Articolo metodologico

Rilevamento di polimorfismi a singolo nucleotide multigenico nel carcinoma gastrico basato su una piattaforma di sequenziamento a semiconduttore ionico

DOI:

10.3791/66058

⸱

10 maggio 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Nanfang Hospital, Southern Medical University, 2Research and Development Department, Guangzhou Darui Biotechnology Co., Ltd, 3Key Laboratory of Antibody Engineering of Guangdong Higher Education Institutes, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 4Provincial Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, Southern Medical University

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Sommario

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Questo protocollo propone procedure di laboratorio olistiche necessarie per rilevare polimorfismi a singolo nucleotide in campioni di cancro gastrico basate su una piattaforma di sequenziamento a semiconduttore ioneico. Vengono inoltre descritte in dettaglio le sequenze target, gli adattatori di legatura, l'amplificazione e la purificazione della libreria e i criteri di controllo della qualità.

Abstract

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Il cancro gastrico è un tumore eterogeneo comune. La maggior parte dei pazienti ha un carcinoma gastrico avanzato al momento della diagnosi e spesso necessita di chemioterapia. Sebbene il 5-fluorouracile (5-FU) sia ampiamente utilizzato per il trattamento, la sua sensibilità terapeutica e la tolleranza ai farmaci devono ancora essere determinate, il che sottolinea l'importanza di una somministrazione individualizzata. La farmacogenetica può guidare l'implementazione clinica di un trattamento individualizzato. I polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), come marcatore genetico, contribuiscono alla selezione di regimi e dosaggi chemioterapici appropriati. Alcuni SNP sono associati al metabolismo dei folati, l'obiettivo terapeutico del 5-FU. La metilenetetraidrofolato reduttasi (MTHFR) rs1801131 e rs1801133, la diidrofolato reduttasi (DHFR) rs1650697 e rs442767, la metionina sintasi (MTR) rs1805087, la gamma-glutamil idrolasi (GGH) rs11545078 e la famiglia dei trasportatori di soluti 19 membro 1 (SLC19A1) rs1051298 sono stati studiati in diversi tipi di cancro e farmaci antitumorali antifolati, che hanno un potenziale significato previsionale e guida per applicazione del 5-FU. La tecnologia di sequenziamento dei semiconduttori di nuova generazione Ion Torrent è in grado di rilevare rapidamente gli SNP correlati al cancro gastrico. Ogni volta che una base viene estesa in una catena di DNA, verrà rilasciato un H+ , causando cambiamenti locali del pH. Il sensore ionico rileva le variazioni di pH e converte i segnali chimici in segnali digitali, ottenendo il sequenziamento per sintesi. Questa tecnica ha un basso fabbisogno di campioni, un funzionamento semplice, un basso costo e un'elevata velocità di sequenziamento, il che è vantaggioso per guidare la chemioterapia individualizzata da parte degli SNP.

Introduzione

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Il cancro gastrico è un pesante fardello nel campo della salute pubblica globale. Secondo il Global Cancer Statistics 2020, pubblicato dall'Agenzia internazionale per la ricerca sul cancro (IARC), il cancro gastrico è il quinto tumore più diagnosticato e la quarta causa di morte correlata al cancro. In tutto il mondo, l'incidenza del tasso standardizzato per età in Asia orientale è la più alta sia nei maschi che nelle femmine1. L'insorgenza del cancro gastrico è insidiosa, il che significa che i pazienti spesso non hanno sintomi evidenti e specifici nella fase iniziale. Tra tutti i pazienti affetti da cancro gastrico, nei paesi senza screening di routine, l'80%-90% dei pazienti viene diagnosticato in uno stadio avanzato quando il tumore non può essere operato o recidiva entro 5 anni dall'operazione2.

Per il carcinoma gastrico avanzato o metastatico, la chemioterapia è il trattamento principale, che può migliorare il tasso di sopravvivenza e la qualità della vita dei pazienti. Per la terapia iniziale dei pazienti con carcinoma gastrico metastatico, un regime di platino-fluoropirimidina è la scelta principale per un regime chemioterapicodi prima linea 3. La fluoropirimidina comprende principalmente il 5-fluorouracile (5-FU) e i derivati orali della fluoropirimidina, come la capecitabina e il tegafur. L'obiettivo principale del 5-FU sono gli enzimi correlati al metabolismo dei folati, che inibiscono la sintesi del DNA e rallentano la crescita del tessuto tumorale. Le reazioni avverse ai farmaci ne limitano l'utilità, con diarrea, mucosite, mielosoppressione e sindrome mano-piede tra gli effetti collaterali più frequenti. È stato riportato che la risposta terapeutica e le reazioni avverse ai farmaci sono strettamente correlate a fattori nella via metabolica dei folati. In particolare, la mutazione omozigote di rs1801131 è stata identificata come indicatore della sindrome mano-piede (p = 4,1 x 10-6, OR =9,99, IC 95%: 3,84-27,8)4. Sebbene le fluoropirimidine siano ampiamente utilizzate nella chemioterapia antitumorale, la loro chemioresistenza è un'emergenza comune, causando il fallimento terapeutico nel trattamento del cancro gastrico. Ad esempio, il tasso di risposta globale è solo del 10%-15% tra i pazienti con carcinoma colorettale avanzato trattati con solo 5-FU5. Inoltre, le fluoropirimidine hanno una tossicità che non può essere ignorata. Le reazioni di tossicità indotte dal 5-FU includono principalmente diarrea, sindrome mano-piede, stomatite, neutropenia, trombocitopenia, neurotossicità e persino morte6. Una grave tossicità correlata al trattamento si verifica nel 10%-30% dei pazienti trattati con fluoropirimidine e una tossicità fatale si verifica nello 0,5%-1% di questi pazienti7.

Uno studio sulla qualità della vita di pazienti con carcinoma gastrico avanzato ha rilevato che il tasso di risposta era inferiore al 50% per coloro che hanno ricevuto la chemioterapia a base di 5-FU8. Pertanto, la comprensione dei fattori correlati alla sensibilità della chemioterapia a base di 5-FU è particolarmente importante per un trattamento preciso al fine di massimizzare il tasso di risposta e l'efficacia, riducendo al minimo la tossicità. Considerando che il 5-FU è strettamente correlato al metabolismo dei folati, le varianti genetiche degli enzimi nella via metabolica dei folati possono essere uno dei fattori. Circa il 90% della variazione della sequenza umana è attribuita a mutazioni di singole basi nel DNA, note come polimorfismi a singolo nucleotide (SNP)9. Quando gli SNP modificano le proprietà enzimatiche del metabolismo dei folati, possono portare a differenze individuali in termini di efficacia, tossicità e chemioresistenza al fluorouracile nei pazienti con carcinoma gastrico.

