Un sistema versatile di barattoli di vetro per la profilatura semiidroponica dell'essudato radicale

Sommario

Presentiamo un protocollo per un sistema sperimentale semiidroponico a base di vetro che supporta la crescita di una varietà di piante filogeneticamente distinte con o senza microbi. Il sistema è compatibile con diversi mezzi di crescita e consente il campionamento non distruttivo dell'essudato radicale per l'analisi a valle.

Abstract

Gli essudati radicali modellano l'interfaccia pianta-suolo, sono coinvolti nel ciclo dei nutrienti e modulano le interazioni con gli organismi del suolo. Gli essudati radicali sono dinamici e modellati da condizioni biologiche, ambientali e sperimentali. A causa della loro ampia diversità e delle basse concentrazioni, i profili di essudato accurati sono difficili da determinare, ancora di più in ambienti naturali in cui sono presenti altri organismi, che trasformano composti di origine vegetale e producono essi stessi composti aggiuntivi. Il sistema sperimentale del barattolo di vetro semiidroponico qui introdotto consente il controllo su fattori biologici, ambientali e sperimentali. Consente la crescita di varie specie vegetali filogeneticamente distinte per un massimo di diversi mesi con o senza microbi, in una varietà di diversi mezzi di crescita. Il design a base di vetro offre un fondo a basso metabolita per un'elevata sensibilità e un basso impatto ambientale in quanto può essere riutilizzato. Gli essudati possono essere campionati in modo non distruttivo e, se lo si desidera, le condizioni possono essere modificate nel corso di un esperimento. La configurazione è compatibile con l'analisi della spettrometria di massa e altre procedure analitiche a valle. In sintesi, presentiamo un sistema di crescita versatile adatto per l'analisi sensibile dell'essudato radicale in una varietà di condizioni.

Introduzione

All'interno di suoli densamente popolati, la rizosfera presenta una nicchia ricca di carbonio. È modellato dalle radici delle piante attraverso l'essudazione fino al 20% del carbonio assimilato e ospita comunità microbiche distinte dal microbioma del suolo residente 1,2,3,4,5,6. Mentre i ricercatori stanno attingendo alle funzioni benefiche dei microbi associati alle radici e al potenziale per l'agricoltura sostenibile che ne deriva⁷, questa osservazione, spesso definita come effetto rizosfera, è stata al centro di crescenti sforzi scientifici. Tuttavia, finora, il dialogo chimico tra microrganismi e piante, che si propone sia il motore dell'effetto rizosfera, rimane poco compreso e, quindi, la comprensione meccanicistica per lo sviluppo di soluzioni microbiche affidabili in agricoltura è limitata ^8,9,10.

Decifrare gli essudati radicali in ambienti del suolo in cui i metaboliti sono prontamente assorbiti dalle particelle del suolo e rapidamente trasformati dalle comunità microbiche non è semplice, soprattutto per le specie vegetali con apparati radicali fini come la pianta modello Arabidopsis thaliana¹¹. Questo è il motivo per cui, nella maggior parte degli studi, gli essudati radicali vengono campionati da sistemi idroponici. In questi microcosmi, le parti aeree delle piante sono tenute in posizione da portapiante personalizzati o da materiali più discreti come rete, agar e perle di vetro. I contenitori utilizzati spaziano dalle piastre di Petri alle piastre multipozzetto a varie scatole personalizzate e commerciali con o senza filtri di aerazione 12,13,14,15,16,17,18,19. A seconda del sistema, le condizioni di crescita delle piante varieranno notevolmente e rifletteranno in misura maggiore o minore le condizioni naturali.

Qui presentiamo un sistema semiidroponico a base di vetro che è sperimentalmente utilizzabile e produce risultati altamente riproducibili. È semplice da assemblare e utilizzare e si basa su materiali comunemente disponibili. Il sistema si basa su un barattolo di vetro riempito con perle di vetro, sfruttando la natura riutilizzabile e le proprietà di basso legame della vetreria (Figura 1). Le perline forniscono un supporto fisico per la pianta in crescita e simulano l'impedenza meccanica, contribuendo a un'architettura radicale più simile a quella del suolo rispetto alle configurazioni idroponiche 19,20,21. Se inoculate con microbi, le perle di vetro presentano superfici a cui i batteri possono attaccarsi.

