Utilizzo del test Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) nella ricerca sui mioblasti di topo

Sommario

I ricercatori che non conoscono il campo epigenetico troveranno CUT&Tag un'alternativa significativamente più semplice ai saggi ChIP. CUT&Tag ha apportato enormi benefici agli studi epigenetici su popolazioni cellulari rare e primarie, generando dati di alta qualità da pochissime cellule. Questo protocollo descrive l'esecuzione di saggi H3K4me1 CUT&Tag su mioblasti di topo isolati dai muscoli degli arti posteriori di topo.

Abstract

Questo documento protocollare mira a fornire ai nuovi ricercatori tutti i dettagli sull'utilizzo di Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) per profilare le posizioni genomiche dei fattori di legame della cromatina, dei segni istonici e delle varianti istoniche. I protocolli CUT&Tag funzionano molto bene con i mioblasti di topo e le cellule staminali muscolari (MuSC) appena isolate. Possono essere facilmente applicati a molti altri tipi di cellule, purché le cellule possano essere immobilizzate dalle perle di Concanavalina-A. Rispetto a CUT&Tag, i saggi di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) sono esperimenti che richiedono molto tempo. I saggi ChIP richiedono il pretrattamento della cromatina prima che il materiale cromatico possa essere utilizzato per l'immunoprecipitazione. Nella ChIP reticolante (X-ChIP), il pretrattamento della cromatina comporta la reticolazione e la sonicazione per frammentare la cromatina. Nel caso della ChIP nativa (N-ChIP), le cromatine frammentate sono normalmente ottenute dalla digestione della nucleasi micrococcica (MNasi). Sia la sonicazione che la digestione MNasi introducono alcune distorsioni negli esperimenti ChIP. I saggi CUT&Tag possono essere completati in meno passaggi e richiedono molte meno cellule rispetto ai ChIP, ma forniscono informazioni più imparziali sui fattori di trascrizione o sui marcatori istonici in varie posizioni genomiche. CUT&Tag può funzionare con un minimo di 5.000 celle. A causa della sua maggiore sensibilità e del segnale di fondo inferiore rispetto ai ChIP, i ricercatori possono aspettarsi di ottenere dati di picco affidabili da soli diversi milioni di letture dopo il sequenziamento.

Introduzione

Il saggio CUT&Tag è stato inventato per compensare alcuni difetti evidenti dei ChIP¹. I due principali svantaggi dei ChIP sono 1) la distorsione introdotta durante la frammentazione della cromatina e 2) l'incompetenza nel lavorare con un basso numero di cellule. I saggi X-ChIP si basano sulla sonicazione o sulla digestione MNasi per ottenere frammenti di cromatina, mentre N-ChIP utilizza principalmente la digestione MNasi per ottenere nucleosomi. La sonicazione mostra una tendenza verso le posizioni rilassate della cromatina come le regioni^{promotrici 2} e, a quanto pare, la digestione della MNasi funziona anche in modo più efficiente sulle fibre di cromatina rilassate. Inoltre, alcuni hanno riportato che la digestione della MNasi mostra anche un bias DNA-dipendente³. Pertanto, nella fase di preparazione dell'input dei saggi ChIP, è impossibile ottenere frammenti di cromatina da tutti i tipi di posizioni genomiche in modo perfettamente casuale. Inoltre, i saggi ChIP normalmente generano segnali di fondo più elevati rispetto a CUT&Tag e richiedono oltre 10 volte più letture rispetto a CUT&Tag per accentuare i picchi di ^1,4,5. Questo spiega perché gli esperimenti ChIP devono iniziare con un numero enormemente maggiore di cellule rispetto a CUT&Tag. Questo non è un problema quando si studiano le linee cellulari in quanto possono essere fatte passare ripetutamente per ottenere un numero di cellule molto elevato. Tuttavia, il test ChIP non è sicuramente uno strumento epigenetico potente per studiare popolazioni di cellule primarie rare o preziose, sebbene le cellule primarie abbiano ovviamente implicazioni più pratiche e mediche.

Mentre la lunga e complicata procedura ChIP scoraggia alcuni ricercatori dall'imparare o utilizzare questa tecnica, le persone si sentono più a loro agio con test più semplici come l'immunocitochimica (ICC) o l'immunofluorescenza (IF). Un test CUT&Tag assomiglia essenzialmente al processo degli esperimenti ICC e IF, ma si svolge solo in una provetta. CUT&Tag non ha bisogno di cromatina frammentata per iniziare e, invece, il genoma deve essere intatto per il legame con gli anticorpi¹. Il primo giorno di un esperimento ChIP, i ricercatori normalmente impiegano fino a 4 ore per preparare le cromatine frammentate dai nuclei con sonicazione o digestione MNasi prima che i brevi pezzi di cromatina possano essere mescolati con perle di anticorpi ^4,5. In notevole contrasto, il carico di lavoro del primo giorno di una procedura CUT&Tag consiste semplicemente nell'immobilizzare le cellule in perle di Concanavalina-A e quindi aggiungere l'anticorpo primario sulle perle cellulari. Questo richiede solo ~40 min¹.