La metilenetetraidrofolato reduttasi (MTHFR) viene utilizzata principalmente per convertire il 5,10-metilenetetraidrofolato (5,10-MTHF) in 5-metiltetraidrofolato. Il 5-FdUMP, un metabolita del 5-FU, forma ternario inattivo con 5,10-MTHF e timidilato sintasi (TS), inibendo l'attività del TS e portando al deficit di dTMP10. L'accumulo di 5,10-MTHF può aumentare l'effetto di inibizione del 5-FU sulla TS, che è correlato con l'attività di MTHFR. MTHFR rs1801131 e rs1801133 sono i polimorfismi più comuni, che sono correlati a una minore attività enzimatica (una diminuzione del 75% per rs1801133 e del 30% per rs181131) e all'accumulo di 5,10-MTHF11.

La diidrofolato reduttasi (DHFR) è l'enzima chiave nel metabolismo dei folati e nella sintesi del DNA. Il DHFR riduce il diidrofolato, utilizzando il NADPH, a tetraidrofolato (THF) che viene utilizzato per trasportare un'unità di carbonio. Gli SNP di DHFR possono influenzare la sua espressione, modificare l'attività e l'abbondanza di THF e influenzare ulteriormente il metabolismo dei folati e la sensibilità del 5-FU. La mutazione puntiforme di DHFR rs1650697 si verifica nel principale promotore del gene DHFR , che aumenta l'espressione di DHFR12. Uno studio ha rilevato che rs442767 è associato all'efficacia e alla tossicità dei farmaci antitumorali antifolati, come il pemetrexed e il metotrexato. Per quanto riguarda l'SNP rs442767, un genotipo GT indica l'ereditarietà di un allele G e di un allele T nello stesso locus sui cromosomi omologhi di ciascun genitore. Allo stesso modo, i genotipi GG e TT denotano l'ereditarietà di due alleli G o di due alleli T, rispettivamente. Rispetto al genotipo GT+TT, il GG è correlato alla diminuzione della sopravvivenza libera da eventi e all'aumento del rischio13. Ciò suggerisce che rs442767 può portare a una certa influenza potenziale sul 5-FU.

La metionina sintasi (MTR) catalizza la rimetilazione dell'omocisteina in metionina, che svolge un ruolo importante nel metabolismo dei folati. MTR rs1805087 è il polimorfismo più comune del gene MTR . MTR rs1805087 sostituisce la glicina con l'acido aspartico nel sito potenzialmente funzionale della proteina, il che può ridurre l'attività di MTR. I soggetti con l'allele G avevano un aumento del livello plasmatico di folato e una diminuzione del livello plasmatico di omocisteina14. Al contrario, uno studio ha dimostrato che rs1805087 non ha alcuna associazione statisticamente significativa con l'efficacia del 5-FU. Ma questo studio si è concentrato sul cancro del colon-retto e la dimensione del campione era piccola. La relazione tra rs1805087 e l'efficacia del 5-FU nei pazienti con carcinoma gastrico rimane da esplorare15.

La gamma-glutamil idrolasi (GGH) è un enzima lisosomiale che regola le concentrazioni intracellulari di folati. L'acido pteroilglutammico è il sinonimo di acido folico che è costituito da pterina, acido p-amminometilbenzoico e acido glutammico. Ci sono due forme di acido folico negli organismi, il folato monoglutammato e il folato poliglutammato. Il THF-poliglutammato viene convertito enzimaticamente in folato monoglutammico dal GGH, rilasciando successivamente mono-glutammato (mono-Glu) o di-glutammato (di-Glu)16. Uno studio sull'espressione di GGH in pazienti con carcinoma gastrico localmente avanzato, ha dimostrato che un'elevata espressione di GGH potrebbe ridurre 5,10-MTHF e TS, il che significa che è necessario solo un piccolo dosaggio di 5-FU per ottenere l'effetto inibitorio di TS in questi pazienti17. Il GG è un biomarcatore prognostico nei pazienti con carcinoma gastrico localmente avanzato trattati con chemioterapia adiuvante postoperatoria con S-1, un profarmaco del 5-FU, e svolge un ruolo importante nel mantenimento dell'omeostasi intracellulare dell'acido folico18. GGH rs11545078 è una variante missenso e altera Thr-127 in Ile-127. Uno studio incentrato sulla specificità del substrato di GGH suggerisce che rs11545078, rispetto al wild-type, si traduce in una maggiore Km e in una minore efficienza catalitica per il metotrexato e la struttura è simile all'acido folico19. Insieme, esplorare la relazione tra rs11545078 e gli esiti clinici del 5-FU è una strategia promettente per comprendere la resistenza ai farmaci.

Il membro 1 (SLC19A1 della famiglia di trasportatori di soluti 19, chiamato anche trasportatore di folati ridotti, è una tipica proteina transmembrana facilitante che importa folati ridotti che le cellule di mammifero non sono in grado di sintetizzare de novo, che è riconosciuto per stimare la risposta del tumore al 5-FU20. Tuttavia, sono stati condotti solo pochi studi sull'associazione tra 5-FU e SLC19A1 polimorfismo21. Nei pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule trattati con pemetrexed, che è un analogo del folato, il gene rs1051298 sul gene SLC19A1 ha contribuito ad aumentare il rischio di tutte le reazioni avverse ai farmaci e a diminuire la sopravvivenza globale22,23. SLC19A1 rs1051298, una variante della regione 3' non tradotta sul metabolismo dei folati, può aiutare a spiegare alcune delle differenze individuali sulla terapia con 5-FU. Qui l'obiettivo è valutare l'associazione tra rs1051298 e resistenza al 5-FU tra i pazienti con carcinoma gastrico.

Per la rilevazione qualitativa dei geni in vitro viene utilizzato un kit, basato sul sequenziamento dei semiconduttori (Figura 1), in grado di rilevare 7 SNP selezionati in 5 geni, le mutazioni rs1801131 e rs1801133 del gene MTHFR , le mutazioni rs1650697 e rs442767 del gene DHFR , la mutazione rs1805087 del gene MTR , la mutazione rs11545078 del gene GGH e rs1051298 di SLC19A1 gene in campioni di tessuto tumorale di pazienti con carcinoma gastrico. In primo luogo, è stato estratto l'acido nucleico del campione e il frammento target è stato specificamente amplificato mediante PCR. È stato aggiunto un adattatore di sequenziamento universale ad entrambe le estremità del frammento di DNA per costruire una libreria che può essere utilizzata per il sequenziamento. Quindi è stata eseguita l'amplificazione della libreria di sequenziamento mediante PCR per formare un modello di sequenziamento. Il modello positivo è stato arricchito per soddisfare i requisiti di sequenziamento. Utilizzando il sistema di sequenziamento dei semiconduttori, fissando il filamento di DNA nel minuscolo foro del chip semiconduttore. La DNA polimerasi prende il DNA a filamento singolo come stampo e sintetizza il filamento di DNA complementare secondo il principio dell'appaiamento di basi complementari. Ogni volta che una base viene estesa in una catena di DNA, verrà rilasciato un protone, causando cambiamenti locali del pH. Un sensore ionico rileva le variazioni di pH e converte i segnali chimici in segnali digitali, in modo che le basi possano essere interpretate in tempo reale e infine sia possibile ottenere la sequenza di basi di ciascun segmento di DNA. L'analisi bioinformatica è stata utilizzata per abbinare queste sequenze alla mappa di riferimento del genoma umano. Quando i geni correlati al cancro gastrico mutano, le loro corrispondenti sequenze di DNA base cambieranno, in modo da ottenere le informazioni sulla mutazione dei geni correlati.