Il barattolo di vetro può essere chiuso per mantenere la sterilità e il sistema è progettato per consentire uno spazio sufficiente per la testa e la circolazione dell'aria, evitando un ambiente saturo di umidità. I vasetti sono adatti alla crescita prolungata di diverse specie vegetali e possono essere scalati verso l'alto e verso il basso utilizzando vasi di diverse dimensioni. Qui vengono mostrate le applicazioni per sei specie di piante, che coprono graminacee C3 e C4, dicotiledoni e leguminose. Tra questi ci sono le specie modello A. thaliana (dicotiledoni), Brachypodium distachyon (monocotiledone C3), Medicago truncatula (legume), nonché specie coltivate come Solanum lycopersicum (pomodoro, dicotiledoni), Triticum aestivum (grano, monocotiledone C3) e Sorghum bicolor (sorgo, monocotiledone C4). Il protocollo presentato include la configurazione sperimentale del sistema, la sterilizzazione dei semi e la germinazione di sei specie vegetali, il trapianto di piantine in barattoli, diversi mezzi di crescita, l'inoculazione di microbi, il campionamento dell'essudato radicale e l'elaborazione dell'essudato per l'analisi.

Protocollo

1. Preparazione delle piantine: sterilizzazione superficiale dei semi

NOTA: La sterilizzazione superficiale dei semi e tutti i passaggi successivi devono essere eseguiti in condizioni sterili, se non diversamente specificato. I passaggi da 1.1 a 1.4 sono specifici per la sterilizzazione superficiale dei semi di A. thaliana . Altre specie di piante hanno variazioni alternative nelle dimensioni del tubo (a seconda del numero di semi e della dimensione del seme), nel tempo nelle soluzioni e nelle soluzioni di sterilizzazione (Tabella 1).

1. Aggiungere i semi in una provetta per microcentrifuga (massimo 20 mg di semi) e coprire i semi con etanolo al 70%.
   ATTENZIONE: L'etanolo è infiammabile. Non utilizzare vicino a fiamme libere.
2. Spostare le provette chiuse della microcentrifuga in uno shaker per 15 minuti e impostare la rotazione in modo che i semi vengano agitati delicatamente.
3. Rimuovere con cautela l'etanolo al 70% con una pipetta e sostituirlo con etanolo al 100%. Ripetere il passaggio 1.2.
4. Rimuovere l'etanolo al 100% ed essiccare i semi lasciando aperti i coperchi delle provette della microcentrifuga in un flusso d'aria sterile.
5. Una volta che i semi sono asciutti, distribuiscili uniformemente su un terreno 0,5x Murashige e Skoog (MS) con fito agar allo 0,7% muovendo il tubo o usando una pinza sterile. Chiudere le piastre di agar e sigillarle con nastro microporoso da 1,25 cm.
6. Posizionare le piastre orizzontalmente su un ripiano nella camera di crescita (16 h luce/8 h buio, 22 °C giorno/18 °C notte, 150-160 μmol ^{m-2 s-1}).

2. Preparazione delle piantine: trasferimento dei semi germinati in piatti freschi

NOTA: I seguenti passaggi sono specifici per A. thaliana e non sono necessari per altre specie.

1. Dopo la germinazione, trasferisci da 5 a 6 piantine su nuove piastre di fito agar allo 0,7% con terreno MS 0,5x posizionando le piantine linearmente, a circa 3 cm dall'alto (vedi la posizione della rosetta nella Figura 2D).
2. Sigillare le piastre di agar con nastro microporoso da 1,25 cm e far crescere verticalmente nella camera di crescita (Figura 2D) fino a quando le piantine sono pronte per essere trasferite in barattoli a 15-18 giorni dalla germinazione (Tabella 2).

3. Preparazione del sistema idroponico: configurazione del barattolo

1. Aggiungere 150 ml di perle di vetro pulite da 5 mm a ciascun barattolo pulito e chiudere con il coperchio (Figura 1A).
   NOTA: In questo protocollo, le perle di vetro da 5 mm sono adatte per la maggior parte delle specie²², ma la dimensione delle perle può essere regolata se lo si desidera.
2. Posizionare una quantità sufficiente di foglio di alluminio sui barattoli chiusi per coprire la giunzione coperchio-barattolo e l'autoclave (121 °C per 20 minuti) (Figura 1B).
3. Tenere i barattoli preparati coperti fino a quando le piante non sono pronte per essere trasferite (Tabella 2).

