fibre. 

Utilizzando questo modello murino di chirurgia della cataratta, abbiamo dimostrato che le cellule epiteliali del cristallino rimodellano drasticamente il loro trascrittoma entro 6 ore di PCS per produrre numerose citochine proinfiammatorie23, mentre iniziano ad esprimere marcatori fibrotici già 24 ore PCS 12,23, prima dell'inizio della segnalazione canonica del TGFβ. Esperimenti meccanicistici su topi knockout che utilizzano questo modello hanno rivelato che l'espressione cellulare di fibronectina da parte delle LEC è necessaria per una risposta fibrotica sostenuta PCS, probabilmente a causa sia del suo ruolo nell'assemblaggio della ECM fibrotica che della segnalazione cellulare12. Altri studi hanno dimostrato che l'αVβ8-integrina è necessaria per la transizione delle LEC ai miofibroblasti a causa della sua funzione nell'attivazione del TGFβ, e il potenziale di questo approccio per identificare i lead terapeutici anti-PCO è stato confermato come antagonista dell'αVβ8-integrina che ha anche bloccato LEC EMT15.

Qui, forniamo un protocollo dettagliato che descrive come rimuovere le cellule delle fibre del cristallino da topi viventi (Figura 1e Figura 4) lasciando dietro di sé la capsula del cristallino e le LEC per modellare la risposta LEC alla chirurgia della cataratta.

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Protocollo

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Il seguente protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Delaware con il protocollo #1039-2021-1. In conformità con l'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva24, tutti gli interventi chirurgici di sopravvivenza oculare possono essere eseguiti in un solo occhio. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli sui reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo. Approcci alternativi per l'estrazione delle fibre del cristallino e la sutura sono mostrati nella Figura 2 e nella Figura 3.

1. Animali

  1. Utilizzare qualsiasi ceppo di topo da laboratorio wild-type o geneticamente modificato che abbia gli occhi con lenti intatte per questa procedura.
    1. Utilizzare i topi C57BL/6 come punto di partenza, poiché le loro risposte sono altamente riproducibili sia a livello morfologico che molecolare 25,26.
      NOTA: È possibile utilizzare C57BL/6 o qualsiasi ceppo di topo. Nel protocollo video, il mouse FVB viene utilizzato per una migliore dimostrazione visiva.
    2. Eseguire studi sulla risposta di mutanti su altri ceppi di topi con controlli strain-matched.
      NOTA: Con la pratica, questa procedura può essere eseguita su topi le cui lenti hanno la cataratta purché la capsula del cristallino sia intatta e il cristallino non abbia subito una liquefazione significativa. Vedi lo studio su topi con delezione condizionale della lente del fattore di trascrizione Sip127.
  2. Eseguire questo intervento chirurgico su topi di entrambi i sessi di età compresa tra 8 settimane e 24 mesi25,26.
    1. Esegui questo intervento chirurgico in topi ancora più giovani (dopo l'apertura delle palpebre) con la pratica, anche se sarà più difficile poiché questi occhi saranno significativamente più piccoli.
    2. Prestare particolare attenzione agli interventi chirurgici sui topi anziani a causa della loro minore tolleranza all'anestesia25,26.
      NOTA: Le differenze di sesso nelle risposte chirurgiche sono più prevalenti nei topi anziani26.

2. Preparazione delle soluzioni e degli strumenti chirurgici

  1. Procurati agenti anestetizzanti e analgesici, gocce di dilatazione, bisturi sterile monouso, pinze Dumont #5, pinze per sutura 2-110, aghi (punta di erogazione piegata a 45° 26 G 1/2 e 27 G 45° 1"), siringhe e soluzione salina bilanciata (BSS).
  2. Sterilizzare gli strumenti chirurgici in autoclave.

3. Prima dell'anestesia

  1. Prima dell'anestesia, somministrare al topo una goccia di atropina all'1% e fenilefrina al 2,5% per dilatare la pupilla (vedi Figura 1A) dell'occhio sottoposto a intervento chirurgico. Applicare un unguento oftalmico sull'occhio non operato per evitare che la superficie si secchi.
    NOTA: La dichiarazione ARVO sull'uso degli animali nella ricerca oculistica24 consente a un solo occhio di sottoporsi a un intervento chirurgico di sopravvivenza, lasciando intatto l'altro occhio in modo che l'animale mantenga la vista. Pertanto, gli interventi chirurgici di sopravvivenza sono sempre unilaterali; Tuttavia, l'occhio controlaterale non operato può essere operato appena prima del sacrificio per creare controlli "tempo zero" abbinati agli animali.
  2. Assicurati che il collirio non scorra lungo il viso del topo ed entri nel naso, poiché ciò può ostruire la sua respirazione.
  3. Preparare una siringa con BSS sterile utilizzando un ago sterile da 26 G 1/2. Montare la siringa con una punta di erogazione smussata sterile da 27 G piegata a 45° di 1 pollice (indicata di seguito come punta di erogazione).