Il risultato può mostrare lo stato di mutazione genetica e fornire un riferimento per i medici per selezionare tipi e dosaggi appropriati di farmaci chemioterapici e prevedere la resistenza ai farmaci per i pazienti con cancro gastrico. Tuttavia, i risultati del test sono solo di riferimento clinico e non sono raccomandati come unica base per il trattamento individualizzato dei pazienti. I medici devono formulare un giudizio completo basato sulle condizioni del paziente, sulle indicazioni dei farmaci, sulle reazioni al trattamento e su altri indicatori dei test di laboratorio.

Protocollo

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Tutti i protocolli e i campioni di tessuto del cancro gastrico (fase 1), ottenuti dall'endoscopia o dalla chirurgia del tratto gastrointestinale superiore, utilizzati in questo studio sono stati esaminati e approvati dal comitato etico medico il 24 luglio 2023 (NFEC-2023-298). Inoltre, questo protocollo è progettato esclusivamente per illustrare la rilevazione multigenica nel carcinoma gastrico senza impegnarsi in confronti di coorte, quindi non impone criteri specifici per includere o escludere i pazienti. I pazienti/partecipanti hanno fornito il loro consenso informato scritto a partecipare a questo studio.

1. Preparazione di blocchi incorporati di cancro gastrico

  1. Configura il sistema di inclusione dei tessuti, composto da un serbatoio di paraffina e un erogatore, insieme a piastre calde e fredde, seguendo le linee guida operative prescritte.
  2. Estrarre il tessuto preparato per l'inclusione dall'essiccatore e depositarlo nella fessura di stoccaggio del centro di inclusione.
  3. Selezionare gli stampi di inclusione adatti in base alle dimensioni del tessuto, versare una quantità sufficiente di paraffina fusa a coprire il tessuto, quindi posizionare lo stampo sulla piastra calda.
  4. Recuperare il tessuto dalle cassette e posizionare la mucosa gastrica perpendicolarmente alla base dello stampo di inclusione per assicurarsi che il piano della sezione trasversale tagli tutti gli strati di tessuto. Allineare il tessuto nello stampo.
  5. Posizionare la cassetta sulla parte superiore dello stampo, seguita da una colata secondaria di paraffina, riempiendo lo stampo.
  6. Posizionare lo stampo incorporato sulla piastra fredda e, dopo la solidificazione della paraffina, staccare i blocchi incorporati dagli stampi.

2. Estrazione dell'acido nucleico dai campioni

  1. Utilizzare i kit di estrazione e purificazione degli acidi nucleici per estrarre gli acidi nucleici da campioni di tessuto inclusi in paraffina.
  2. Utilizzare un quantificatore di acidi nucleici per quantificare l'acido nucleico estratto. Si raccomanda che la concentrazione di acido nucleico sia superiore a 2 ng/μL.
    NOTA: I materiali utilizzati qui sono disponibili nella Tabella dei materiali.