Vale la pena ricordare che la scissione sotto i bersagli e il rilascio mediante nucleasi (CUT&RUN) è un'importante alternativa a CUT&Tag. CUT&RUN è stata fondata sulla base di un meccanismo di funzionamento simile a quello di CUT&Tag. In CUT&Tag, gli anticorpi guidano la trasposisi pA/G-Tn5 in tutte le posizioni in cui l'enzima taglierà un pezzo di cromatina e nel frattempo lo taggherà con adattatori per la creazione di librerie, mentre in CUT&RUN, il ruolo di pA/G-Tn5 è svolto dalla pA/G-MNasi che esegue solo la parte di taglio del lavoro⁶. Pertanto, rispetto a CUT&Tag, CUT&RUN richiede un passaggio aggiuntivo che consiste nell'incollare gli adattatori per la creazione di librerie sui pezzi di DNA frammentati pA/G-MNasi ^7,8. A causa delle elevate somiglianze tra CUT&Tag e CUT&RUN, i ricercatori che hanno familiarità con CUT&Tag si adatteranno facilmente a eseguire CUT&RUN in modo competente. Tuttavia, va notato che esistono alcune piccole differenze tra CUT&Tag e CUT&RUN. I protocolli CUT&RUN utilizzano normalmente la concentrazione fisica di sale (~150 mM) nelle fasi di lavaggio, mentre in CUT&Tag, il tampone di lavaggio 300-Dig è ad alto contenuto di sale. Pertanto, CUT&Tag è in grado di controllare il background durante la profilazione di marcature/varianti istoniche o fattori di trascrizione, poiché queste proteine legano direttamente e fortemente il DNA¹. CUT&Tag può incorrere in problemi durante la profilazione dei fattori associati alla cromatina che non legano direttamente il DNA e mostrano una debole affinità con la cromatina. Le fasi di lavaggio ad alto contenuto di sale in CUT&Tag possono eliminare i fattori associati alla cromatina e non causare segnali nell'output finale. Sebbene ci siano casi di successo in cui CUT&Tag può essere utilizzato per profilare^{alcune proteine 9} non istoniche/non trascrizioni, raccomandiamo comunque CUT&RUN rispetto a CUT&Tag per profilare le proteine associate alla cromatina debolmente legate.

Dopo che i mammiferi raggiungono l'età adulta, i loro tessuti muscolari scheletrici contengono ancora cellule staminali muscolari. Durante la lesione muscolare, queste cellule staminali possono essere attivate e subire l'espansione e la differenziazione del numero di cellule per rigenerare le fibre muscolari danneggiate¹⁰. Queste cellule staminali sono note come cellule staminali/satelliti muscolari (MuSC). Dopo che le MuSC sono state isolate dagli animali o una volta attivate da una lesione muscolare, iniziano a proliferare e diventano mioblasti.

Per ottenere MuSC dalla digestione del muscolo scheletrico di topo, i marcatori di superficie MuSC come Vcam1 (Cd106), Cd34 e α7-integrina (Itga7) vengono spesso utilizzati singolarmente o in combinazione per arricchire le MuSC durante la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS)¹¹. È stato dimostrato che Cd31^-/Cd45^-/Sca1^-/Vcam1⁺ è probabilmente la migliore combinazione di marcatori per ottenere MuSC¹² puri al >95%. Il FACS è in grado di isolare i MuSC puri subito dopo la digestione dei muscoli freschi. Tuttavia, se il disegno sperimentale non richiede MuSC puri proprio al momento del loro isolamento, la pre-placcatura è più conveniente rispetto alla FACS per ottenere mioblasti puri al >90% (progenie MuSC).

Le muSC appena isolate dai topi non proliferano in modo efficiente nei terreni F10 di Ham integrati con siero fetale bovino (FBS). Per espandere meglio il numero di cellule di MuSC e ottenere un numero sufficiente di mioblasti, è necessario utilizzare il siero di crescita bovina (BGS) al posto dell'FBS. Tuttavia, se il BGS non è disponibile, il terreno completo F10 di Ham (contenente circa il 20% di FBS) può essere miscelato con un volume uguale di terreno condizionale delle cellule T per promuovere notevolmente l'espansione dei mioblasti¹³. Pertanto, questo protocollo descriverà anche la preparazione di terreni MuSC condizionati con cellule T.

Ancora più importante, questo protocollo fornisce un esempio completo dell'esecuzione di saggi H3K4me1 CUT&Tag su mioblasti di topo isolati dai muscoli degli arti posteriori di topo. Si prega di notare che questo protocollo si applica anche ad altri tipi di cellule e ai segni istonici e alle varianti istoniche, e i lettori devono solo ottimizzare il numero di cellule o la quantità di anticorpi per i loro casi in base all'arricchimento dei segni istonici specifici o delle varianti che studiano.

Per essere utilizzato in CUT&Tag o CUT&RUN, il Tn5 o la MNasi devono essere fusi con la proteina A o la proteina G per produrre pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNasi o pG-MNasi. Apparentemente, sia la proteina A che la proteina G possono essere fuse su questi enzimi allo stesso tempo per generare pA/G-Tn5 o pA/G-MNasi. La proteina A e la proteina G mostrano affinità differenziali con le IgG di specie diverse. Pertanto, fondere la proteina A e la proteina G insieme all'enzima può superare questo problema e rendere l'enzima compatibile con gli anticorpi di più specie.

Protocollo

I metodi presentati in questo manoscritto sono tutti approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali del Laboratorio di Guangzhou. I topi utilizzati per generare i risultati rappresentativi di questo manoscritto sono stati alloggiati e mantenuti in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali del Laboratorio di Guangzhou.