4. Preparazione del sistema idroponico: aggiunta di piantine

1. Quando le piantine sono pronte per essere trasferite nei barattoli (Tabella 2), rimuovere il foglio di alluminio e i coperchi dei barattoli nel banco sterile.
2. Se i barattoli devono essere inoculati con batteri, eseguire i seguenti passaggi prima di passare al passaggio 4.3; In caso contrario, saltare il passaggio 4.2.
   1. Utilizzando un ciclo di inoculazione sterile, prelevare singole colonie da colture batteriche pure su piastre di agar e sospenderle in 750 μL di 10 mM MgCl₂ sterili. Ripetere fino a quando la soluzione non è torbida.
   2. Opzionale: lavare la sospensione 3 volte con 750 μL di MgCl₂ sterile da 10 mM mediante centrifugazione di 5 minuti a 1.000 × g e temperatura ambiente, seguita dalla rimozione del surnatante e dalla risospensione del pellet in 750 μL di 10 mM MgCl₂.
   3. Facoltativo: se si inoculano più specie batteriche diverse, mescolare le sospensioni di singoli ceppi preparati nelle fasi 4.2.1-4.2.2 in rapporti uguali prima di procedere.
   4. Regolare la densità ottica alla lunghezza d'onda di 600 nm (OD₆₀₀) a 0,2-0,4 in un terreno MS 0,5x (pH da 5,7 a 5,9, regolato con KOH) o in un altro mezzo di crescita a scelta (vedere il passaggio 4.3). Misurare nuovamente l'OD₆₀₀ per verificare se la soluzione è stata diluita correttamente.
      ATTENZIONE: Il KOH è corrosivo; Indossare guanti e camice da laboratorio.
   5. Diluire ulteriormente la sospensione a OD₆₀₀ 0,002-0,004 nello stesso mezzo (diluizione 1:100).
      NOTA: La densità cellulare finale dipenderà dal ceppo batterico utilizzato, ma nella nostra esperienza, questo inoculo corrisponde a circa 3-6 × 10^{5 cellule mL-1}.
   6. Aggiungere 35 ml della diluizione finale per barattolo. Aggiungere 35 ml di terreno di coltura sterile per controllare i barattoli. Mescola le perline per ricoprirle uniformemente con un terreno MS 0,5x prima del trasferimento della pianta in modo che le radici non si secchino. Procedere al punto 4.4.
3. Aggiungere 35 ml di terreno 0,5x MS a ciascun barattolo (pH da 5,7 a 5,9, regolare con KOH). Mescola le perline per ricoprirle uniformemente con un terreno MS 0,5x prima del trasferimento della pianta in modo che le radici non si secchino.
   NOTA: Il terreno di coltura può essere modificato, ad esempio, mediante la rimozione di sostanze nutritive, l'aggiunta di osmoliti per indurre lo stress salino o l'uso di diversi valori di pH o terreni di crescita. ATTENZIONE: Il KOH è corrosivo; Indossare guanti e camice da laboratorio.
4. Metti 3-5 piante di A. thaliana in un barattolo posizionando gli apparati radicali tra le perle di vetro.
   NOTA: Il numero di piante per barattolo è diverso per le altre specie (Tabella 2).
5. Muovi le perline con una pinza sterile o un cucchiaio per coprire le radici e sollevare le foglie dal terreno (Figura 1C).
   NOTA: Spostare con cautela le piante e le perline per evitare di rompere le radici e stressare le piante.
6. Aggiungete 2 strisce di nastro adesivo per micropori da 1,25 cm sulla parte superiore dei barattoli e posizionate delicatamente il coperchio sopra (Figura 1D-F).
   NOTA: Non spingere verso il basso il coperchio per evitare di ostruire il ricambio d'aria.
7. Coprire lo spazio tra il coperchio e il barattolo con nastro microporoso da 2,5 cm per mantenere la sterilità consentendo il ricambio d'aria e posizionare i barattoli in una camera di crescita (Figura 1G,H).
8. Impostare 4-8 vasetti per condizione sperimentale, a seconda del quesito biologico e della variabilità prevista.
9. Assicurati di includere controlli biologici negativi (ad esempio, barattoli senza piante) per tenere conto del background di metaboliti del sistema sperimentale. Impostare lo stesso numero di repliche per i controlli negativi e per i trattamenti sperimentali (ad esempio, quadruplicati).
10. Per periodi di crescita prolungati, sostituire il terreno di coltura settimanalmente: rimuovere il resto del terreno di coltura con una pipetta volumetrica da 25 mL e aggiungere 35 mL di terreno fresco.

