Modellazione della chirurgia della cataratta nei topi

Sommario

Questo metodo modella la chirurgia della cataratta in vivo rimuovendo le cellule delle fibre del cristallino da topi adulti e lasciando dietro di sé la sacca capsulare con le cellule epiteliali del cristallino (LEC) attaccate. La risposta alla lesione viene quindi valutata in vari momenti post-operatorio utilizzando criteri molecolari e morfologici.

Abstract

La chirurgia della cataratta (CS) è un trattamento efficace per la cataratta, una delle principali cause di disabilità visiva in tutto il mondo. Tuttavia, la CS porta all'infiammazione oculare e, a lungo termine, può provocare opacizzazione capsulare posteriore (PCO) e/o lussazione del cristallino guidata dalla crescita eccessiva post-chirurgica delle cellule epiteliali del cristallino (LEC) e dalla loro conversione in miofibroblasti e/o cellule di fibre aberranti. Tuttavia, i meccanismi molecolari attraverso i quali la CS provoca infiammazione e PCO sono ancora oscuri perché la maggior parte dei modelli in vitro non ricapitola la risposta di guarigione delle ferite delle LEC osservate in vivo, mentre i modelli animali tradizionali di chirurgia della cataratta, come i conigli, non consentono la manipolazione genetica dell'espressione genica per testare i meccanismi. Recentemente, il nostro laboratorio e altri hanno utilizzato con successo topi geneticamente modificati per studiare i meccanismi molecolari che guidano l'induzione della segnalazione proinfiammatoria e la transizione da epiteliale LEC a mesenchimale, portando a nuove intuizioni sulla patogenesi della PCO. Qui, riportiamo il protocollo stabilito per la modellazione della chirurgia della cataratta nei topi, che consente una robusta profilazione trascrizionale della risposta delle LEC alla rimozione delle cellule delle fibre del cristallino tramite RNAseq, la valutazione dell'espressione proteica mediante immunofluorescenza semiquantitativa e l'uso di moderni strumenti di genetica murina per testare la funzione di geni che si ipotizza partecipino alla patogenesi di sequele acute come l'infiammazione e la successiva conversione di LEC in miofibroblasti e/o cellule aberranti delle fibre del cristallino.

Introduzione

La lente è un tessuto trasparente altamente organizzato che rifrange la luce per produrre un'immagine chiaramente a fuoco sulla retina ^1,2,3. Questo organo specializzato è circondato da una membrana basale ininterrotta (la capsula), che isola il cristallino dalle altre parti dell'occhio. La superficie anteriore interna della capsula ancora un monostrato di cellule epiteliali del cristallino (LEC), che poi si differenziano all'equatore del cristallino in cellule di fibre del cristallino, che comprendono la stragrande maggioranza del cristallin....

Protocollo

Il seguente protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Delaware con il protocollo #1039-2021-1. In conformità con l'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva²⁴, tutti gli interventi chirurgici di sopravvivenza oculare possono essere eseguiti in un solo occhio. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli sui reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo. Approcci alternativi per l'estrazione delle fibre del cristallino e la sutura sono mostrati....

Risultati

Sulla base dei risultati di questo metodo chirurgico, il Duncan Lab ha utilizzato questo modello murino di chirurgia della cataratta per costruire un andamento del tempo di risposta alla lesione delle cellule epiteliali del cristallino dopo l'intervento chirurgico (Figura 5). Entro 6 ore dall'intervento chirurgico, il 5% del trascrittoma epiteliale del cristallino è espresso in modo differenziale (Figura 6A), compresa la sovraregolazione di numerosi geni a rispo.......

Discussione

Questa tecnica chirurgica richiede una manipolazione avanzata del mouse e abilità microchirurgiche che richiedono pratica per essere sviluppate. Il più difficile da padroneggiare è il posizionamento di suture sottili nella cornea per chiudere la ferita. Supponiamo che lo sperimentatore sia un principiante assoluto della sutura. In tal caso, si consiglia di esercitarsi prima con spago e stoffa, quindi passare alla pratica con suture di grande diametro su piccoli frutti per padroneggiare i.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,5% eritiromicina unguento oftalmico USP	Baush Lomb	24208-910-55
1% atropina solfato soluzione oftalmica	Amneal	60219-1748-2
1% Tropicamide soluzione oftalmica USP	Akorn	17478-102-12
10-0 sutura in nylon	Ethicon	7707G
2,5% fenilefrina cloridrato soluzione oftalmica USP	Akorn	17478-200-12
26 G 1/2 Aghi - dritti	BD PrecisionGlide	5111
27 G 45° punta di erogazione piegata 1"	Harfington
Soluzione salina bilanciata	Phoenix	57319-555-06
Bupranorfina (0,1 mg/kg)	APP Pharmaceticals	401730D
Soluzione di clorexidina
Porta aghi 2-110	Duckworth & Kent	2-110-3E
Noyes forbici, dritto	Fine Science Tools	12060-02
SMZ800 Microscopio modello Nikon	Bisturi
No.11	Piuma	2975#11
Pinzetta #5 Dumont	Electron Microscopy Sciences	72700-D
Xilazina / ketamina / acepromazina (35 mg / kg, 80 mg / kg, 0,5 mg / / kg) soluzione	APP Pharmaceticals	401730D

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