Qui, presentiamo un protocollo per la creazione di un difetto di cavità scatolare nel tessuto della diafisi femorale di ratto. Questo modello è in grado di valutare le prestazioni dei biomateriali in condizioni di stress biomeccanico ed esplorare i meccanismi di rigenerazione ossea correlati all'osteogenesi intramembranosa.
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Articolo metodologico
Creazione di un modello di difetto della cavità scatolare nell'osso corticale del femore di ratto
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gravi difetti ossei o fratture complesse possono causare gravi complicazioni come la mancata unione o una guarigione ossea insufficiente. L'ingegneria tissutale, che prevede l'applicazione di cellule, scaffold e citochine, è considerata una soluzione promettente per la rigenerazione ossea. Di conseguenza, vari modelli animali che simulano i difetti ossei svolgono un ruolo cruciale nell'esplorazione del potenziale terapeutico dell'ingegneria tissutale per la guarigione ossea. In questo studio, abbiamo stabilito un modello di difetto osseo corticale a forma di scatola nel femore medio dei ratti, che potrebbe servire come modello ideale per valutare la funzione dei biomateriali nel promuovere la guarigione ossea. Questo difetto osseo corticale a forma di scatola è stato perforato utilizzando un manipolo orale a bassa velocità e modellato da un ago da tornio. L'analisi micro-TC post-operatoria è stata immediatamente condotta per confermare il successo dell'instaurazione del difetto osseo corticale della cavità scatolare. I femori sul lato operato dei ratti sono stati quindi raccolti in più punti temporali dopo l'intervento chirurgico (0 giorni, 2 settimane, 4 settimane e 6 settimane). Il processo di guarigione dell'area difettosa di ciascun campione è stato valutato utilizzando la micro-CT, la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) e la colorazione tricromica di Masson. Questi risultati hanno dimostrato un modello di guarigione coerente con l'ossificazione intramembranosa, con una guarigione sostanzialmente completa entro 6 settimane. La categorizzazione del processo di guarigione di questo modello animale fornisce un metodo efficace in vivo per lo studio di nuovi biomateriali e farmaci che mirano all'ossificazione intramembranosa durante la guarigione dei difetti del tessuto osseo.
Introduzione
L'osso fratturato e difettoso spesso deriva da traumi, tumori, infiammazioni e malformazioni congenite 1,2. Sebbene il tessuto osseo nei giovani individui sani possieda tipicamente robuste capacità rigenerative3, difetti che superano una dimensione critica o impedimenti di guarigione dovuti a malattie sistemiche (ad esempio, diabete, osteoporosi e infezioni) possono ancora portare a complicanze come discontinuità ossea o alterata guarigione4. Per affrontare questa sfida clinica, l'innesto osseo o i biomateriali sono comunemente usati per sostituire l'osso gravemente difettoso o per ricostruire grandi segmenti ossei. Tuttavia, questi trattamenti hanno dei limiti. Ad esempio, sebbene sia considerato il gold standard, l'innesto osseo autologo soffre di una fornitura limitata di donatori e di potenziali complicanze del sito donatore 5,6. Gli allotrapianti presentano anche alcuni rischi, come il rigetto immuno-mediato, la potenziale trasmissione di malattie e gli impatti negativi sulle proprietà biomeccaniche e biologiche del trapianto7.
Negli ultimi anni si è assistito a un'impennata della ricerca incentrata sui meccanismi di guarigione dei difetti ossei. L'uso di biomateriali alternativi e i progressi nell'ingegneria tissutale sono emersi come argomenti di primo piano nel campo della rigenerazione ossea8. Prima che questi biomateriali possano essere applicati alla terapia umana, devono essere testati in vitro e in vivo per garantirne l'efficacia e la sicurezza. Tuttavia, la ridotta complessità degli ambienti in vitro e l'assenza di risposte immunitarie e infiammatorie limitano la valutazione di vari biomateriali in vitro. Di conseguenza, è necessaria la creazione di modelli animali per vari tipi di difetti del tessuto osseo9. I modelli animali consentono la valutazione dei biomateriali in diverse condizioni di carico, facilitano la comprensione delle caratteristiche ossee specie-specifiche e forniscono informazioni sulla somiglianza tra i modelli animali e le situazioni cliniche umane. Questi vantaggi sono essenziali per studiare le interazioni tra impalcatura ossea e tradurre i risultati della ricerca nella pratica clinica 9,10.