5. Raccolta di essudati radicali

1. Quando le piante raggiungono l'età desiderata, rimuovere il nastro microporoso da 2,5 cm e il coperchio nel banco sterile.
   NOTA: Per A. thaliana nelle nostre condizioni di crescita, 21 giorni dopo la germinazione rappresentano una fase vegetativa matura prima dell'inizio della fioritura. La fase di sviluppo vegetativo è specifica per la specie vegetale e i tempi del periodo di crescita cambiano con le specie vegetali; Questa tempistica può essere modificata a seconda della domanda di ricerca.
2. Per il test di sterilità, aliquotare 20 μL di terreno di coltura e pipetare su piastre di agar LB.
   1. Per i vasetti inoculati, aliquotare 100 μL di terreno di coltura da utilizzare per la conta delle unità formanti colonie (CFU) (ad esempio, in una serie di diluizione²³).
      NOTA: Nella nostra esperienza, le densità batteriche variano tra 10^{5-10 8} cellule vive ^mL-1 di terreno di crescita.
3. Rimuovere quanto più terreno di coltura possibile con una pipetta volumetrica da 25 ml, evitando danni alle radici.
4. Aggiungere 50 mL di terreno di raccolta (ad es. 20 mM di acetato di ammonio; pH 5,7-5,9 regolato con HCl) pipettando lungo le pareti del barattolo per evitare di bagnare le foglie. Chiudere i vasetti con i coperchi e incubarli in condizioni sterili per il tempo desiderato di raccolta dell'essudato. Per gli esperimenti sensibili al tempo, 2 ore sono una buona finestra di raccolta.
   ATTENZIONE: HCl è corrosivo; Indossare guanti e camice da laboratorio. Per tempi di raccolta dell'essudato radicale più lunghi, avvolgere nuovamente i coperchi con del nastro adesivo e spostare i barattoli nella camera di crescita.
5. Dopo 2 ore, rimuovere la quantità desiderata di terreno di raccolta nelle provette (ad es. 50 mL per saggi o analisi con essudati concentrati o 2 mL per uso diretto). Conservare gli essudati radicali raccolti a -80 °C fino a un'ulteriore elaborazione o analisi.
   1. Quando si lavora con i barattoli inoculati, centrifugare gli essudati raccolti per 10 minuti a 5.000 × g e 4 °C e utilizzare solo surnatanti per l'analisi. In alternativa, sterilizzare gli essudati con un filtro da 0,22 μm o 0,45 μm.
6. Se l'esperimento fa parte di una serie temporale, rimuovere tutto il terreno di raccolta rimanente dai barattoli e aggiungere 35 ml di terreno MS 0,5x. Riposizionare il coperchio e il nastro adesivo da 2,5 cm prima di rimettere i barattoli nella camera di crescita.
7. Misura il peso della radice e del germoglio fresco di tutte le piante in un barattolo per normalizzare successivamente gli essudati radicali in base al peso della pianta.
   NOTA: I tessuti vegetali possono essere campionati in aggiunta, se lo si desidera.

6. Processamento di essudati radicali per spettrometria di massa

1. A seconda del metodo analitico, liofilizzare gli essudati radicali per concentrarli e rimuovere il mezzo di raccolta (-80 °C a 0,37 mbar fino a quando non è più presente liquido). Conservare a -80 °C fino al momento dell'analisi.
   NOTA: I dati qui presentati sono stati generati con l'analisi TOF-MS a iniezione di flusso su uno strumento a tempo di volo a quadrupolo di massa accurata.
2. Prima dell'iniezione nello strumento analitico, ricostituire gli essudati liofilizzati o diluire gli essudati radicali non trasformati con terreno di raccolta in base al peso fresco della radice.
   NOTA: Il mezzo di raccolta è stato scelto per essere compatibile con lo spettrometro di massa. Tuttavia, a seconda del metodo analitico, potrebbero essere necessarie fasi di desalinizzazione prima dell'iniezione.