3. Preparazione per la libreria di sequenziamento

  1. Preparazione prima dell'esperimento
    1. Accendere la lampada UV nel banco di lavoro ultra-pulito, sterilizzare per 30 minuti. Quindi, spegnere la lampada UV e accendere la ventola per ventilare per 10 minuti.
    2. Estrarre l'acido nucleico dal frigorifero a -20 ± 5 °C., controllare e registrare l'ID del campione, il codice a barre dell'acido nucleico e il numero di etichetta specifico assegnato al campione. Metterlo sul rack della provetta da centrifuga per la dissoluzione a temperatura ambiente (RT) dopo la verifica e centrifugarlo per 10 s, con un valore fisso di 2.500 x g per lo standby.
  2. Amplificazione PCR del frammento target
    1. Prendi la soluzione di reazione di cattura dei frammenti, il primer di amplificazione del cancro gastrico e il primer di amplificazione della fusione dal kit di rilevamento dell'articolazione multigenica del cancro gastrico su misura e mettili sul ghiaccio per scioglierli. Agitarli e mescolarli dopo averli sciolti, centrifugarli per 10 s e preparare acqua priva di nucleasi. Informazioni dettagliate sull'innesco sono mostrate nella Tabella 1.
      NOTA: Il kit non è ancora disponibile in commercio, contattare gli autocentri per ulteriori dettagli.
    2. Preparare una provetta di reazione PCR da 0,2 mL, aggiungere i reagenti nella provetta a turno secondo la Tabella supplementare 1, agitare e mescolare per 5 s e centrifugare istantaneamente per 10 s, con un valore fisso di 2.500 x g, in modo che non vi siano gocce evidenti sulla parete e sul coperchio della provetta. I campioni di RNA devono essere trascritti inversamente in cDNA e quindi utilizzati per la successiva costruzione della libreria. I prodotti a base di cDNA devono essere aggiunti alle provette a turno secondo la tabella supplementare 2.
    3. Posizionare ciascun tubo di reazione sul termociclatore. Per i campioni di DNA, eseguire il programma di amplificazione come descritto nella Tabella 2. Per i prodotti a base di cDNA, eseguire il programma di amplificazione come descritto nella Tabella 3.
  3. Digestione della sequenza di primer
    1. Estrarre l'enzima di digestione primer e metterlo sul ghiaccio per farlo sciogliere. Dopo l'amplificazione, estrarre le provette di reazione di cui sopra, aggiungere 2 μl di enzima di digestione del primer a ciascuna provetta e assicurarsi che il volume totale sia di 22 μl.
    2. Agitare e mescolare la soluzione di reazione nella provetta per PCR e centrifugare istantaneamente per 10 s, con una tensione fissa di 2.500 x g.
    3. Inserire ciascun tubo di reazione sul termociclatore ed eseguire il programma come descritto nella Tabella 4.
  4. Legatura dell'adattatore
    1. Mettere l'adattatore che collega i reagenti sul ghiaccio per scioglierlo. Preparare una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL, quindi miscelare ciascun componente secondo la Tabella 5 e contrassegnarla come miscela adattatore X.
      NOTA: L'adattatore che collega i reagenti include adattatori P1 e adattatori specifici X, numerati da 1 a 48. Questi sono progettati per etichettare in modo univoco vari campioni. Quando si aggiunge un adattatore specifico, aprire solo una provetta alla volta per evitare la contaminazione incrociata dell'adattatore specifico. La miscela specifica dell'adattatore diluita può essere conservata a -20 ± 5 °C in standby. Nei flussi di lavoro di sequenziamento, i campioni non vengono elaborati singolarmente, ma più campioni, ciascuno etichettato con un adattatore specifico, vengono combinati in una libreria unificata per il sequenziamento. Questo metodo consente la successiva differenziazione dei campioni in base alle loro specifiche sequenze di adattatori.
    2. Estrarre il prodotto primer digerito (22 μL) dal termociclatore. Aggiungere i reagenti nella provetta a turno secondo la Tabella 6, agitare e mescolare per 5 s. Centrifugare a bassa velocità per 10 s, con una tensione fissa di 2.500 x g, in modo che non vi siano cadute evidenti sulla parete e sul coperchio della provetta.
    3. Posizionare il tubo di reazione sul termociclatore. Per i campioni di DNA, eseguire il programma di amplificazione come descritto nella Tabella 7. Per i prodotti cDNA, eseguire il programma di amplificazione come descritto nella Tabella 8.
  5. Purificazione del prodotto di legatura e amplificazione
    1. Estrarre in anticipo le microsfere magnetiche per la purificazione del DNA dal frigorifero a 2-8 °C, farle vorticare uniformemente e centrifugarle istantaneamente per 10 s, con una dose fissa di 2.500 x g. Equilibrare le perle magnetiche a RT per 30 min.
    2. Preparare una provetta per microcentrifuga a basso adsorbimento da 1,5 mL e trasferire il prodotto della reazione di legatura nella provetta corrispondente.
    3. Aggiungere 45 μL di microsfere magnetiche purificate con DNA in ciascuna provetta, agitare e mescolare bene, centrifugare istantaneamente per 10 s e incubare a RT per 5 minuti.
    4. Posizionare la provetta su una griglia magnetica per 3 minuti. Scartare il surnatante ed evitare di pipettare le perline.
    5. Trasferire 300 μl di etanolo al 75% appena preparato nella provetta per microcentrifuga e ruotare delicatamente le provette 4 volte a 180°. Dopo che la soluzione è limpida, scartare rapidamente il surnatante. Evitare di pipettare le perline. Ripetere la procedura di lavaggio 1 volta.
    6. Rimuovere le provette per microcentrifuga da 1,5 ml dal rack magnetico e centrifugare brevemente (10 s, con una tensione fissa di 2.500 x g). Riposizionare le provette nella rastrelliera magnetica e pipettare il liquido rimanente. Assicurarsi che non vi siano residui di liquido sulla parete del tubo.
    7. Aprire il tappo di ogni provetta da microcentrifuga da 1,5 ml e asciugare le perle a RT per 5 minuti. Prestare attenzione alle condizioni asciutto-bagnato delle perline. Dopo che le perle magnetiche si sono asciugate, verificare che non vi siano macchie d'acqua sulla superficie. Prolungare il tempo di asciugatura in modo appropriato se le perline magnetiche sono troppo bagnate. Chiudi immediatamente il coperchio se emergono crepe sulle perline e continua il passaggio successivo per amplificare e purificare la libreria.
  6. Amplificazione e purificazione della biblioteca
    1. Mettere in anticipo i reagenti relativi alla PCR sul ghiaccio per la dissoluzione, agitarli e centrifugarli per 10 s. Rimuovere la provetta per microcentrifuga da 1,5 mL dal rack magnetico, pipettare i reggenti della PCR nella provetta secondo la Tabella 9 e chiudere il tappo e il vortice per 5 secondi. Centrifugare brevemente (10 s) per evitare evidenti gocce di liquido sulla parete e sul coperchio della provetta.
    2. Trasferire il prodotto sopra in una nuova provetta per PCR. Incubare il campione su un termociclatore. Per i campioni di DNA, eseguire il programma di amplificazione come descritto nella Tabella 10. Per i prodotti a base di cDNA, eseguire il programma di amplificazione come descritto nella Tabella 11.
    3. Preparare una nuova provetta per microcentrifuga a basso adsorbimento da 1,5 mL. Centrifugare la provetta per PCR per 10 secondi dopo l'incubazione. Trasferire il prodotto dalla provetta per PCR alla provetta EP.
    4. Aggiungere 25 μl di microsfere magnetiche purificate con DNA in ciascuna provetta. Agitare e mescolare bene, centrifugare a bassa velocità e incubare a RT per 5 min.
    5. Posizionare le provette su una griglia magnetica per 3 minuti e attendere che la soluzione diventi limpida. Trasferire il surnatante in nuove provette per microcentrifuga. Evitare di pipettare le perline.
    6. Aggiungere 60 μl di microsfere magnetiche purificate con DNA in ciascuna provetta. Agitare e mescolare bene, centrifugare a bassa velocità e incubare a RT per 5 min.
    7. Posizionare le provette su una griglia magnetica per 3 minuti e attendere che la soluzione diventi limpida. Scartare il surnatante. Evitare di pipettare le perline.
    8. Trasferire 300 μl di etanolo al 75% appena preparato nelle provette e ruotare delicatamente le provette 4 volte a 180°. Dopo che la soluzione è limpida, pipettare rapidamente ed eliminare il surnatante. Evitare di pipettare le perline. Ripetere la procedura di lavaggio 1 volta.
    9. Rimuovere le provette per microcentrifuga da 1,5 mL dal rack magnetico e centrifugare brevemente (10 s). Reinserire le provette nella rastrelliera magnetica e pipettare il liquido rimanente. Assicurarsi che non vi siano residui di liquido sulla parete del tubo.
    10. Aprire i tappi delle provette da 1,5 ml e asciugare le perle a RT per 5 minuti. Prestare attenzione alle condizioni asciutto-bagnato delle perline. Dopo che le perle magnetiche sono state asciugate, non ci sono macchie d'acqua sulla superficie. Prolungare il tempo di asciugatura in modo appropriato se le perline magnetiche sono troppo bagnate. Chiudere immediatamente il coperchio se emergono crepe sulle perline.
    11. Pipettare 50 μl di eluente nelle provette, agitare e mescolare bene. Centrifugare brevemente (5 s, con una tensione fissa di 2.500 x g) e posizionare le provette a RT per 5 minuti.
    12. Posizionare le provette su una griglia magnetica per 3 minuti e attendere che la soluzione diventi limpida. Rimuovere con cautela il liquido in un nuovo tubo e segnare il nome della libreria.
    13. Conservare temporaneamente la biblioteca in frigorifero a 2-8 °C e attendere la determinazione quantitativa o conservare la biblioteca in frigorifero a -20 ± 5 °C per la conservazione a lungo termine.

4. Quantificazione della libreria costruita

  1. Usa il quantificatore di acidi nucleici per quantificare la libreria. Se la concentrazione della libreria è ≥ 0,2 ng/μL, è qualificata. In caso contrario, ricostruire la libreria.
  2. Mescolare un volume uguale di DNA (o RNA) e quantificare la soluzione. In base al risultato quantitativo, diluire la soluzione miscelata a 100 pmol/L utilizzando la seguente formula.
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    NOTA: Un'alternativa consiste nel diluire la libreria a 100 pmol/L secondo la formula, quindi quantificare mediante PCR quantitativa fluorescente. Mescolare equamente le librerie di DNA (o RNA) in base ai risultati quantitativi dello strumento PCR.
  3. Mescolare 100 pmol/L di DNA e RNA in un rapporto di 4:1. Utilizzare la soluzione mista di DNA e libreria di RNA per il sequenziamento computerizzato.

5. Sequenziamento

  1. Eseguire il sequenziamento facendo riferimento al manuale del kit universale di reazione di sequenziamento24,25 (metodo di sequenziamento dei semiconduttori).