4. Anestesia

  1. Dopo il collirio, anestetizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di soluzione di xilazina/ketamina/acepromazina (35 mg/kg, 80 mg/kg e 0,5 mg/kg) (Figura 1B).
    NOTA: L'anestesia inalatoria potrebbe non essere possibile a meno che non sia possibile utilizzare un cono nasale specializzato per consentire l'accesso all'occhio necessario per l'intervento chirurgico.

5. Esecuzione dell'incisione

  1. Una volta che il topo è completamente sotto anestesia, come misurato dalla mancanza di riflesso di pizzicamento delle dita, e la sua pupilla si è dilatata completamente (2 mm) (Figura 4A), il topo è pronto per l'intervento chirurgico.
    1. Spostare il topo anestetizzato sul tavolino di un microscopio ottico da dissezione composto. Utilizzare un cuscinetto riscaldante per assicurarsi che il mouse abbia un'adeguata regolazione termica e utilizzare teli sterili.
    2. Osserva l'occhio con un ingrandimento 10x-20x utilizzando un microscopio da dissezione (vedi Tabella dei materiali per le specifiche).
  2. Praticare un'incisione di 1-1,5 mm al centro della cornea utilizzando un bisturi chirurgico sterile. Assicurarsi che l'incisione si estenda attraverso la cornea e incida la capsula anteriore del cristallino (Figura 1C e Figura 4B).

6. Separare le fibre della lente dal sacchetto capsulare

  1. Afferrare la siringa con una punta di erogazione contenente BSS sterile ed espellere delicatamente 1 goccia di BSS sopra la cornea per bagnare la superficie per ulteriori manipolazioni.
  2. Separare la massa della fibra della lente dalla capsula della lente.
    1. Inserire la punta di erogazione attraverso l'incisione corneale centrale nell'incisione della capsula del cristallino, quindi muovere delicatamente l'ago con un movimento circolare mentre rilascia lentamente BSS per separare le connessioni apico-apicali tra l'epitelio del cristallino e le cellule delle fibre (idrodissezione), espellendo infine la massa delle fibre del cristallino (Figura 1D).
    2. Nella maggior parte dei casi, la massa fibrosa alla fine aderirà alla punta di erogazione durante questa procedura (Figura 2A). In tal caso, rimuovere delicatamente la punta di erogazione dall'occhio interno; e pulire con un asciugamano sterile per rimuovere questo fazzoletto. Ripetere l'operazione fino a rimuovere tutte le celle delle fibre del cristallino.
    3. In alternativa, utilizzare una micro pinza (numero 5 Dumont) per estrarre il nucleo del cristallino (Figura 2B). Se si utilizza questo metodo, fare attenzione che l'incisione corneale originale superi il diametro del nucleo per garantire una facile rimozione.
  3. Sciacquare la capsula della lente con BSS sterile per rimuovere eventuali fibre rimanenti.
  4. Verificare che la capsula del cristallino sia rimasta all'interno dell'occhio (Figura 1E e Figura 4C) osservando il suo aspetto traslucido/vetroso attraverso il microscopio.

7. Gonfiare la camera anteriore e suturare l'incisione corneale

  1. Gonfiare la camera anteriore alla sua profondità normale iniettando BSS attraverso l'incisione nella camera anteriore.
    1. Aggiungere inibitori o attivatori delle vie di segnalazione di interesse per la BSS per testare i loro ruoli nella risposta alla lesione del cristallino12,15.
      NOTA: Gli animali possono anche essere trattati per via sistemica con inibitori della via, che possono essere necessari a seconda della farmacocinetica del turnover del farmaco poiché l'equilibrio dell'umore acqueo viene ristabilito dopo l'intervento chirurgico15.
  2. Sutura l'incisione corneale con nodi quadrati utilizzando filo di nylon 10-0 con un ago affusolato e curvo da 5,3 mm 1/2c (Figura 1F e Figura 4D-F).
    1. Posizionare un punto nodo quadrato nella parte centrale dell'incisione o due punti nodo quadrato sia nella metà superiore che in quella inferiore dell'incisione originale (vedi Figura 3). Il numero di punti dipende dalla lunghezza dell'incisione corneale.
    2. Non forare entrambi i lembi corneali contemporaneamente. Invece, tieni un lembo corneale usando una pinza nella mano non dominante e spingi l'ago/nylon attraverso. Una volta che un lato della cornea è stato perforato, spingere l'ago/nylon attraverso il lembo corneale successivo. Chiudere i lembi corneali utilizzando punti di punto a nodo quadrato.