1. Isolamento dei mioblasti dai muscoli degli arti posteriori del topo (Esempio di utilizzo di 1 topo)

1. Diluire l'acido acetico glaciale con ddH₂O a 0,02 M e sterilizzarlo in autoclave.
2. Diluire il collagene (dalla coda di ratto) a 0,1 mg/mL con acido acetico 0,02 M.
3. Aggiungere questa soluzione di collagene nelle piastre di coltura per rivestire il fondo della capsula in un incubatore cellulare a 37 °C per la notte.
4. Prima dell'uso, rimuovere la soluzione di collagene e lavare il piatto due volte con 1x PBS. La soluzione di collagene può essere riutilizzata per 8-10 volte.
5. Sacrifica un topo di 8-12 settimane. (I topi anziani hanno scarse rese di MuSC e mioblasti.)
6. Isolare e posizionare tutti i muscoli degli arti posteriori del topo in un piatto di 10 cm.
7. Utilizzare 1x PBS (con penicillina/streptomicina) per sciacquare i muscoli 4 volte. Dopo ogni risciacquo, trasferire sempre i muscoli in una nuova piastra.
8. Dopo l'ultimo risciacquo, rimuovere la PBS e tritare i muscoli con le forbici.
9. Aggiungere 6 ml di 1x PBS contenente dispasi II (1,1 U/mL) e collagenasi II (830 U/mL) per digerire i muscoli tritati e la digestione dovrebbe durare per ~1,5 ore.
10. Per eseguire la digestione, trasferire i muscoli tritati in una provetta a bagnomaria a 37 °C o lasciare direttamente i muscoli macinati all'interno del piatto e metterlo in un incubatore di cellule CO₂ a 37 °C.
11. Se usi un incubatore cellulare per digerire, scuoti il piatto ogni 15-30 minuti per mescolare bene la digestione.
    NOTA: La dispasi II deve essere prodotta prima come stock da 11 U/mL con terreno DMEM (senza siero) e la collagenasi II deve essere prodotta come stock da 10.000 U/mL con 1x PBS.
12. Al termine della digestione, utilizzare una pipetta di plastica da 10 ml per sciacquare più volte i tessuti digeriti su e giù per omogeneizzare accuratamente la miscela di digestione.
13. Aggiungere 10 mL di terreno di coltura MuSC/Myoblast per rallentare la digestione. I dettagli sulla preparazione dei terreni di crescita MuSC/Myoblast sono disponibili nella Sezione 2.
14. Passare il composto attraverso un colino da 70 μm. Usa 1x PBS per sciacquare la piastra di digestione e fai passare anche questo PBS attraverso il colino, al fine di raccogliere tutte le cellule nella piastra di digestione.
15. Centrifugare a 350 x g per 10 min ed eliminare il surnatante con il vuoto.
16. Risospendere il pellet cellulare con 20 mL di 1x PBS e far passare le cellule attraverso un colino da 40 μm.
17. Centrifugare a 350 x g per 5 min e rimuovere il surnatante con il vuoto.
18. Utilizzare 20 ml di terreno di coltura MuSC/Myoblast per risospendere le cellule e seminare le cellule in una normale piastra di plastica di 10 cm. Durante questo periodo, i MuSC non possono attaccarsi al fondo della lastra e rimangono a galleggiare per lo più nel fluido.
    NOTA: Questa è la prima pre-placcatura su lastre di plastica.
19. Dopo 1,5 ore, agitare brevemente la piastra e trasferire il liquido in due piastre da 10 cm rivestite di collagene, ciascuna contenente 10 ml di coltura. Ora, i MuSC si attaccheranno e cresceranno sulle piastre rivestite di collagene. Cambia il supporto dopo 2 giorni. Le piastre rivestite di collagene vengono preparate come nei passaggi 1-4 di questa sezione.
20. Dopo un altro giorno, far passare le cellule: rimuovere il terreno, lavare le cellule una volta con 1x PBS e tripsinizzare le cellule.
21. Utilizzare i terreni di coltura MuSC/Myoblast per lavare le cellule dalle piastre, spostare le cellule su una nuova piastra di plastica e incubare nell'incubatore cellulare per 40 minuti.
    NOTA: Questa è la seconda pre-placcatura su piastre di plastica.
22. Versare la coltura in una nuova piastra di plastica e incubare nell'incubatore cellulare per altri 20 minuti.
    NOTA: Questa è la terza pre-placcatura su lastre di plastica.
23. Quindi dividere il surnatante nella piastra in 8 piastre da 10 cm rivestite di collagene per sottocoltivare le cellule. Il rapporto di passaggio qui è 2: 8 (1: 4). Dopo tre volte di pre-placcatura sopra descritte, i mioblasti possono raggiungere oltre il 90% di purezza. Pertanto, dopo questo punto, non è necessario pre-placcare quando si passa ulteriormente i mioblasti.

2. Preparazione di terreni di crescita MuSC/Myoblast (Esempio di preparazione da 5 topi)

1. Sacrifica 5 topi selvatici giovani e sani, isola la milza e sciacqua la milza una volta con 1x PBS (con penicillina/streptomicina).
2. Usa le forbici per rimuovere le parti scure/macchie sulla milza, se presenti. Scartare la milza se la maggior parte di essa è diventata nera.
3. Mettere tutte e 5 le milze in un colino da 40 μm sulla parte superiore di una provetta da 50 mL.
4. Aprire una confezione sterile di siringa da 1 mL, estrarre lo stantuffo ed eliminare il cilindro.
5. Nel colino da 40 μm, tenere il tappo di gomma e utilizzare l'appoggio per il pollice dello stantuffo per macinare e dissociare i tessuti della milza in singole cellule. Fare attenzione a non toccare e contaminare l'appoggio del pollice dello stantuffo quando si strappa la confezione della siringa.
6. Durante la macinazione della milza, utilizzare occasionalmente 1x PBS per lavare via le cellule dissociate della milza nel tubo da 50 ml sotto il colino.
7. Dopo che tutte le cellule della milza sono state lavate nella provetta da 50 mL attraverso il colino, centrifugare la provetta a 500 x g per 10 minuti.
8. Utilizzare 1 mL di 1x tampone per lisi dei globuli rossi per risospendere il pellet. Lisi i globuli rossi per ~1 min.
   NOTA: 10 tamponi per lisi dei globuli rossi contengono 155 mM di NH₄Cl, 10 mM di NaHCO₃ e 1 mM di sale disodico EDTA in ddH₂O. Filtrare per sterilizzare e non sterilizzare in autoclave. Diluire con ddH₂O a 1 volta prima dell'uso.
9. Riempire la provetta da 50 ml con 1x PBS per interrompere il processo di lisi dei globuli rossi.
10. Filtrare nuovamente la sospensione cellulare con un colino da 40 μm, quindi centrifugare a 500 x g per 10 minuti.
11. Risospendere le cellule con 2 mL di terreno completo RPMI-1640 (terreno RPMI-1640 con FBS al 10% e penicillina/streptomicina) con pipettaggio molto delicato.
12. Aggiungere altro supporto completo RPMI-1640 nel tubo e mescolare bene. Distribuire la sospensione cellulare in dieci matracci di coltura T75. Il volume di coltura finale in ciascun pallone di coltura T75 deve essere di 20 ml.
13. Aggiungere 10 μl di stock di Concanavalin-A in ciascun pallone di coltura T75 e mescolare bene. La concanavalina-A attiva la proliferazione delle cellule T.
    NOTA: La riserva di Concanavalin-A è di 4 mg/mL ed è preparata sciogliendo Concanavalin-A in 1x PBS. Qui viene utilizzata la Concanavalin-A stessa, e non confonderla con le perle di Concanavalin-A utilizzate successivamente nei saggi CUT&Tag.
14. Dopo 48 ore, integrare ogni matraccio T75 con altri 20 mL di terreno completo RPMI-1640 in modo che il volume totale raggiunga i 40 mL.
15. Altre 24 ore dopo, raccogliere tutta la coltura in ogni pallone T75 e centrifugare a 600 x g per 3 minuti.
16. Il surnatante è un terreno condizionale con cellule T e può essere conservato a una temperatura compresa tra -20 °C e -80 °C per un massimo di 2 mesi. Scartare i pellet di milza. Prima dell'uso, scongelare il terreno condizionale con le cellule T e sterilizzare ulteriormente il terreno utilizzando un filtro da 0,22 μm.
17. Per rendere il terreno F10 completo di Ham, aggiungere 100 mL di FBS, 300 μL di bFGF e 6 mL di penicillina/streptomicina in 500 mL di terreno F10 di Ham.
    NOTA: il bFGF è di 5 μg/mL ed è preparato sciogliendo il bFGF nel terreno F10 di Ham.
18. Miscelare il terreno pieno F10 del prosciutto con il terreno condizionale filtrato con cellule T descritto sopra in rapporto 1:1 per ottenere un terreno di crescita MuSC/Myoblast.