6. Controllo qualità dei campioni

  1. Controllo di qualità positivo del DNA del cancro gastrico: Effettuare il controllo positivo del DNA del cancro gastrico ed eseguire il test secondo le istruzioni del kit. Il controllo è fornito con il kit. Il risultato mostra che vengono rilevati mutanti dei geni MTHFR, DHFR, MTR, GGH e SLC19A1 .
  2. Controllo di qualità negativo del DNA del cancro gastrico: Prendere il controllo negativo del DNA del cancro gastrico ed eseguire il test secondo le istruzioni del kit. Il controllo è fornito con il kit. Il risultato mostra che vengono rilevati i tipi selvatici dei geni MTHFR, DHFR, MTR, GGH e SLC19A1 .
    NOTA: Assicurarsi che i criteri siano soddisfatti in entrambi i casi, altrimenti è necessario un nuovo rilevamento.

7. Analisi dei dati

  1. Esegui il plug-in corrispondente (il software Variant Caller, Coverage Analysis e Ion Reporter) nel software Torrent Suite per ottenere i risultati dell'analisi dei campioni. Valutare i risultati del rilevamento del campione in base ai risultati dell'analisi del plug-in.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La determinazione dei risultati dei test si basa sul valore di giudizio positivo, che è anche riconosciuto come intervallo di riferimento. Utilizzare il metodo di sequenziamento dei semiconduttori per rilevare i campioni clinici raccolti. Quando il valore della frequenza di mutazione dei geni MTHFR, DHFR, MTR, GGH e SLC19A1 è ≥ 5%, il risultato del rilevamento è il mutante del gene corrispondente. Quando il valore della frequenza di mutazione è < 5 %, il risultato del rilevamento è il tipo selvatico del gene corrispondente26.

I seguenti criteri possono essere utilizzati per determinare se i risultati del rilevamento sono credibili. In primo luogo, se la copertura media dei risultati del sequenziamento del DNA è ≥ 500 e le letture mappate dei risultati del sequenziamento dell'RNA sono ≥ 20000, i risultati del test sono credibili27. In caso contrario, si consiglia di ripetere il test. In secondo luogo, la copertura media del controllo di qualità positivo del DNA del cancro gastrico è ≥ 500 e il risultato del test dovrebbe essere conforme alle mutazioni rs1801131 e rs1801133 del gene MTHFR , alle mutazioni rs1650697 e rs442767 del gene DHFR , alla mutazione rs1805087 del gene MTR , alla mutazione rs11545078 del gene GGH e alla mutazione rs1051298 del SLC19A1 gene come positivo. In caso contrario, si consiglia di ripetere il test. In terzo luogo, la copertura media del controllo di qualità negativo del DNA del cancro gastrico è ≥ 500 e i risultati del rilevamento dovrebbero mostrare che tutti i siti all'interno del campo di rilevamento di questo kit sono di tipo selvatico. In caso contrario, si consiglia di ripetere il test. Infine, la concentrazione della libreria è inferiore a 0,2 ng/μL, il che può essere dovuto alla degradazione del DNA o dell'RNA nel campione, o al mancato rispetto rigoroso del processo sperimentale o all'uso di reagenti scaduti durante l'esperimento. Le condizioni di cui sopra possono causare il declino o il fallimento della qualità del sequenziamento. Si consiglia di ricostruire la libreria.

Con questo kit, vengono seguiti una serie di passaggi per costruire una libreria di sequenziamento da campioni clinici. La libreria viene quindi sequenziata su una piattaforma di sequenziamento a semiconduttore ionico, con ANNOVAR utilizzato per annotare i risultati. Dopo il sequenziamento, viene utilizzato un documento per riassumere i tipi di mutanti per ciascun campione. L'assenza di un tipo mutante indicava che il campione non aveva subito quella specifica mutazione. La Tabella 3 supplementare fornisce un esempio tipico di ciò. La tabella 12 include informazioni di base sugli SNP rilevati qui. L'analisi di ogni SNP utilizzando l'annotazione basata su filtri in vari database, come il progetto 1000 Genomes (1000g2015aug; https://www.internationalgenome.org/; Tabella 13) e l'Exome Aggregation Consortium (ExAC; https://gnomad.broadinstitute.org/; Tabella 14), può rivelare che diversi SNP sono significativamente presenti in diverse popolazioni.

figure-results-1
Figura 1: Diagramma di flusso per il protocollo. Diagramma di flusso della rilevazione multigenica per il carcinoma gastrico utilizzando il metodo di sequenziamento dei semiconduttori. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

CromosomaUbicazioneIntervallo di progettazione del primerInnesco sinistroInnesco destro
CHR111854475CHR1:11854175-11854775ACAGGATGGG
GAAGTCACAG		AAACCGGAAT
GGTCACAAAG
11856377CHR1:11856077-11856677CTTCAGGTCA
GCCTCAAAGC		TCCCTGTGGT
CTCTTCATCC
chr579950780CHR5:79950480-79951080CGCCGCACAT
AGTAGGTTCT		CTTCCTCCTC
CAGCCCTATC
79951495CHR5:79951195-79951795CTTGGGTCAC
CTGCACAGTA		ATTTTGAAGC
ACCCAAGCTG
CHR1237048499CHR1:237048199-237048799CGAAGGCC
AGTCCCTTCT		CTCCCTTCAC
CAACTGTGCT
chr863938763chr8:63938463-63939063CAGTGAAGTT
CAGCGGCAT		TATTTTCCTGT
GTGGGGCAC
CHR2146934825CHR21:46934525-46935125CCAACCTGAG
ATGGCTTTTC		TCCTTGGTGC
TCTTGCTTTT

Tabella 1: Primer utilizzati per i sette SNP selezionati in cinque geni. Questo foglio mostra le informazioni sulla posizione dei primer degli SNP associati alla resistenza al 5-FU nel cancro gastrico.

TemperaturaOreNo. di cicli
99 °C2 minuti1 ciclo
99 °C15 secondi22 cicli
60 °C4 minuti
10 °CTenere1 ciclo

Tabella 2: Programma del ciclo termico per l'amplificazione del DNA. Vengono mostrate le condizioni di reazione termica, come temperatura, tempo e cicli.

PassoTemperaturaOreNo. di cicli
Attivare gli enzimi99 °C2 minuti1 ciclo
Denaturare99 °C15 secondi30 cicli
Ricottura e prolungamento60 °C4 minuti
Conservare10 °CTenere1 ciclo

Tabella 3: Programma del ciclo termico per l'amplificazione del cDNA. Vengono mostrate le condizioni di reazione termica, come temperatura, tempo e cicli.

TemperaturaOreNo. di cicli
50 °C10 minuti1 ciclo
55 °C10 minuti1 ciclo
60 °C20 minuti1 ciclo
10 °CTenere1 ciclo

Tabella 4: Programma del ciclo termico per la digestione della sequenza di primer. Vengono mostrate le condizioni delle reazioni termiche come temperatura, tempo e cicli.