Attualmente, i modelli animali di difetti ossei meccanici sono ampiamente utilizzati per convalidare le prestazioni dei biomateriali, con i modelli di difetti ossei cranici e i modelli di difetti ossei segmentali che sono i metodi più comunemente applicati11. I modelli di difetto osseo segmentale, spesso utilizzati per imitare gravi traumi ossei lunghi o tibiali che terminano con la mancata unione ossea, sono vantaggiosi grazie alle loro dimensioni uniformi e alle posizioni anatomiche definite, semplificando le valutazioni radiologiche o istologiche della formazione di nuovo osso e della rivascolarizzazione. Tuttavia, questi modelli richiedono impianti metallici per stabilizzare i segmenti di frattura bilaterale e richiedono un complesso processo di guarigione che coinvolge sia l'ossificazione endocondrale che quella intramembranosa12. D'altra parte, i modelli di difetti ossei calvari sono diventati uno strumento di screening primario per la valutazione dei biomateriali grazie ai loro diametri standardizzati dei difetti, al comodo accesso chirurgico e alla funzione di supporto della dura madre e dei tessuti molli13. Sebbene siano ampiamente utilizzati per modellare la formazione di osso intramembranoso in scenari clinicamente rilevanti, non sono adatti per valutare la guarigione ossea in condizioni di carico biomeccanico a causa della loro natura non portante durante il processo di guarigione14.
Per affrontare queste limitazioni, abbiamo stabilito un modello di difetto osseo corticale a cavità scatolare nel tessuto della diafisi femorale dei ratti. Utilizzando la micro-tomografia computerizzata (TC), la ricostruzione tridimensionale (3D) e la colorazione istopatologica (ematossilina ed eosina [HE] e Masson), abbiamo analizzato il processo di guarigione di questo modello in condizioni di emostasi. Il nostro obiettivo è quello di offrire nuove intuizioni per valutare le prestazioni dei biomateriali in condizioni di carico biomeccanico e per studiare la bioingegneria e il meccanismo della rigenerazione ossea rispetto all'ossificazione intramembranosa.
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Protocollo
Tutte le procedure sugli animali in questo studio sono state esaminate e approvate dal Comitato etico della West China School of Stomatology, Sichuan University (WCHSIRB-D-2021-597). Per il presente studio sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley (maschio, peso corporeo 300 g).
1. Preparazione prechirurgica
- Preparazione dello strumento
- Fare riferimento alla Figura 1A per gli strumenti chirurgici utilizzati in questo studio: rasoio elettrico, forbici per tessuti, forbici oftalmiche, pinze oftalmiche, bisturi monouso, separatore periostale, manipolo orale a bassa velocità, sonda orale, aspiratore per irrigazione monouso, porta aghi, sutura 3.0.
- Preparare una sonda orale e contrassegnare l'estremità curva grande della sonda con un pennarello in base al diametro del difetto (Figura 1B). Utilizzare questo per determinare la dimensione del difetto durante l'intervento chirurgico.
- Sterilizzare tutti i materiali chirurgici e gli strumenti utilizzati per eseguire la procedura prima dell'uso. Imballare i materiali desiderati in un panno piegato o in carta da imballaggio e sigillarli con nastro adesivo per autoclave per sterilizzazione a vapore (125-135°C per 20-25 min).
- Preparazione dell'area chirurgica: disinfettare il tavolo operatorio e l'ambiente intorno al tavolo spruzzando con alcol al 75%. Creare un'area sterile di circa 60 cm x 90 cm con teli autoclavati sul tavolo operatorio.
- Preparazione all'anestesia
- Anestetizzare i ratti per via intraperitoneale con ketamina cloridrato al 10% (50-100 mg/kg) e xilazina al 2% 2 mg/kg). Utilizzare l'iniezione sottocutanea di carprofene (5 mg/kg) per l'analgesia preoperatoria e intraoperatoria. Esaminare la profondità dell'anestesia mediante il test di pizzicamento delle dita dei piedi. Dopo l'anestesia, applicare un unguento sterile sugli occhi per prevenire secchezza oculare e lesioni corneali.