3. CUT&Tag con mioblasti (Esempio di 3 reazioni CUT&Tag)

1. Preparazione dei reagenti chiave
   1. Purificare la trasposisi pA/G-Tn5 internamente da coltura batterica utilizzando il metodo^{pubblicato 14}. Questo enzima raggiunge la sua forma funzionale solo fino a quando non viene montato con adattatori per DNA che creano librerie. Ancora più importante, pA/G-Tn5 è disponibile in commercio da molte fonti.
   2. Gli oligo per realizzare gli adattatori sono mostrati nella Tabella 1. In particolare, ricottura Oligo-Rev con Oligo-A e Oligo-B, rispettivamente, per produrre di conseguenza l'Adattatore-A e l'Adattatore-B a doppio filamento. I dettagli per la ricottura per realizzare gli adattatori possono essere trovati altrove¹⁴.
   3. Incubare l'Adaptor-A e l'Adaptor-B con la trasposisi pA/G-Tn5 a temperatura ambiente (RT) per 2 h. Quindi, questa trasposisi prenderà la sua forma funzionale. Nelle sezioni seguenti di questo manoscritto, la forma funzionale di pA/G-Tn5 sarà chiamata pA/G-Tn5a.
      NOTA: Se il pA/G-Tn5 viene acquistato invece di essere prodotto internamente, assicurati di chiarire se l'articolo acquistato è pA/G-Tn5 montato con adattatori (in altre parole, pronto per l'uso) o è solo l'enzima pA/G-Tn5 stesso. Se si tratta solo dell'enzima, preparare i due adattatori sopra descritti e montarli sul pA/G-Tn5 prima di utilizzare definitivamente questo enzima per CUT&Tag.
   4. Per le ricette del buffer di legatura, del buffer di lavaggio, del buffer di scavo-lavaggio, del buffer 300-Dig e del buffer di tagmentazione, i lettori possono anche fare riferimento a Kaya-Okur et ^al.1.
   5. Preparare il tampone di legame, che contiene 20 mM di HEPES pH 7,5, 10 mM di KCl, 1 mM di CaCl₂ e 1 mM di MnCl₂.
   6. Preparare il tampone Wash, che contiene 20 mM di HEPES pH 7,5, 150 mM di NaCl, 0,5 mM di spermidina e 1 cocktail di inibitori della proteasi.
   7. Preparare la digitonina come riserva concentrata in DMSO, quindi preparare il tampone Dig-wash aggiungendo digitonina nel tampone Wash a una concentrazione di 0,5 mg/mL.
   8. Preparare il tampone anticorpale aggiungendo EDTA a una concentrazione di 2 mM e BSA a una concentrazione dello 0,1% nel tampone Dig-wash.
   9. Preparare un tampone 300-Dig contenente 20 mM di HEPES pH 7,5, 300 mM di NaCl, 0,5 mM di spermidina, 1x cocktail di inibitori della proteasi e 0,1-0,5 mg/mL di digitonina.
   10. Preparare il tampone di tagmentazione integrando il tampone 300-Dig con 10 mM di MgCl₂. MgCl₂ può attivare l'attività enzimatica di pA/G-Tn5a.
       NOTA: Le informazioni relative ad altri materiali sono fornite nel file della Tabella dei materiali .
2. Attivazione della perlina Concanavalin-A
   1. Miscelare 30 μl di perle di concanavalina-A (10 μl per ogni reazione) in 300 μl di tampone legante in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Capovolgere più volte per amalgamare bene. Mettere la provetta su una rastrelliera magnetica. Dopo che il liquido è limpido, rimuovere il surnatante.
   2. Rimuovere la provetta dal rack magnetico, aggiungere 300 μl di tampone legante nella provetta, mescolare bene e dividere uniformemente in 3 provette con una striscia di provette 8-PCR. Designare ogni tubo con una reazione CUT&Tag.
   3. Metti la striscia della provetta 8-PCR su una griglia magnetica e attendi che il liquido sia limpido.
   4. Aspirare il surnatante e rimuovere le provette dalla rastrelliera magnetica. Aggiungere 10 μl di tampone legante in ciascuna provetta e mescolare bene. Mettere le perle preparate sul ghiaccio o a 4 °C fino a quando le celle sono pronte per procedere.
3. Legare le cellule alle perle di Concanavalin-A
   1. Tripsinizzare i mioblasti di topo in coltura dalle piastre, lavare le cellule una volta con RT 1x PBS e infine risospendere le cellule nel tampone di lavaggio a RT. Evitare l'eccessiva tripsinizzazione, in quanto ciò può compromettere l'affinità della membrana cellulare con le perle di Concanavalina-A.
   2. Regolare la densità cellulare a circa 7 x 10⁵ cellule/mL nel tampone Wash in modo tale che 100 μL di sospensione cellulare contengano circa 70.000 cellule, sufficienti per una reazione CUT&Tag.
   3. Pipettare 100 μl della sospensione cellulare in ciascuna provetta della striscia di provette 8-PCR, che contiene già 10 μl di perle di Concanavalin-A preparate. Mescolare bene e incubare su un agitatore a "movimento altalenante" per 10 minuti a RT.
   4. Metti la striscia della provetta 8-PCR su una rastrelliera magnetica. Attendi che si schiarisca e rimuovi il surnatante.
   5. Per valutare se le perle di Concanavalin-A hanno sequestrato in modo efficiente le cellule, controllare il surnatante al microscopio per vedere quante cellule sono rimaste nel surnatante. Dopo la fase di legame della perlina di Concanavalin-A, si dovrebbero osservare pochissime o nessuna cellula nel surnatante.
4. Incubazione delle cellule con un anticorpo primario
   1. Per ogni campione, diluire 1 μL di anticorpo H3K4me1 in 50 μL di tampone anticorpale e aggiungere l'anticorpo diluito in ciascuna provetta. Mescolare bene le perle con l'anticorpo diluito capovolgendo più volte i tubi. Mettere i campioni sull'agitatore "movimento altalena" per incubare a 4 °C per una notte.
      NOTA: Come menzionato dal Dr. Steven Henikoff¹, non è stato necessario utilizzare un controllo IgG negativo in tutti i test CUT&Tag. Rispetto ai ChIP, i saggi CUT&Tag sono dotati di un segnale di fondo molto più basso o nullo. Pertanto, l'utilizzo di IgG per eseguire un test CUT&Tag di "controllo negativo" non introduce alcuna informazione utile. Al contrario, l'utilizzo di un anticorpo convalidato da CUT&Tag per eseguire un controllo positivo è importante per valutare se il test CUT&Tag ha funzionato.
5. Incubazione delle cellule con un anticorpo secondario
   1. Il giorno successivo mattina, metti i campioni sul rack magnetico e attendi che i campioni siano chiari.
   2. Rimuovere il surnatante, che è l'anticorpo primario. Non è necessario lavare le perline; Aggiungere direttamente 50 μl di anticorpo secondario diluito (1:100) in ciascuna provetta del campione.