8. Cure post-chirurgiche

NOTA: Un unguento antibiotico topico viene applicato sull'occhio e vengono somministrati agenti analgesici. I topi di solito non mostrano segni di angoscia dopo l'intervento chirurgico iniziale. Se necessario, potrebbe essere utilizzata la versione a lento rilascio della buprenorfina.

  1. Immediatamente dopo questo intervento chirurgico, eseguire i seguenti passaggi secondari.
    1. Applicare una goccia di unguento oftalmico all'eritromicina allo 0,5% direttamente sopra la sutura. Assicurati che l'intera incisione sia ricoperta di unguento.
    2. Somministrare un'iniezione intraperitoneale di buprenorfina (0,1 mg/kg).
  2. Consentire al mouse di riprendersi dall'anestesia in una gabbia posizionata su un termoforo per ottimizzare il supporto termico.
    NOTA: Monitorare l'animale per segni di traumi, angoscia o disagio. Alcuni segni includono infezione/graffio nel sito chirurgico, sutura spostata, perdita di pelo, ecc.

9. Monitoraggio del recupero degli animali

  1. Monitorare il recupero dell'animale dopo l'intervento chirurgico fino al risveglio dall'anestesia.
  2. Controlla i topi ogni giorno per i primi 3 giorni dopo l'intervento chirurgico.
    NOTA: Di solito non è necessario rimuovere i punti perché i topi vengono sacrificati prima della completa guarigione (2 settimane PCS) o i punti cadono spontaneamente.
  3. Somministrare buprenorfina per via orale, secondo necessità per la gestione del dolore dopo 4-8 ore dall'intervento chirurgico, alla dose di 0,5 mg/kg (in gelatina) o alla dose di 0,1 mg/kg per coloro che non mangiano. In alternativa, somministrare buprenorfina a rilascio prolungato appena prima dell'intervento chirurgico.
    NOTA: Quando possibile, dovrebbero essere utilizzati analgesici preventivi, ma ciò potrebbe richiedere modifiche al protocollo analgesico che richiedono la revisione e l'approvazione da parte del comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.

10. Eutanasia

  1. Sopprimere il topo al momento desiderato dopo l'intervento chirurgico
    1. Rimosso l'occhio operato utilizzando l'occhio non operato come tessuto di controllo; o anestetizzare nuovamente l'animale, eseguire un intervento chirurgico di rimozione delle cellule delle fibre del cristallino sull'occhio controlaterale precedentemente non operato, quindi sacrificare immediatamente l'animale (senza permettergli di svegliarsi dall'anestesia) per fornire un controllo operato a tempo zero.
    2. Garantire una rapida dissezione e prelievo dei tessuti.
      NOTA: Le LEC subiscono cambiamenti trascrittomici entro pochi minuti dall'intervento chirurgico, quindi è necessario un rapido prelievo di tessuto e la fissazione/congelamento quando si studiano le risposte precoci delle LEC all'intervento chirurgico.