ComponenteVolume
Adattatore P11,5 μl
Adattatore specifico X1,5 μl
Acqua priva di nucleasi3 μl
Volume totale del sistema di reazione6 μl
X: Indica il numero specifico dell'adattatore

Tabella 5: Sequenza di aggiunta dei reagenti per la preparazione della miscela adattatrice. Aggiungere i reagenti nella provetta nell'ordine indicato qui.

ComponenteVolume
Buffer di collegamento4 μl
Adattatore miscela X2 μl
DNA ligasi2 μl
Volume totale del sistema di reazione30 μl

Tabella 6: Sequenza di aggiunta dei reagenti nella produzione del primer digerito. Aggiungere i reagenti nella provetta nell'ordine indicato qui.

TemperaturaOreNo. di cicli
22 °C30 minuti1 ciclo
72 °C10 minuti1 ciclo
10 °CTenere1 ciclo

Tabella 7: Programma del ciclo termico per il collegamento dell'adattatore al DNA. Vengono mostrate le condizioni delle reazioni termiche come temperatura, tempo e cicli.

TemperaturaOreNo. di cicli
22 °C30 minuti1 ciclo
68 °C5 minuti1 ciclo
72 °C5 minuti1 ciclo
10 °CTenere1 ciclo

Tabella 8: Programma del ciclo termico per il collegamento dell'adattatore al cDNA. Vengono mostrate le condizioni delle reazioni termiche come temperatura, tempo e cicli.

ComponenteVolume
Soluzione di reazione dell'amplificazione della libreria50 μl
Miscela di primer per biblioteche2 μl
Volume totale del sistema di reazione52 μl

Tabella 9: Sequenza di aggiunta dei reagenti di amplificazione. Aggiungere i reagenti nella provetta nell'ordine indicato qui.

TemperaturaOreNo. di cicli
98 °C2 minuti1 ciclo
98 °C15 secondi5 cicli
60 °C1 minuto
10 °CTenere1 ciclo

Tabella 10: Programma del ciclo termico per l'amplificazione della libreria di DNA. Vengono mostrate le condizioni delle reazioni termiche come temperatura, tempo e cicli.

TemperaturaOreNo. di cicli
98 °C2 minuti1 ciclo
98 °C15 secondi5 cicli
64 °C1 minuto
10 °CTenere1 ciclo

Tabella 11: Programma del ciclo termico per l'amplificazione della libreria di cDNA. Vengono mostrate le condizioni delle reazioni termiche come temperatura, tempo e cicli.

RS1801131Codice: RS1801133RS1650697Visualizzazione RS442767RS1805087RS11545078Visualizzazione RS1051298
RefTGUnGUnGG
AltGUnGTGUnUn
Func.ref
GeneWithVer		esonicoesonicoUTR5controcorrenteesonicoesonicoUTR3
Gene.ref
GeneWithVer		MTHFRMTHFRDHFRDHFRMTRGGHSLC19A1
GeneDetail
.refGeneWithVer		..NG_023304.1:
g.5020T>G		...NM_001205206.1:
c.*64C>T;
NM_001205207.1:
c.*746C>T;
NM_194255:2:c.
*746C>T
ExonicFunc
.refGeneWithVer		non sinonimo;
SNV		non sinonimo;
SNV		..non sinonimo;
SNV		non sinonimo;
SNV		.
AAChange.ref
GeneWithVer		MTHFR:NM_00
1330358.1:exo
n8:c.A1409C:p.
E470A; MTHFR:
NM_005957.4:
esone8:c.A1286
C:p.E429A		MTHFR:NM_00
1330358.1:exo
n5:c.C788T:p.
A263V; MTHFR:N
M_005957.4:e
xon5:c.C665T:
p.A222V		..MTR:NM_0012
91939.1:exon2
5:c.A2603G:p.
D868G; MTR:N
M_001291940.
1:exon25:c.A1
535G:p.D512G;
MTR:NM_0002
54.2:Exon26:c.
A2756G:p.D91
9G		GGH:NM_003878
.2:exon5:c.C452T:
p.T151I		Jin
cytoBand1pag36.221pag36.225q14.15q14.11q438q12.321q22.3

Tabella 12: Informazioni rilevanti sugli SNP. Annotare i campioni utilizzando ANNOVAR.

MTHFRDHFRMTRGGHSLC19A1
RS1801131Codice: RS1801133RS1650697Visualizzazione RS442767RS1805087RS11545078Visualizzazione RS1051298
1000g2015aug_all0.2494010.2454070.768570.2901360.2182510.0854630.524361
1000g2015aug_afr0.15130.090.93490.03180.28440.0560.5772
1000g2015aug_amr0.15130.47410.7550.39910.17720.04030.4323
1000g2015aug_eas0.21920.29560.66070.58530.10520.08730.5635
1000g2015aug_eur0.31310.36480.75550.31910.1730.09240.4493
1000g2015aug_sas0.41720.11860.67790.2280.32110.14830.5552

Tabella 13: Annotazione basata su filtri di SNP nel progetto 1000 Genomes.

MTHFRDHFRMTRGGHSLC19A1
RS1801131Codice: RS1801133RS1650697Visualizzazione RS442767RS1805087RS11545078Visualizzazione RS1051298
ExAC_ALL0.2950.3037..0.20910.0936.
ExAC_AFR0.15880.1124..0.26660.0545.
ExAC_AMR0.15550.5141..0.18640.0361.
ExAC_EAS0.21480.3052..0.11320.0824.
ExAC_FIN0.31280.2227..0.18920.0581.
ExAC_NFE0.31910.345..0.19190.0969.
ExAC_OTH0.3040.3062..0.21080.0973.
ExAC_SAS0.41530.1409..0.3160.165.

Tabella 14: Annotazione basata su filtri di SNP nell'Exome Aggregation Consortium.

Tabella supplementare 1: Sequenza di aggiunta di reagenti per l'amplificazione del DNA. Aggiungere i reagenti nella provetta nell'ordine indicato qui. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 2: Sequenza di aggiunta di reagenti per l'amplificazione del cDNA. Aggiungere i reagenti nella provetta nell'ordine indicato qui. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 3: Esempio di risultati del sequenziamento di campioni clinici. Solo le mutazioni presenti nei campioni saranno registrate nei documenti. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli esperti clinici concordano all'unanimità sul fatto che i pazienti, anche con lo stesso tipo e stadio di cancro gastrico, possono avere risposte marcatamente diverse a un approccio terapeutico identico. Anni di ricerca hanno rivelato agli scienziati che le variazioni individuali sono principalmente attribuite alla natura del cancro gastrico come popolazione cellulare eterogenea, polimorfica e diversamente differenziata, portando a significative disparità individuali nelle risposte al trattamento28. Di conseguenza, l'acquisizione di campioni di cancro gastrico attraverso l'endoscopia o la chirurgia del tratto gastrointestinale superiore e di campioni di sangue, insieme al sequenziamento ad alto rendimento per l'analisi genetica, consente un trattamento personalizzato del cancro gastrico. Questa strategia è progettata per migliorare l'efficacia del trattamento clinico e ridurre il rischio di gravi effetti collaterali tossici. I progressi nella tecnologia di sequenziamento dei semiconduttori ionici hanno trasformato il trattamento personalizzato in una realtà pratica29.

