Articolo metodologico

Valutazione microbiologica rapida in loco per le malattie infettive polmonari

DOI:

10.3791/66059

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1 marzo 2024

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1Department of Emergency and the Intensive Care Unit, Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Critical Care Medicine, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Respiratory and critical care, Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo dimostra un flusso di lavoro rapido e standardizzato per la valutazione microbiologica rapida in loco (M-ROSE), che comprende tre fasi: creazione dei vetrini, colorazione e interpretazione. Questo protocollo aiuterà i medici a prendere decisioni cliniche rapide.

Abstract

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L'avvio tempestivo di una terapia antinfettiva empirica è fondamentale nei pazienti che presentano un'infezione polmonare inspiegabile. Sebbene l'acquisizione dell'imaging sia relativamente semplice nella pratica clinica, la sua mancanza di specificità spesso richiede ulteriori test che richiedono molto tempo, come la coltura dell'espettorato, la coltura del liquido di lavaggio broncoalveolare o il sequenziamento genetico per identificare con precisione l'eziologia sottostante della malattia. Inoltre, la limitata efficacia del trattamento antinfettivo empirico può contribuire all'uso improprio di antibiotici. I recenti progressi nell'interpretazione del background microbico sui vetrini ROSE (Rapid On-Site Evaluation) hanno consentito ai medici di ottenere prontamente campioni attraverso la broncoscopia (ad esempio, lavaggio alveolare, spazzolamento della mucosa, clamp tissutale), facilitando la colorazione al letto del paziente e l'interpretazione che fornisce informazioni microbiche essenziali sul background. Di conseguenza, questo stabilisce le basi per lo sviluppo di trattamenti anti-infezione mirati e piani di terapia farmacologica personalizzati. Con una migliore comprensione di quali agenti patogeni stanno causando infezioni in tempo reale, i medici possono evitare antibiotici ad ampio spettro non necessari che contribuiscono alla resistenza agli antibiotici. La creazione di un flusso di lavoro M-ROSE rapido e standardizzato all'interno dei reparti di medicina respiratoria o delle unità di terapia intensiva aiuterà notevolmente i medici a formulare strategie di trattamento accurate per i pazienti, il che ha implicazioni cliniche significative.

Introduzione

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La tecnica della valutazione rapida in loco (ROSE) è un metodo altamente efficiente impiegato nel campo delle procedure per le malattie polmonari. Consente il campionamento e l'intervento diagnostico in tempo reale, facilitando l'analisi citologica immediata1. Questo approccio innovativo prevede l'imprinting di una parte del campione di tessuto su un vetrino, preservandone l'integrità. Uno dei principali vantaggi di ROSE risiede nella sua capacità di facilitare l'interpretazione tempestiva delle informazioni cliniche attraverso tecniche di microscopia specializzate. Ciò comprende l'analisi della morfologia cellulare, la classificazione, la quantificazione, la determinazione dei rapporti costituenti, la valutazione della disposizione, l'analisi di correlazione, la valutazione del fondo e l'identificazione di oggetti estranei. Integrando tutti questi dati con le informazioni cliniche del paziente, ROSE svolge un ruolo fondamentale nella valutazione dell'adeguatezza del campionamento e nella guida delle procedure e delle tecniche interventistiche in tempo reale2.

In qualità di sussidiaria della tecnologia ROSE, la tecnologia M-ROSE si concentra principalmente sull'acquisizione del background microbiologico delle lesioni bersaglio piuttosto che sulla distinzione tra cellule benigne e maligne 3,4. Da un lato, M-ROSE consente l'identificazione microscopica di agenti patogeni come Aspergillus, Cryptococcus, Pneumocystis e Candida5. D'altra parte, ha implicazioni guida significative nella valutazione della qualità dei campioni respiratori, nella distinzione tra malattie infettive e non infettive, nella discriminazione dell'infezione dalla contaminazione, nonché nella valutazione della gravità e della prognosi dell'infezione 6,7. Ad esempio, all'interno di un campione respiratorio, la coesistenza di batteri che presentano una morfologia identica insieme a cellule infiammatorie infiltranti indica un'infezione; Al contrario, la presenza di più batteri morfologicamente diversi accompagnati da cellule epiteliali suggerisce una contaminazione. La capacità di analizzare in modo completo le informazioni cliniche e di prevedere gli esiti rende M-ROSE uno strumento inestimabile nelle procedure per le malattie polmonari.