      NOTA: L'anticorpo secondario viene diluito con tampone Dig-wash in rapporto 1:100. Per consentire un riconoscimento più efficiente di pA/G-Tn5a, gli anticorpi secondari non devono essere coniugati con molecole o gruppi come HRP, biotina o fluorofori.
   3. Mescolare bene e incubare sull'agitatore "altalena" a RT per 1 ora.
   4. Rimettere i campioni sul rack magnetico, attendere che i campioni siano chiari e gettare il surnatante.
   5. Aggiungere 200 μl di tampone Dig-wash in ciascuna provetta e capovolgere più volte per eliminare gli anticorpi in eccesso.
   6. Rimettilo sulla rastrelliera magnetica, attendi che si schiarisca e rimuovi il surnatante. Ripetere questo lavaggio altre due volte per rimuovere completamente gli anticorpi non legati in eccesso.
6. Incubazione delle cellule con pA/G-Tn5a
   1. Dopo l'ultimo lavaggio, mettere i campioni sulla rastrelliera magnetica, attendere che i campioni siano chiari e rimuovere tutto il liquido nella provetta. Per ogni provetta del campione, aggiungere 100 μL di tampone 300-Dig contenente pA/G-Tn5a a 0,04 μM. Mescolare bene e incubare sull'agitatore di movimento a dondolo per 1 ora a RT.
   2. Metti la rastrelliera magnetica. Attendere che i campioni si chiariscano e rimuovere il surnatante.
   3. Aggiungere 200 μl di tampone 300-Dig in ciascun campione, mescolare bene e posizionare sull'agitatore per lavare il campione per 3 minuti a RT.
   4. Metti la rastrelliera magnetica. Attendere che i campioni si chiariscano e rimuovere il surnatante. Ripetere questo lavaggio altre due volte per rimuovere l'eccesso di pA/G-Tn5a e abbassare lo sfondo.
7. Scissione e tagmentazione dei genomi
   1. Dopo l'ultimo lavaggio, posizionare i campioni sul rack magnetico e pipettare accuratamente il liquido dalla provetta. Per ogni campione, aggiungere 50 μl di tampone di tagmentazione. Mescolare bene e incubare in una macchina per PCR a 37 °C per 1 ora. Non utilizzare la funzione di riscaldamento del coperchio della macchina PCR.
      NOTA: Opzionalmente, a causa dell'usura del materiale durante la successiva fase di purificazione del DNA genomico, è possibile aggiungere alcuni DNA spike-in nel buffer di tagmentazione in modo che lo spike-in venga visualizzato nei risultati finali del sequenziamento e possa essere utilizzato per normalizzare i dati. Il metodo per preparare e utilizzare il DNA spike-in può essere trovato altrove¹⁴.
8. Purificazione totale del DNA genomico
   1. Dopo l'etichettatura, aggiungere altri 150 μL di tampone di tagmentazione per ogni campione. Il volume totale è ora di 200 μl.
   2. Quindi, per ogni campione, aggiungere 10 μL di EDTA 0,5 M, 3 μL di SDS al 10% e 2,5 μL di proteinasi K. Vortex da 20 mg/mL per miscelare bene e incubare a 55^°C per 2 ore.
   3. Pipettare ogni campione in 200 μL di fenolo/cloroformio in una provetta da centrifuga da 1,5 mL e vorticare per 10 s. Centrifugare a 18.000 x g per 5 min. Trasferire lo strato superiore in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 mL.
   4. Aggiungere 200 μl di cloroformio in ciascuna provetta e agitare per 10 s. Centrifugare a 18.000 x g per 5 min.
   5. Aspirare lo strato superiore in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 mL. Quindi, per ogni campione, aggiungere 550 μL di etanolo al 100% per far precipitare il DNA a -80 °C per 1 ora. Per visualizzare meglio il pellet di DNA, aggiungere 1 μL di 20 mg/mL di glicogeno.
   6. Centrifugare alla massima velocità (>18.000 x g) per 15 minuti per pellettare il DNA.
   7. Versare con cura il surnatante, lavare una volta il pellet di glicogeno/DNA con etanolo al 75% e centrifugare nuovamente alla massima velocità per 5 minuti.
   8. Rimuovere l'etanolo al 75% e risospendere il pellet di glicogeno/DNA con 21 μL di ddH₂O.
9. Preparazione e sequenziamento della libreria
   1. Impostare la PCR per la preparazione della libreria. Per indicizzare i campioni da sequenziare insieme, utilizzare un primer Illumina N7XX diverso per ogni campione e un primer Illumina N5XX universale. Se si indicizzano più di 12 campioni, saranno necessari anche diversi primer N5XX Illumina. Illumina fornisce dodici primer N7XX e otto primer N5XX, quindi il numero totale di combinazioni N7XX con N5XX è 12 x 8 = 96. La configurazione della reazione PCR è mostrata nella Tabella 2.
   2. Determinare approssimativamente il numero del ciclo PCR nella PCR che prepara la libreria in base al numero di cellule utilizzato nel test CUT&Tag. Normalmente, per un test CUT&Tag che utilizza 50.000-100.000 cellule, 9-12 cicli sono abbastanza sufficienti e un numero di cellule compreso tra 10.000 e 50.000 potrebbe richiedere fino a 14 cicli. Il programma PCR è visualizzato nella Tabella 3.
      NOTA: Per la maggior parte dei test CUT&Tag, se l'anticorpo ha funzionato correttamente, un numero di ciclo PCR compreso tra 9 e 14 dovrebbe sempre generare una libreria utile per il sequenziamento. Una buona libreria è normalmente di 10-50 ng/μL (determinata dal saggio Qubit) in concentrazione e 20-30 μL in volume. Al contrario, se l'anticorpo non ha funzionato in modo efficiente e specifico, il semplice aumento del numero di cicli non può salvare gli esperimenti. Un numero eccessivo di cicli non giova affatto ai risultati e introduce invece più duplicati PCR, che in seguito complicheranno l'analisi dei dati.
   3. Utilizzare alcune perle di purificazione/selezione delle dimensioni del DNA disponibili in commercio per purificare il DNA della libreria e selezionare il DNA delle dimensioni desiderabili.
   4. Diluire una piccola aliquota della libreria purificata con acqua e utilizzarla per la qPCR con primer locus-specifici per controllare gli arricchimenti come negli esperimenti ChIP-qPCR. Prima di sequenziare la libreria, questo può aiutare a determinare se il CUT&Tag ha funzionato.
   5. Eseguire il sequenziamento e l'analisi dei dati secondo le istruzioni del produttore.
      NOTA: I kit CUT&Tag sono disponibili in commercio presso una manciata di aziende e un esempio può essere trovato nel file Table of Materials .