2. Procedura chirurgica
- Posizionare il ratto in posizione decubita laterale sul tavolo chirurgico sterile e rimuovere i peli degli arti inferiori con un rasoio elettrico.
- Utilizzare una soluzione di iodoforo al 5% e alcol al 75% per disinfettare il tessuto cutaneo nell'area chirurgica.
- Localizzare il femore prossimale e distale e praticare un'incisione di 2,5 cm lungo l'asse lungo del femore per tagliare il tessuto cutaneo del ratto.
- Separare lo strato cutaneo dalla fascia con una pinza oftalmica e forbici per tessuti ed esporre l'approccio laterale al femore attraverso il bicipite femorale e i muscoli femorali laterali.
- Individuare l'intersezione dei due setti muscolari (una linea di tessuto bianco) e separare con cura con una lama chirurgica monouso lungo il bordo muscolare fino a raggiungere la superficie femorale.
NOTA: Quando si utilizza una lama usa e getta per separare il muscolo, è importante separare lungo il setto muscolare e fare attenzione a non causare lesioni vascolari all'interno dei tessuti molli. I principianti e coloro che non hanno familiarità con l'anatomia devono utilizzare pinze oftalmiche e separatori periostali nella dissezione smussata tra le due masse muscolari.
- Applicare un separatore periostale per separare bruscamente i muscoli della superficie femorale ed esporre il centro della diafisi femorale.
- Utilizzare un pennarello sterile per contrassegnare l'area del sito del difetto sulla superficie mediana della diafisi femorale, situata nella parte superiore della cresta obliqua laterale di 1/3 della testa del femore.
- Utilizzare il manipolo orale a bassa velocità con un trapano a sfera al rallentatore di 1,2 mm di diametro per praticare un piccolo foro perpendicolare alla superficie ossea nel sito contrassegnato, distruggendo il periostio e la corteccia ossea con una profondità sufficiente a raggiungere la cavità del midollo osseo. A questo livello di profondità di foratura, espandere la dimensione del foro parallelamente a questa profondità in tutte le direzioni, tagliando per ottenere una forma a cavità scatolata.
- Utilizzare una sonda orale marcata parallela al bordo del difetto per determinare il diametro e la morfologia del difetto durante e dopo la preparazione.
- Chiudere gli strati muscolari e cutanei con suture riassorbibili in monofilamento 3-0, rispettivamente, e disinfettare l'area chirurgica con iodoforo al 5% dall'interno verso l'esterno.
3. Assistenza post-operatoria
- Dopo l'intervento chirurgico, somministrare carprofene (5 mg/kg) per via sottocutanea e mettere il ratto su un termoforo a temperatura costante fino al recupero dall'anestesia. Quando il ratto riprende conoscenza, spostalo delicatamente in una gabbia che contiene lettiera asciutta e autoclavata.
- Continuare l'analgesia per 24 ore e il monitoraggio post-operatorio per 1 settimana dopo l'intervento.
4. Raccolta e analisi dei campioni
- Sopprimere umanamente il ratto dopo l'intervento chirurgico iniettando pentobarbital sodico 100-200 mg/kg per via intraperitoneale. Separare con cura il tessuto muscolare e fasciale sulla superficie del femore e rimuovere completamente il femore sul lato operato. Raccogliere i campioni a 0 giorni (Figura 2A, B), 2 settimane, 4 settimane e 6 settimane dopo l'intervento.
- Fissare i campioni femorali in paraformaldeide al 4% per 24 ore. Analizzare la struttura del femore utilizzando la micro-tomografia computerizzata. Impostare i parametri di scansione come segue: potenziale del tubo a raggi X, 70 kVp; filtro, AL 0,5 mm; Intensità dei raggi X, 0,2 mA; dimensione del voxel, 17 μm; e tempo di integrazione, da 1 × 300 ms. Ricostruisci le immagini del modello 3D utilizzando dati bitmap.
- Decalcificare i campioni in EDTA al 10% per 8 settimane prima di disidratare i campioni femorali in una serie graduale di diluizioni di etanolo. Quindi, incorporare i campioni nella cera di paraffina15.