In conclusione, ROSE funge da vettore citologico cruciale che migliora significativamente l'efficienza e la precisione della diagnosi delle malattie polmonari. Le sue molteplici capacità contribuiscono a migliorare gli esiti dei pazienti, garantendo un intervento tempestivo e facilitando una diagnosi accurata attraverso tecniche di campionamento e intervento diagnostico in tempo reale. Tuttavia, è importante notare che questi progressi si basano sull'ottenimento di campioni qualificati. In questo articolo, presentiamo un protocollo M-ROSE standardizzato che comprende la preparazione dei vetrini, le tecniche di colorazione e le linee guida per l'interpretazione. Questo protocollo funge da riferimento inestimabile per i medici per stabilire piani di valutazione e trattamento accurati, facilitando al contempo il processo decisionale in merito alla successiva gestione dei campioni target.

Protocollo

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Lo studio clinico è stato approvato dal Comitato di approvazione dell'Ospedale di Medicina Tradizionale Cinese di Chongqing (n. 2022-ky-31). Il caso tipico riguardava un paziente con diagnosi di polmonite da Pneumocystis e il consenso informato è stato ottenuto dal paziente.

1. Requisiti delle attrezzature e dei materiali per ROSE

  1. Attrezzatura: Fare riferimento alla Tabella dei materiali file per l'attrezzatura utilizzata in questo protocollo.
    NOTA: L'utilizzo di un microscopio citologico dedicato e di un sistema di imaging grafico è indispensabile (Figura 1A).
  2. Preparazione del materiale (vedi Tabella dei materiali).
    1. Preparare vetrini sterili per colture cellulari (con forte adesione cellulare), carta assorbente, guanti in lattice senza polvere, aghi per siringa monouso da 2,5-5 ml e posizionare il set completo di soluzioni coloranti Diff Quik (DQ) in barattoli di vetro con coperchi sigillati per una facile manipolazione (Figura 1).

2. Flusso di lavoro M-ROSE

  1. Preparazione di vetrini citologici
    NOTA: Esistono molti modi per preparare i vetrini e di seguito sono riportati diversi metodi di preparazione comunemente utilizzati.
    1. Scivoli a rullo
      NOTA: Garantire una perdita minima di campione di tessuto durante questo processo.
      1. Estrarre le particelle di tessuto utilizzando un ago per siringa monouso con una capacità di 2,5-5 ml (Figura 2A).
      2. Stendere un'area circolare, di circa 1 cm di diametro e di spessore moderato, dalla sezione interna a quella esterna di un terzo dell'estremità colorata (l'estremità che mostra un forte attaccamento cellulare) sul vetrino citologico sterile.
    2. Slitte a pennello
      NOTA: Questo metodo è applicabile a campioni ottenuti utilizzando spazzole cellulari convenzionali, spazzole cellulari anti-inquinamento o spazzole cellulari ultrafini, nonché campioni semiliquidi come espettorato e fluidi corporei viscosi.
      1. Estendere la testina e applicarla sul terzo distale del vetrino citologico sterile (il vetrino ha forti proprietà di adesione cellulare) per ottenere un'area rettangolare di circa 2 cm x 1 cm con uno spessore moderato.
    3. Scivoli spray
      1. Posizionare l'ago da puntura su un terzo dell'estremità colorata di un vetrino citologico sterile con una robusta adesione cellulare.
      2. Applicare una pressione d'aria sulla punta dell'ago da piercing e inserirlo dal lato interno verso l'esterno, formando un'area circolare di medio spessore di circa 1 cm di diametro.
  2. Colorazione citologica dei vetrini
    NOTA: L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) raccomanda la colorazione rapida del vetrino citologico ROSE utilizzando ilcolorante 5 di Diff. Il colorante Diff può essere riutilizzato ma non ripetuto molte volte. Se sono presenti sedimenti, devono essere filtrati dopo l'uso. La tintura troppo profonda può essere adeguatamente decolorata da metanolo o alcol, preferibilmente non più colorato. Se la tintura è troppo profonda o troppo superficiale, è necessario regolare il tempo di tintura o la concentrazione del liquido di lavoro; il valore del pH ha una certa influenza sulla tintura e il vetrino deve essere pulito e privo di inquinamento acido e alcalino. Sia la soluzione Diff A che la soluzione Diff B sono volatili e devono essere sigillate e conservate dopo l'uso.
    1. Immergere il vetrino nella soluzione di Diff A per 10-30 s (Figura 2B), quindi sciacquarlo nel bagno di tintura PBS per rimuovere la soluzione di Diff A in eccesso e scuotere delicatamente il tampone rimanente (Figura 2C).
    2. Quindi, immergere il vetrino nella soluzione Diff B per 20-40 s (Figura 2E).
    3. Infine, pulire il vetrino nella vasca di tintura ad acqua (Figura 2F), tamponare e asciugare il liquido residuo del vetrino con carta assorbente (Figura 2D) e terminare la tintura.
      NOTA: M-ROSE consente la visualizzazione diretta dei microrganismi patogeni e facilita la valutazione della qualità dei campioni respiratori, consentendo la discriminazione tra infezione e non infezione, nonché tra infezione e contaminazione, che ha un significato guida per la valutazione della gravità e della prognosi dell'infezione. La sezione di discussione tratterà questo aspetto in quanto non prevede alcuna procedura sperimentale.