11. Esecuzione di ulteriori analisi sui tessuti del cristallino prelevati

  1. Utilizzare il tessuto ottenuto per l'immunocolorazione, il sequenziamento dell'RNA, la coltura cellulare o l'analisi occidentale 12,15,23,25,26,28. Anche la citometria a flusso è teoricamente possibile12, sebbene il piccolo numero di LEC nel cristallino del topo (~40.000)29 e la presenza di detriti cellulari associati alla capsula dopo l'intervento chirurgico la rendano impegnativa.
  2. Immunocolorazione
    1. Sopprimere il topo in una camera per inalazione di CO2 (4 L/min) da una bombola di gas. Aumentare la portata a 8-10 L/min una volta che il topo è incosciente e continuare questa esposizione fino alla completa cessazione della respirazione più 1 minuto.
      NOTA: Il topo può essere soppresso utilizzando un metodo appropriato secondo le linee guida AVMA per l'eutanasia degli animali o secondo le linee guida o le politiche approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.
    2. Garantire un sacrificio adeguato impiegando un metodo secondario di eutanasia, ad esempio la lussazione cervicale.
      NOTA: Il laboratorio Duncan ha studiato punti temporali che vanno da minuti a mesi PCS 12,15,23.
    3. Dopo che il topo è stato sacrificato umanamente, isolare l'occhio operato per l'analisi.
      1. Tenere le micro pinze nella mano non dominante per afferrare l'occhio azionato mentre si tengono le micro forbici nella mano dominante.
      2. Agganciare delicatamente il nervo ottico e i muscoli che ancorano l'occhio.
        NOTA: Prestare particolare attenzione a maneggiare gli occhi che sono stati operati di recente rispetto a quelli che hanno avuto più tempo per guarire il PCS. Gli occhi operati di recente sono strutturalmente più fragili.
    4. Incorporare l'occhio sezionato in terreni OCT per la successiva criosezione, immunocolorazione e microscopia confocale semiquantitativa28,30.
  3. Isolamento della sacca capsulare con le cellule associate per il sequenziamento dell'RNA, la coltura cellulare o l'analisi del western blot
    1. Sopprimere il topo in una camera per inalazione di CO2 (4 L/min) da una bombola di gas. Aumentare la portata a 8-10 L/min una volta che il topo è incosciente e continuare questa esposizione fino alla completa cessazione della respirazione più 1 minuto.
    2. Garantire un sacrificio adeguato impiegando un metodo secondario di eutanasia, ad esempio la lussazione cervicale.
    3. Se è necessario un PCS precoce (entro 1-2 giorni), rimuovere i punti di sutura prima dell'estrazione del tessuto o praticare un'altra incisione nella cornea attraverso la quale estrarre la capsula del cristallino.
      NOTA: Nei punti successivi PCS, i punti saranno probabilmente caduti, quindi sarà necessaria una nuova incisione.
  4. Individuare la capsula della lente traslucida.
    1. Inserire delicatamente la micro pinza attraverso l'apertura corneale, afferrare la capsula e rimuoverla dalla camera anteriore.
    2. Posizionare la capsula in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml o in un piatto di coltura per ulteriori analisi.

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Risultati

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Sulla base dei risultati di questo metodo chirurgico, il Duncan Lab ha utilizzato questo modello murino di chirurgia della cataratta per costruire un andamento del tempo di risposta alla lesione delle cellule epiteliali del cristallino dopo l'intervento chirurgico (Figura 5). Entro 6 ore dall'intervento chirurgico, il 5% del trascrittoma epiteliale del cristallino è espresso in modo differenziale (Figura 6A), compresa la sovraregolazione di numerosi geni a rispo...

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Discussione

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Questa tecnica chirurgica richiede una manipolazione avanzata del mouse e abilità microchirurgiche che richiedono pratica per essere sviluppate. Il più difficile da padroneggiare è il posizionamento di suture sottili nella cornea per chiudere la ferita. Supponiamo che lo sperimentatore sia un principiante assoluto della sutura. In tal caso, si consiglia di esercitarsi prima con spago e stoffa, quindi passare alla pratica con suture di grande diametro su piccoli frutti per padroneggiare i...

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Dichiarazioni

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Il laboratorio Duncan ha ricevuto un sostegno finanziario da Pliantx per testare terapie anti-PCO utilizzando questo modello chirurgico.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Eye Institute (EY015279 e EY028597) e dal Delaware INBRE (P20 GM103446).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,5% eritiromicina unguento oftalmico USPBaush Lomb24208-910-55
1% atropina solfato soluzione oftalmicaAmneal60219-1748-2
1% Tropicamide soluzione oftalmica USPAkorn17478-102-12
10-0 sutura in nylonEthicon7707G
2,5% fenilefrina cloridrato soluzione oftalmica USPAkorn17478-200-12
26 G 1/2 Aghi - drittiBD PrecisionGlide5111
27 G 45° punta di erogazione piegata 1"Harfington
Soluzione salina bilanciataPhoenix57319-555-06
Bupranorfina (0,1 mg/kg)APP Pharmaceticals401730D
Soluzione di clorexidina
Porta aghi 2-110Duckworth & Kent2-110-3E
Noyes forbici, drittoFine Science Tools12060-02
SMZ800 Microscopio modello NikonBisturi
No.11Piuma2975#11
Pinzetta #5 DumontElectron Microscopy Sciences72700-D
Xilazina / ketamina / acepromazina (35 mg / kg, 80 mg / kg, 0,5 mg / / kg) soluzioneAPP Pharmaceticals401730D
monouso sterile Nikon

Riferimenti

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