Di seguito sono riportate alcune limitazioni di questo metodo di test. Il kit utilizzato qui è principalmente per la diagnosi in vitro , quindi si limita a rilevare la mutazione di rs1801131 e rs1801133 del gene MTHFR , rs1650697 e rs442767 del gene DHFR , rs1805087 del gene MTR , rs11545078 del gene GGH e rs1051298 di SLC19A1. La mutazione in altre sezioni non può essere rilevata. A causa della significativa eterogeneità del tessuto tumorale, diverse posizioni di campionamento possono influenzare i risultati del rilevamento. Per i campioni di tessuto inclusi in paraffina conservati per un periodo più lungo, il DNA e l'RNA possono essere degradati in una certa misura, influenzando i risultati del test. La raccolta, il trasporto e l'elaborazione irragionevoli dei campioni, nonché il funzionamento e l'ambiente sperimentale impropri possono portare a risultati falsi negativi o falsi positivi. Il risultato del rilevamento non può essere garantito se la concentrazione di acido nucleico è inferiore a 2 ng/μL. I risultati dei test del kit sono solo di riferimento clinico. La selezione del trattamento personalizzato per i pazienti deve essere considerata in combinazione con i loro sintomi/segni, l'anamnesi, altri test di laboratorio e le reazioni al trattamento. I risultati negativi non possono escludere completamente l'esistenza di mutazioni genetiche bersaglio. I risultati negativi possono anche essere causati da un numero insufficiente di cellule tumorali nel campione, da un'eccessiva degradazione dell'acido nucleico o dalla concentrazione del gene bersaglio nel sistema di reazione di amplificazione al di sotto del limite di rilevamento.

Alcuni indici di prestazione del kit utilizzato sono quelli descritti. Sensibilità analitica: per i campioni di DNA, la quantità minima rilevabile di acido nucleico totale in questo kit è di 10 ng e può essere rilevato un tasso di mutazione del 5%. Per i campioni di RNA, la quantità minima rilevabile dell'acido nucleico totale in questo kit è di 10 ng. Tasso di coincidenza positiva e negativa: il tasso di coincidenza positiva e negativa raggiunge il 100%. Limite di rilevamento (LOD): è possibile utilizzare un totale di 14 riferimenti LOD, numerati L1-L14. L1-L11 è LOD di riferimento dei geni MTHFR, DHFR, MTR, GGH e SLC19A1 e i loro risultati di rilevamento dovrebbero essere che i tipi di mutazione dei siti genici corrispondenti sono positivi e i tassi di coincidenza sono del 100%. Ripetibilità: è possibile utilizzare un totale di cinque materiali di riferimento ripetitivi, numerati R1-R5. R1 è un materiale di riferimento ripetitivo fortemente positivo (mutazione rs67376798 del gene DPYD ). R2, che contiene questa mutazione in numero minore, è un materiale di riferimento ripetitivo positivo debole (mutazione rs67376798 del gene DPYD ), R3 è un materiale di riferimento ripetitivo negativo (6 siti dei geni DPYD, MTHFR e ABCB1 sono rilevati come wild type). Ogni campione di riferimento deve essere testato 10 volte, assicurandosi che i risultati di queste valutazioni ripetute corrispondano alle classificazioni predefinite. Volume di dati: il volume effettivo di dati dei campioni di DNA e RNA deve essere controllato al di sopra di 0,05 M. La profondità di sequenziamento dei campioni di DNA deve essere controllata al di sopra di 500 e le letture mappate dei campioni di RNA devono essere controllate al di sopra di 20000. Test di interferenza: Questo kit non è influenzato da sostanze di interferenza endogene (trigliceridi e albumina) e da sostanze di interferenza esogene (formalina e alcol disidratato).

Durante l'esperimento è necessario osservare alcune precauzioni. Il kit qui utilizzato può essere utilizzato solo per test in vitro. Si prega di leggere attentamente questo manuale prima dell'esperimento e di utilizzarlo entro il periodo di validità. I componenti del kit in lotti diversi non possono essere utilizzati in modo intercambiabile. Si consiglia di utilizzare materiali di consumo monouso per questo kit per evitare contaminazioni. Durante l'uso di questo kit, si consiglia di utilizzare una testa di aspirazione con un elemento filtrante. Al fine di evitare potenziali pericoli biologici nel campione, il campione di prova dovrebbe essere considerato come una sostanza infettiva per evitare il contatto con la pelle e le mucose. Si consiglia di maneggiare i campioni in una cabina di biosicurezza in grado di impedire il deflusso di aerosol. Le provette e le ventose utilizzate nell'operazione devono essere sterilizzate prima di essere scartate. Il funzionamento e lo smaltimento dei campioni devono soddisfare i requisiti delle leggi e dei regolamenti pertinenti: Linee guida generali per la biosicurezza dei laboratori biomedici microbici e Regolamenti sulla gestione dei rifiuti sanitari del Ministero della Salute30,31. Il personale sperimentale deve ricevere una formazione professionale, operare in stretta conformità con le istruzioni e separare rigorosamente le aree secondo il processo sperimentale. In ogni fase dell'operazione sperimentale devono essere utilizzati strumenti ed attrezzature speciali e gli articoli in ogni fase di ciascuna area non devono essere utilizzati in modo intercambiabile. Il personale sperimentale deve separare rigorosamente le aree in base al processo sperimentale. In ogni fase dell'operazione sperimentale devono essere utilizzati strumenti e attrezzature speciali. Adottare le misure di protezione necessarie, come guanti, indumenti da lavoro, ecc. Lo smaltimento dei rifiuti deve essere conforme alle normative nazionali pertinenti.

Sebbene l'attenzione di questo articolo sia sui sette SNP all'interno di cinque geni correlati al cancro gastrico, il sequenziamento nelle applicazioni pratiche non è limitato solo a questi cinque geni. Questo articolo stabilisce definitivamente una correlazione significativa tra i sette SNP e la sensibilità alla chemioterapia con 5-FU nel carcinoma gastrico.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio è supportato dall'esplorazione del meccanismo e del ruolo del percorso ERK2/Snai1/AGPS/PUFA-PL nella resistenza delle cellule tumorali gastriche alla feroptosi indotta da apatinib (numero articolo: 82172814), supportato dalla National Nature Science Foundation of China; Indagine sul ruolo e sul meccanismo del fattore di trascrizione 1 a dita di zinco nella modulazione della resistenza delle cellule tumorali gastriche alla feroptosi indotta da apatinib attraverso la via dei fosfolipidi etere polinsaturi (Numero articolo: 2022A1515010267), supportata dal Comitato provinciale del Guangdong per il finanziamento della ricerca di base e applicata; e la ricerca e l'applicazione di reagenti per la diagnosi della chemiosensibilità 5-FU per il cancro gastrico (numero articolo: 201903010072), progetti scientifici e tecnologici a Guangzhou.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette DNA LoBind da 1,5 mLEppendorf30108051
provette da 50 mLGreiner Bio-One227261
Primer di amplificazione del cancro gastricoThermo FisherI primer vengono sintetizzati da Thermo Fshier secondo la sequenza in Tabella 1.
DeparaffinazioneQiagen19093
Purificazione del DNA perle magneticheBechkmanA63881
Alcool etilicoGuangzhou Reagente chimico
Fabbrica Thermo Fisher Scientific		http://www.chemicalreagent.com/
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0Thermo Fisher4480441
Vita dell'acqua senza nucleasi TecnologieAM9932
Provette per PCRAxygenPCR-02D-C
Provette per PCRAxygenPCR-02D-C
Puntali per pipette scientifici di qualitàhttps://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
Mini colonne PureLink RNAThermo FisherA29839
Kit di isolamento totale degli acidi nucleici RecoverAllThermo FisherAM1975
SCILOGESS1010E
TermociclatoreLife Technologies4375786
Analizzatore di acidi nucleici ultramicroBEIJING ORIENTAL SCIENCE & SVILUPPO TECNOLOGICO LTD.BD-1000
Prodotti Mini centrifuga da tavolo