Risultati

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In un caso tipico, un uomo di 63 anni si è presentato in ospedale con tosse, febbre e dolore toracico. Al paziente era stata precedentemente diagnosticata la sindrome nefrosica, caratterizzata da proteinuria ed edema, e ha ricevuto un trattamento con prednisone e tacrolimus per lungo tempo. I risultati iniziali di laboratorio hanno dimostrato una conta dei globuli bianchi di 10,49 x 109/L, una conta dei neutrofili di 8,87 x 109/L, una proteina C-reattiva nel sangue intero e concentrazioni di (1-3)-β-D-glucano di 155,81 mg/L e 249,7 pg/mL. La tomografia computerizzata (TC) del torace ha mostrato opacizzazione a vetro smerigliato con una posizione diffusa, bilaterale e centrale (Figura 3A). Il trattamento antinfettivo iniziale con cefoperazone tazobactam è stato inefficace e i suoi sintomi sono stati aggravati da stanchezza cardiaca, mancanza di respiro e dispnea dopo l'esercizio; l'imaging TC ripetuto non ha mostrato miglioramenti significativi (Figura 3B). Successivamente, il paziente è stato trasferito nell'unità di terapia intensiva (ICU) per la ventilazione meccanica e sottoposto a broncoscopia. Il campionamento a fuoco è stato accessibile sotto la guida della navigazione virtuale e sono stati raccolti tre campioni di biopsia con pinza (Figura 4). ROSE era disponibile per una valutazione microscopica immediata del tessuto e la diagnosi di Pneumocystis jiroveci è stata confermata (Figura 5A). Il paziente ha ricevuto immediatamente un trattamento antimicotico con sulfametossazolo (1,92 g, q6h); la successiva colorazione (Figura 5B-E) ha confermato questa diagnosi. Tuttavia, l'imaging TC ripetuto non ha ancora mostrato miglioramenti significativi (Figura 3C). Il paziente ha ricevuto carbofungin (il primo giorno di 70 mg e seguito da 50 mg al giorno), metilprednisolone (80 mg al giorno) e immunoglobuline (10 g al giorno) per l'infezione fungina. I sintomi sono stati rapidamente alleviati e il paziente ha continuato il trattamento di follow-up.