Risultati

Prima di legare le cellule alle perle di Concanavalin-A, controllare la sospensione cellulare al microscopio. Di conseguenza, dopo aver incubato le cellule con le perle di Concanavalin-A, mettere le provette del campione sul rack magnetico e il surnatante deve essere nuovamente osservato al microscopio. Questo serve a valutare l'efficienza con cui le cellule sono state catturate dalle perle di Concanavalina-A. Il tampone di lavaggio contenente 7 x 10⁵ cellule/mL dovrebbe apparire come la Figura 1A al microscopio. Al contrario, la Figura 1B mostra il surnatante dopo il legame delle perle di Concanavalina-A, dove le perle hanno portato via tutte le cellule. Non ha senso procedere con le fasi successive di CUT&Tag se le perle di Concanavalin-A non hanno nemmeno catturato le cellule in modo efficiente. Il tampone di lavaggio non deve contenere alcun contenuto sierico o EDTA/EGTA, in quanto possono abolire il legame della membrana cellulare alle perle di Concanavalin-A. L'albumina sierica bovina, tuttavia, non interferisce con il legame della concanavalina-A alle cellule.

Dopo aver realizzato le librerie CUT&Tag mediante PCR, una piccola aliquota della libreria (3-4 μL) può essere elettroforesata su un gel di agarosio all'1,2-1,5% per verificare se la libreria è buona. La Figura 2 mostra l'esempio delle librerie CUT&Tag H3K4me1 che abbiamo realizzato. In un segno istonico o variante istonica CUT&Tag, la maggior parte delle unità scisse sono apparentemente mononucleosomi, sebbene due nucleosomi possano anche essere tagliati insieme. Tre nucleosomi tagliati e marcati insieme sarebbero molto rari. Pertanto, un array di nucleosomi contenente mononucleosomi, dinucleosomi e pochissimi trinucleosomi dovrebbe essere osservato nell'elettroforesi delle librerie CUT&Tag con marchio istonico. I nucleosomi contengono 147 bp di DNA, ma con gli adattatori di sequenziamento aggiunti dalla trasposasi Tn5 e dalla PCR di libreria, la dimensione totale di un mononucleosoma CUT&Tagged dovrebbe arrivare a 300 bp, come mostrato nella Figura 2.