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Wagner, A. D., et al. Chemotherapy for advanced gastric cancer. Cochrane Database Syst Rev. 8, (2017).
  3. Shah, M. A., et al. Immunotherapy and targeted therapy for advanced gastroesophageal cancer: Asco guideline. J Clin Oncol. 41 (7), 1470-1491 (2023).
  4. Loganayagam, A., et al. Pharmacogenetic variants in the dpyd, tyms, cda and mthfr genes are clinically significant predictors of fluoropyrimidine toxicity. Br J Cancer. 108 (12), 2505-2515 (2013).
  5. Giacchetti, S., et al. Phase iii multicenter randomized trial of oxaliplatin added to chronomodulated fluorouracil-leucovorin as first-line treatment of metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol. 18 (1), 136-147 (2000).
  6. Hoff, P. M., et al. Comparison of oral capecitabine versus intravenous fluorouracil plus leucovorin as first-line treatment in 605 patients with metastatic colorectal cancer: Results of a randomized phase iii study. J Clin Oncol. 19 (8), 2282-2292 (2001).
  7. Meulendijks, D., et al. Clinical relevance of dpyd variants c.1679t>g, c.1236g>a/hapb3, and c.1601g>a as predictors of severe fluoropyrimidine-associated toxicity: A systematic review and meta-analysis of individual patient data. Lancet Oncol. 16 (16), 1639-1650 (2015).
  8. Sadighi, S., Mohagheghi, M. A., Montazeri, A., Sadighi, Z. Quality of life in patients with advanced gastric cancer: A randomized trial comparing docetaxel, cisplatin, 5-fu (tcf) with epirubicin, cisplatin, 5-fu (ecf). BMC Cancer. 6, 274(2006).
  9. Collins, F. S., Brooks, L. D., Chakravarti, A. A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation. Genome Res. 8 (12), 1229-1231 (1998).
  10. Ladner, R. D. The role of dutpase and uracil-DNA repair in cancer chemotherapy. Curr Protein Pept Sci. 2 (4), 361-370 (2001).
  11. Capitain, O., et al. The influence of fluorouracil outcome parameters on tolerance and efficacy in patients with advanced colorectal cancer. Pharmacogenomics J. 8 (4), 256-267 (2008).
  12. Askari, B. S., Krajinovic, M. Dihydrofolate reductase gene variations in susceptibility to disease and treatment outcomes. Curr Genomics. 11 (8), 578-583 (2010).
  13. Ceppi, F., et al. DNA variants in dhfr gene and response to treatment in children with childhood b all: Revisited in aieop-bfm protocol. Pharmacogenomics. 19 (2), 105-112 (2018).
  14. Sharp, L., Little, J. Polymorphisms in genes involved in folate metabolism and colorectal neoplasia: A huge review. Am J Epidemiol. 159 (5), 423-443 (2004).
  15. Yousef, A. M., et al. The association of polymorphisms in folate-metabolizing genes with response to adjuvant chemotherapy of colorectal cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 82 (2), 237-243 (2018).
  16. Schneider, E., Ryan, T. J. Gamma-glutamyl hydrolase and drug resistance. Clin Chim Acta. 374 (1-2), 25-32 (2006).
  17. Moran, R. G. Roles of folylpoly-gamma-glutamate synthetase in therapeutics with tetrahydrofolate antimetabolites: An overview. Semin Oncol. 26 (2), 24-32 (1999).
  18. Maezawa, Y., et al. High gamma-glutamyl hydrolase and low folylpolyglutamate synthetase expression as prognostic biomarkers in patients with locally advanced gastric cancer who were administrated postoperative adjuvant chemotherapy with s-1. J Cancer Res Clin Oncol. 146 (1), 75-86 (2020).
  19. Cheng, Q., et al. A substrate specific functional polymorphism of human gamma-glutamyl hydrolase alters catalytic activity and methotrexate polyglutamate accumulation in acute lymphoblastic leukaemia cells. Pharmacogenetics. 14 (8), 557-567 (2004).
  20. Zhang, Q., et al. Recognition of cyclic dinucleotides and folates by human slc19a1. Nature. 612 (7938), 170-176 (2022).
  21. Ulrich, C. M., et al. Polymorphisms in folate-metabolizing enzymes and response to 5-fluorouracil among patients with stage ii or iii rectal cancer (int-0144; swog 9304). Cancer. 120 (21), 3329-3337 (2014).
  22. Zhang, X., et al. Discovery of novel biomarkers of therapeutic responses in han chinese pemetrexed-based treated advanced nsclc patients. Front Pharmacol. 10, 944(2019).
  23. Corrigan, A., et al. Pharmacogenetics of pemetrexed combination therapy in lung cancer: Pathway analysis reveals novel toxicity associations. Pharmacogenomics J. 14 (5), 411-417 (2014).
  24. Ion 520 & ion 530 ext kit - chef user guide. Thermofisherscientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0015805_Ion520_530ExTKit_UG.pdf (2023).
  25. Ion genestudio s5 instrument user guide. Thermofisherscientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0017528_Ion_GeneStudio_S5_Instrument_UG.pdf (2023).
  26. Parkin, N. T., et al. Multi-laboratory comparison of next-generation to sanger-based sequencing for hiv-1 drug resistance genotyping. Viruses. 12 (7), 694(2020).
  27. Ziller, M. J., Hansen, K. D., Meissner, A., Aryee, M. J. Coverage recommendations for methylation analysis by whole-genome bisulfite sequencing. Nat Methods. 12 (3), 230-232 (2015).
  28. Lordick, F., et al. Unmet needs and challenges in gastric cancer: The way forward. Cancer Treat Rev. 40 (6), 692-700 (2014).
  29. Kumar, K. R., Cowley, M. J., Davis, R. L. Next-generation sequencing and emerging technologies. Semin Thromb Hemost. 45 (7), 661-673 (2019).
  30. Chinese Centres for Disease Control and Prevention. Ministry of Health of the People's Republic of China. WS 233-2002. Chinese Centres for Disease Control and Prevention. , 1-64 (2002).
  31. China Environmental Protection Industry. Medical waste management regulations. China Environmental Protection Industry. (1), 6-10 (2004).

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