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Figura 1: Attrezzature e materiali. (A) Microscopio citologico e sistema di imaging grafico. (B) Soluzione colorante Diff Quik (DQ) A. (C) Soluzione colorante Diff Quik (DQ) B. (D) Guanti in lattice senza polvere. (E) Vetrini sterili per colture cellulari. (F) Aghi per siringa monouso da 2,5-5 mL. (G) Carta assorbente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Flusso di lavoro M-ROSE. (A) Stampa della diapositiva. (B) Immergere il vetrino nella soluzione Diff A per 10-30 s. (C) Sciacquare il vetrino nel bagno di tintura PBS per rimuovere la soluzione Diff A in eccesso. (D) Tamponare e rimuovere il liquido residuo dal vetrino con carta assorbente. (E) Immergere il vetrino nella soluzione Diff B per 20-40 s. (F) Pulire il vetrino nella vasca di tintura dell'acqua. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Immagini TC del torace. (A) Al momento del ricovero. (B) Il giorno del trasferimento in terapia intensiva. (C) Dopo il trattamento con sulfametossazolo Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Localizzazione del segmento basale posteriore del lobo inferiore del polmone destro mediante VBN. (A) Bronco principale destro. (B) Bronco medio destro. (C) Segmento basale posteriore del bronco del lobo inferiore del polmone destro. (D) Mappa 3D di VBN. (E) Mappa coronale della TC del torace. (F) Mappa assiale della TC del torace. (G) Mappa sagittale della TC del torace Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Immagini che documentano l'aspetto di pneumocystis in vari metodi di colorazione. (A) ROSA 100 x 10; Freccia bianca: cisti contenenti ascospore. (B) Ematossilina ed eosina (H-E), 60 x 10. (C) Blu alciano, 60 x 10. (D) GIEMSA, 40 x 10. (E) Esame, argento, 20 x 10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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La pneumologia interventistica è una branca preziosa delle moderne malattie respiratorie; In particolare, è stato ampiamente utilizzato nella diagnosi delle malattie polmonari 8,9. Negli ultimi anni, la pneumologia interventistica diagnostica ha prosperato a causa dell'aumento della prevalenza di tumori maligni polmonari, delle infezioni da agenti patogeni più resistenti ai farmaci che si verificano nel tratto respiratorio inferiore e delle richieste di diagnosi di malattie respiratorie sconcertanti e critiche 10,11,12. L'efficienza della diagnostica interventistica dipende da fattori quali le dimensioni e la posizione anatomica delle aree focali, i tassi di complicanze e il numero di siti bioptici e le malattie sottostanti, promuovendo l'uso clinico di numerose tecnologie e strutture avanzate13. ROSE ha ricevuto una notevole attenzione ed è emersa rapidamente come una "tecnica di accompagnamento in tempo reale" per la diagnosi in pneumologia interventistica.

ROSE è progettato per una valutazione rapida, una diagnosi preliminare e la definizione delle priorità della soddisfazione del campione durante procedure come puntura, biopsia e spazzolamento. Fornisce un feedback per guidare i successivi progressi tecnologici 14,15,16,17. M-ROSE, una branca di ROSE, si concentra principalmente sulla valutazione del background microbico piuttosto che sulla valutazione della malignità delle cellule tissutali5. Il metodo M-ROSE è una tecnica di valutazione rapida piuttosto che uno strumento diagnostico, quindi la sua efficacia diagnostica non deve essere esagerata. La sua applicazione clinica comprende principalmente i seguenti aspetti: identificazione visiva di alcuni microrganismi patogeni, differenziazione tra infezione e contaminazione e discriminazione tra infezione e non infezione7.

Dopo una rapida colorazione, il nucleo cellulare del tessuto mostrava una tonalità rosso-violacea, mentre il citoplasma mostrava un colore viola-bluastro. Batteri e funghi apparivano blu, determinando un netto contrasto tra le cellule dei tessuti e gli agenti patogeni7. M-ROSE potrebbe dimostrare un certo livello di capacità nell'identificare batteri e funghi. In particolare, mostra un alto tasso di positività per Aspergillus, cryptococcus, Pneumocystis jiroveci e altri funghi 3,18. Tuttavia, ha dei limiti quando si tratta di riconoscere agenti patogeni con volume e diametro ridotti o agenti patogeni intracellulari. È fondamentale sottolineare che la diagnosi di qualsiasi malattia dovrebbe basarsi su una valutazione completa che comprenda le condizioni fondamentali del paziente, le manifestazioni cliniche, gli esami di imaging e altri fattori, piuttosto che basarsi esclusivamente sull'identificazione microscopica di microrganismi patogeni.

M-ROSE offre anche vantaggi nell'identificazione di infezioni e contaminazioni, come la valutazione della qualità dei campioni di liquido di lavaggio alveolare. Nei reparti in cui le condizioni lo consentono, la valutazione al letto del paziente del liquido di lavaggio può essere condotta mediante centrifugazione e colorazione. Campioni qualificati di liquido di lavaggio alveolare dimostrano che la percentuale di cellule squamose tra tutte le cellule (esclusi i globuli rossi) al microscopio a bassa potenza è inferiore all'1%, le cellule epiteliali colonnari sono inferiori al 5% e i globuli rossi sono inferiori al 10% (esclusi i fattori correlati a traumi o sanguinamento)19. L'esame microscopico del background citologico ci faciliterà nel fare valutazioni tempestive.