Prima di spendere soldi per il sequenziamento ad alto rendimento delle librerie CUT&Tag, un altro metodo di controllo della qualità consiste nell'eseguire la qPCR con primer locus-specifici. Ciò equivale all'esecuzione di ChIP-qPCR. Inoltre, i primer locus-specific di CUT&Tag qPCR sono progettati sulla base degli stessi principi dei primer ChIP-qPCR. La Figura 3 mostra l'amplificazione qPCR di diverse posizioni sul locus del gene Myod1. Myod1 codifica per il fattore di trascrizione principale, MyoD, che determina la linea muscolare scheletrica durante la miogenesi¹⁵. Come mostrato nella Figura 3, H3K4me1 è altamente arricchito nel core enhancer (CER) e nella regione regolatoria distale (DRR) del locus Myod1. CER e DRR sono regioni enhancer molto consolidate per Myod1¹⁶. Ciò è coerente con il fenotipo ben documentato che H3K4me1 contrassegna specificamente gli enhancer commissionati¹⁷. Inoltre, la Figura 3 mostra che il livello di H3K4me1 è molto basso nella regione regolatoria prossimale (PRR) perché i nucleosomi nella regione prossimale dei promotori attivi sono normalmente modificati con H3K4me3¹⁸ invece di H3K4me1. Tutte le coppie di primer per questi loci valutati sono state precedentemente pubblicate^19,20 e le sequenze possono essere trovate nella Tabella 4. Normalmente, dopo i controlli di qualità mediante elettroforesi del DNA di libreria e qPCR su loci specifici, i ricercatori saranno sicuri di procedere con il sequenziamento.

Figura 1: Mioblasti risospesi nel buffer di lavaggio. Viste microscopiche prese (A) prima e (B) dopo il legame della perlina Concanavalin-A. Il pannello B mostra che non ci sono quasi più cellule nella sospensione dopo l'incubazione delle perle di Concanavalin-A, indicando che le cellule sono state catturate in modo efficiente dalle perle. Le piccole particelle nel pannello B sono probabilmente le perle di Concanavalin-A in eccesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Elettroforesi delle librerie CUT&Tag. Sono stati eseguiti tre saggi CUT&Tag H3K4me1 indipendenti, ciascuno dei quali è stato trasformato in una libreria di sequenziamento utilizzando i primer Illumina e la PCR. Ogni H3K4me1 CUT&Tag ha utilizzato 70.000 mioblasti di topo. Le librerie contengono per lo più mononucleosomi marcati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: amplificazione qPCR di diverse posizioni sul locus del gene Myod1 . La qPCR mostra che nei mioblasti di topo, il marchio H3K4me1 è altamente arricchito nelle regioni di potenziamento del gene Myod1 , il che è in linea con le conclusioni pubblicate. CER e DRR sono enhancer pubblicati di Myod1 che si trovano a monte del promotore di Myod1 . Si noti che il PRR non ha accumulo di H3K4me1, e questo è anche coerente con il fatto che i promotori attivi sono principalmente marcati con H3K4me3. Gli arricchimenti sono stati calcolati normalizzando l'arricchimento di H3K4me1 sul "deserto genico" del campione "Repeat 1". Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nome	Sequenze (5'-3'):
Oligo-Rev	fos-CTGTCTCTTATACACATCT
Oligo-A	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGACAG
Oligo-B	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG

Tabella 1: Sequenze oligo per la realizzazione dell'Adattatore-A e dell'Adattatore-B da montare sulla trasposasi pA/G-Tn5.

Frazione	Volume
DNA genomico purificato dopo la reazione CUT&Tag	21 μl
Primer N5XX (10 μM)	2 μl
Primer N7XX (10 μM)	2 μl
NEBNext Master Mix PCR 2× ad alta fedeltà	25 μl
	Totale 50 μl

Tabella 2: Impostazione della PCR per la preparazione della libreria CUT&Tag utilizzando i primer di indicizzazione Illumina. Se si utilizza un kit CUT&Tag commerciale che contiene reagenti per PCR di libreria come la miscela di DNA polimerasi, seguire il manuale specifico di tale kit per configurare la PCR di libreria.

Passo	Temperatura	Ore	Numero di ciclo
1	72 oC	3 minuti	1
2	95 oC	3 minuti	1
3	98 oC	10 secondi	Da 9 a 14 anni
4	60 oC	5 s, quindi vai al passaggio 3
5	72 oC	1 minuto	1
6	4 oC	tenere	N/A

Tabella 3: Programma PCR per la preparazione della libreria CUT&Tag utilizzando i primer di indicizzazione Illumina.

Ubicazione	Sequenze di primer (5'-3')
CER	Per: GGG CAT TTA TGG GTC TTC CT
	Rev: CTC ATG CCT GGT GTT TAG GG
-15,000	Per: TGC CCA GAG CCT AGA ATC AT
	Revisione: TCA TGC ATC CTT GCT GGA TA
-7,000	Per: GGC ATG GGA GGT TTA TAG CA
	Revisione: ATG CCA CTA TGC AAT CCA CA
DRR	Per: TCA GGA CCA GGA CCA TGT CT
	Revisione: CTG GAC CTG TGG CCT CTT AC
PRR	Per: BAVAGLIO TAG ACA CTG BAVAGLIO AGG CTT GG
	Rev: GAA AGC AGT CGT GTC CTG GG
CDS1	Per: CAT CTG ACA CTG GAG TCG CTT TG
	Rev: CAA GCA ACA CTC CTT GTC ATC AC
CDS2	Per: GTG AGC CTT GCA CAC CTA AGC C
	Oggetto: GTT GCA CTA CAC AGC ATG CCT G
Potenziatore di IgH	Per: ACC CTG GGA AGA CCA TAC TTA ATC T
	Revisione: CCA TCC ACA CTC GTG CCT TA
Deserto genetico	Per: TCC TCC CCA TCT GTG TCA TC
	Rev: GGA TCC ATC ACC ATC AAT AAC C

Tabella 4: Primer specifici per il locus per testare l'arricchimento di H3K4me1 in diverse posizioni sul gene Myod1 .