- Tagliare i campioni incorporati in sezioni di paraffina da 5 μm dal piano sagittale.
- Colora le sezioni con un kit di colorazione ematossilina ed eosina (H&E) e un kit di colorazione Masson. Osservare la guarigione dell'area difettosa mediante istopatologia.
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Risultati
In questo protocollo, abbiamo stabilito con successo un modello di difetto della cavità della scatola femorale di ratto con dimensioni di 4,5 mm x 1,5 mm mediante perforazione. Al fine di analizzare il processo di guarigione, abbiamo raccolto il tessuto femorale sul lato operato a 0 giorni, 2 settimane, 4 settimane e 6 settimane dopo l'intervento chirurgico, che sono i punti temporali chiave dell'ossificazione endocondrale, dell'ossificazione intramembranosa e del rimodellamento osseo dur...
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Discussione
I modelli animali preclinici sono fondamentali per esaminare la guarigione ossea e l'influenza dei biomateriali sulla rigenerazione ossea. Questo protocollo illustra un modello di difetto della cavità scatolare femorale che replica il processo di formazione dell'osso intramembranoso associato alla rigenerazione ossea clinica. L'area del difetto è stata standardizzata intraoperatoriamente utilizzando una sonda orale premarcata. I risultati della micro-TC e della colorazione istopatologica hanno mostrato una guarigione pro...
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Dichiarazioni
Tutti i dati e le immagini originali sono inclusi in questo documento. Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse
Ringraziamenti
Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China 82101000 (H. W.), U21A20368 (L. Y.) e 82100982 (F. L.) e supportato dal Sichuan Science and Technology Program 2023NSFSC1499 (H. W.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Trapano a sfera a bassa velocità da 1,2 mm | Dreybird Medical Equipment Co., Ltd. | RA3-012 | Per la preparazione di difetti della cavità della scatola |
| 3.0 sutura | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Nessuno | Per ferite da sutura |
| 4% paraformaldeide | Biosharp | BL539A | Per fissare i campioni femorali |
| Palle di cotone | Haishi Hainuo Group Co., Ltd. | 20120047 | Per la sterilizzazione della pelle e la pulizia del campo chirurgico |
| Bastoncini di cotone | Lakong Medical Devices Co., Ltd. | M6500R | Per la disinfezione della pelle |
| Rettificatrice per odontotecnico | Marathon | N3-140232 | Per la preparazione di difetti della cavità della scatola |
| Bisturi monouso | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd. | 20100227 | Per la creazione di incisioni cutanee e per separare nettamente il tessuto muscolare |
| Rasoio elettrico | JASE | BM320210 | Rimozione del tessuto pilifero dall'area chirurgica |
| per macchie di ematossilina ed eosina | Biosharp | C1005 | Per l'analisi istologica dei campioni |
| Masson' s Kit Macchia Tricromica | Solarbio | G1340 | Per l'analisi istologica dei campioni |
| Micro CT | Scanco medical ag | µ CT 45 | Per l'analisi della guarigione di difetti in campioni femorali |
| Porta ago | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Nessuno | Per aghi che tengono la sutura Sistema di |
| scansione per vetrini interi Olympus Research Grade VS200 | Chengdu Knowledge Technology Co. | VS200 | Per l'analisi dei risultati della colorazione HE e della colorazione Masson |
| Pinze oftalmiche | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Nessuno | Per il serraggio della pelle, del tessuto muscolare |
| Forbici oftalmiche | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Nessuno | Per la formazione di un approccio all'incisione cutanea |
| Manipolo orale a bassa velocità | Marathon | Y221101003 | Per la preparazione di difetti della cavità della scatola |
| Sonda orale | Shanghai Sangda Medical Insurance Co., Ltd. | 20000143 | Per misurare il diametro dei difetti |
| Separatore periostale | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Nessuno | Per la separazione smussata del tessuto muscolare |
| Sprague– Ratti Dawley | Byrness Weil Biotech Ltd | Nessuno | Per l'istituzione del difetto cavitario squadrato dell'osso femorale |
| Forbici tissutali | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Nessuno | Per formare un approccio all'incisione cutanea |
Riferimenti
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