Inoltre, M-ROSE può aiutare a distinguere tra lesioni infette e non infette5. Nelle lesioni infette, c'è spesso infiltrazione di neutrofili, macrofagi e linfociti da parte delle cellule infiammatorie, con osservazione occasionale di fagocitosi dei neutrofili. Al contrario, le lesioni non infette in genere mancano di infiltrazione di cellule infiammatorie.

Il protocollo qui presentato dimostra il processo di funzionamento di M-ROSE; Attraverso l'interpretazione del background microbiologico, è possibile effettuare la diagnosi preliminare o ristringere la diagnosi differenziale. Come suggeriscono i nostri risultati, la diagnosi di PCP richiede un'evidenza confermata di Pneumocystis jiroveci, che non dovrebbe essere basata su manifestazioni cliniche e imaging, anche nei pazienti sintomatici ad alto rischio. L'identificazione microscopica dell'ascus e delle forme trofiche è la prova più intuitiva. L'efficienza diagnostica è in gran parte determinata dal metodo di colorazione del campione. Storicamente, i coloranti convenzionali come la sindrome di Wright-Giemsa, l'argento esaamminico e il blu di toluidina sono disponibili per la PCP, ma richiedono molto tempo e hanno una sensibilità inferiore. In questo caso, la diagnosi immediata di PCP è stata confermata il primo giorno del trasferimento del paziente in terapia intensiva con l'uso di ROSE. Diff-quick ha dimostrato il suo vantaggio nell'identificazione della pneumocisti, caratterizzata da una struttura chiara, un forte contrasto e una facile identificazione dell'ascus (Figura 5A).

Anche nell'applicazione della medicina etnica, ROSE ha un valore significativo. Ad esempio, nelle malattie suppurative, i medici possono identificare una vasta gamma di cellule infiammatorie dominate principalmente da neutrofili all'interno del background microbiologico5. Di conseguenza, i farmaci con proprietà schiarenti e disintossicanti possono essere selezionati come potenziali trattamenti per queste condizioni, come il caprifoglio, il tarassaco e la patrinia, tra gli altri.

Poiché la ROSE è un programma aggiuntivo che non deve essere selezionato in pneumologia interventistica, l'esecuzione della ROSE è destinata ad aumentare i costi economici e di manodopera. È discutibile che ROSE debba essere utilizzato regolarmente. In termini di vantaggi economici, il tempo e il costo del lavoro sono ciò che ci preoccupa. La principale necessità di manodopera aggiuntiva è il valutatore. La valutazione ROSE può essere eseguita da un citotecnologo, patologo o clinico. I citotecnologi sono il personale più adatto per la procedura ROSE. Tuttavia, nella pratica clinica, i medici sostituiscono il ruolo, ma può richiedere una certa base di formazione15. Uno studio precedente ha dimostrato che un programma di formazione potrebbe aiutare a migliorare l'accuratezza della valutazione dell'adeguatezza eseguita dai medici ed eliminare le variabili confondenti20. Inoltre, M-ROSE, come tecnica diagnostica morfologica, ha fattori soggettivi nel suo rapporto sui risultati. I medici devono effettuare una valutazione completa basata su ulteriori informazioni cliniche.

Raccomandiamo agli ospedali con strutture adeguate e professionisti qualificati di prendere in considerazione l'implementazione della procedura ROSE nei loro reparti respiratori o nelle unità di terapia intensiva, in quanto può facilitare la valutazione precoce di malattie respiratorie critiche impegnative e guidare efficacemente il trattamento clinico.

Dichiarazioni

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Gli autori non segnalano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Apprezziamo il progetto di incentivazione e orientamento delle prestazioni dell'istituto di ricerca scientifica di Chongqing (jxyn-2021-1-15 e jxyn-2021-2-6) per il sostegno finanziario.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Microscopio citologicoOlympus CorporationCX43
Diff Quik (DQ) soluzioni di colorazioneBesso Biotechnology Co. LTDG1541
Aghi per siringa monouso da 2,5-5 mLShandong Zhu Pharmaceutical Group20183150304
Guanti in lattice senza polvereHenan Yadu Industrial Co., LTD20182140728
Cella sterile diapositive culturaliJinan Preret industria e commercio Co., LTD7101

Riferimenti

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