Discussione

Il numero di cellule specifico richiesto in una determinata reazione CUT&Tag si basa completamente sull'arricchimento dei marcatori/varianti istoniche o delle proteine leganti la cromatina che devono essere testate. Normalmente per marcature istoniche molto arricchite come H3K4me1, H3K4me3 e H3K27ac ecc., 25.000-50.000 mioblasti sono abbastanza sufficienti per una reazione CUT&Tag. Tuttavia, alcune rare proteine leganti la cromatina potrebbero richiedere fino a 250.000 cellule. Il numero di cellule utilizzato nei saggi CUT&Tag è fondamentale e, se non gestito correttamente, causa normalmente il fallimento del test. L'uso di un numero eccessivo di cellule in una reazione CUT&Tag è dannoso, soprattutto quando si testano segni istonici molto arricchiti. Iniziare con troppe cellule significa che gli anticorpi assegnati sono insufficienti per ogni cellula. CUT&Tag non solo funziona con un numero di celle molto basso, ma può essere applicato a livello di cella singola¹.

Soprattutto, l'utilizzo di un anticorpo affidabile e convalidato con elevata affinità e specificità è sempre la chiave per il successo di un test CUT&Tag. Come i saggi ChIP, immunoprecipitazione (IP) e IF, CUT&Tag richiede anche il tipo di anticorpi in grado di riconoscere gli antigeni naturalmente ripiegati¹. Al contrario, gli anticorpi che riconoscono solo i peptidi rilassati nel Western blot dovrebbero essere rigorosamente evitati nel CUT&Tag.

Se l'ottimizzazione del numero di cellule o l'utilizzo di un anticorpo convalidato in immunofluorescenza o ben citato non sono ancora in grado di risolvere il problema dello scarso segnale in un test CUT&Tag, allora esamina se la proteina di interesse è una proteina associata alla cromatina che si lega debolmente o non si lega nemmeno direttamente al DNA. In questo caso, come accennato in precedenza, passa all'utilizzo di CUT&RUN invece di CUT&Tag. In alternativa, una leggera fissazione, come 5 minuti in paraformaldeide allo 0,5% (seguiti da 10 minuti di tempra in glicina 0,1 M), potrebbe essere un metodo che vale la pena testare. Tuttavia, poiché non abbiamo mai praticato la fissazione in nessun saggio CUT&Tag, né ci siamo nemmeno imbattuti nella necessità di fissare le cellule prima di eseguire CUT&Tag, non possiamo fare ulteriori commenti da parte nostra in merito alla reticolazione.

Comprendiamo che alcune versioni dei protocolli CUT&Tag potrebbero affermare che sia la RT (2 h) che i 4 °C (durante la notte) per la fase di incubazione degli anticorpi primari possono generare risultati decenti²¹. Tuttavia, si consiglia vivamente di utilizzare 4 °C (durante la notte) rispetto alla RT per 2 ore. D'altra parte, si sconsiglia di prolungare il tempo di incubazione per più di una notte.

Per quanto riguarda la sensibilità, il controllo dello sfondo e il grado di complessità da gestire per i ricercatori, CUT&Tag è superiore ai saggi ChIP. Se si devono mettere alcuni inconvenienti per CUT&Tag rispetto a ChIP, allora l'unico è che i protocolli CUT&Tag non includono un metodo di normalizzazione interno come l'utilizzo di "Input" in un test ChIP¹. Pertanto, quando si confrontano le altezze dei picchi tra i campioni utilizzando CUT&Tag, i ricercatori devono equalizzare il numero di cellule tra i campioni per cominciare. Inoltre, è fondamentale includere repliche tecniche.

Questo protocollo presenta tutti i dettagli dell'esecuzione di CUT&Tag nei mioblasti di topo, fornendo un esempio di successo di H3K4me1 CUT&Tag in questo tipo di cella. Il metodo qui descritto può essere applicato direttamente ai MuSC appena isolati senza alcuna modifica. Inoltre, gli esperimenti CUT&Tag su segni istonici, varianti istoniche o fattori di trascrizione in altri tipi di cellule possono essere condotti seguendo questo protocollo. Per i miotubi o le miofibre, i nuclei possono essere isolati per primi e il CUT&Tag può quindi essere eseguito sui mionuclei. Quando si fa questo, si possono trattare i nuclei nello stesso modo in cui le cellule vengono trattate in questo protocollo CUT&Tag. I miotubi e le miofibre sono cellule multinucleate e non abbiamo testato se i miotubi o le miofibre possano essere legati direttamente alle perle di Concanavalina-A, anche se ciò potrebbe essere fattibile.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
bFGF	R& D Systems	233-FB-025
Collagene	Corning	354236
Collagenasi II	Worthington	LS004177
Concanavalin-A	Sigma-Aldrich	C5275
Perline Concanavalin-A	Frangia Laboratori	BP531
Digitonin	Sigma-Aldrich	300410
Dispase II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Siero fetale bovino	Anticorpo Hyclone	SH30396.03
H3K4me1	abcam	ab8895
Mezzi F10 di prosciutto	Thermo Fisher Scientific	11550043
Universale iperattivo CUT& Kit di test per Illumina	Vazyme	TD903	Questo kit è stato testato da noi per funzionare bene
Rack magnetico per provette EP da 1,5 mL	Qualityard	QYM06
Rack magnetico per strisce di provette 8-PCR	Anosun Magnetic	CLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	NEB	M0541L	Per la reazione PCR per la creazione di librerie
pA-Tn5	Vazyme	S603-01	Deve essere montato con adattatori prima dell'uso
Cocktail di inibitori della proteasi	Sigma-Aldrich 5056489001
Proteinasi K	Beyotime	ST535-100mg
RPMI-1640 media	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Anticorpo secondario (IgG anti-coniglio della cavia)	Anticorpi-online	ABIN101961
Spermidina	Sigma-Aldrich	S2626
Kit di indice TruePrep V2 per Illumina	Vazyme	TD202	Questo kit fornisce i primer Illumina N7XX e N5XX
Perline pulite del DNA VAHTS	Vazyme	N411	Può sostituire le perline Ampure XP. Può purificare CUT& Etichettare le librerie e selezionare i frammenti di DNA in base alle dimensioni