Risultati

Il sistema sperimentale qui introdotto permette il controllo dei fattori sperimentali e ambientali che alterano i profili di essudazione radicolare. Abbiamo confrontato la crescita di A. thaliana in diverse condizioni di illuminazione, età e densità delle piante in due diversi laboratori (Figura 3). Le piante sembravano sane in tutti i laboratori (Figura 3A,B). Le condizioni di giorno corto (10 ore di luce contro 16 ore di luce, Figura 3) hanno portato a una maggiore massa radicale rispetto alle condizioni di giorno lungo (Figura 3C,D). Allo stesso modo, la massa radicale totale di tutte le piante coltivate in condizioni di giorno lungo era inferiore a quella di giorno corto (Figura 3C). Nel complesso, la variabilità della crescita all'interno e tra i barattoli è risultata bassa in tutti i laboratori.

Il sistema di barattoli di vetro è compatibile con una varietà di specie vegetali e fasi di sviluppo. L'endpoint per l'analisi dell'essudato radicale è in genere di 21 giorni, poiché nelle nostre condizioni sperimentali, molte specie vegetali sono in una fase vegetativa matura prima di passare alla fase riproduttiva (Figura 4A-E). Le piante possono essere facilmente rimosse dal sistema sperimentale senza danni visibili all'apparato radicale. Pertanto, la determinazione del peso dei tessuti o l'utilizzo dei tessuti per l'analisi a valle è semplice. I pesi più elevati dei germogli sono stati riscontrati per il frumento, seguito da sorgo e pomodoro. I pesi radicali più elevati sono stati riscontrati per il sorgo, seguito dal frumento e da M. truncatula. Il rapporto radice/germoglio varia da specie a specie. Nel complesso, il peso dei tessuti variava tra 100 mg e 800 mg.

Un aspetto centrale dei sistemi sperimentali che consentono la raccolta dell'essudato radicale è l'inoculazione controllata con microbi per studiare le interazioni pianta-microbo in un ambiente definito. Il sistema sperimentale presentato può essere mantenuto sterile anche con manipolazioni ripetute (vedere la condizione di "controllo" nella Figura 5) e i batteri possono essere aggiunti e mantenuti per lunghi periodi. Quando le piante di A. thaliana di 33 giorni sono state inoculate con una miscela di batteri commensali a OD₆₀₀ 0,004, i batteri sono persistiti per 12 giorni, che è stata l'intera durata dell'esperimento (Figura 5). Le unità formanti colonie sono addirittura aumentate di 100 volte nel terreno di coltura e hanno anche colonizzato le radici (Figura 5C). I fenotipi delle piante inoculate erano indistinguibili da quelli delle piante sterili (Figura 5A,B).

Il sistema sperimentale presentato consente la raccolta di essudato in molte condizioni sperimentali. Qui, presentiamo i profili di essudazione di A. thaliana Col-0 raccolti consecutivamente in acetato di ammonio o in acqua dalle stesse piante (Figura 6A). Gli essudati sono stati conservati a -80 °C fino all'analisi, normalizzati in base al peso delle radici e analizzati mediante spettrometria di massa. Campioni di vasi contenenti piante sono stati filtrati rispetto a controlli sperimentali (vasi senza piante). Dei 2.163 metaboliti, 436 hanno mostrato un segnale al di sopra del fondo (20,16%) e sono stati conservati per l'analisi. Di questi, 416 o il 95% dei composti hanno mostrato una netta abbondanza tra le condizioni sperimentali. Tuttavia, 26 metaboliti non possono essere attribuiti a nessun tipo di composto e quindi non sono definiti. La maggior parte dei metaboliti (406 o 98%) erano più abbondanti negli essudati raccolti nell'acqua. La raccolta consecutiva di essudati prima in acetato di ammonio e poi in acqua potrebbe influire sul profilo di essudazione, poiché i segnali metabolici potrebbero diluirsi nel tempo. Tuttavia, il segnale di essudazione quasi esclusivamente più elevato nell'acqua raccolta come secondo punto temporale non supporta questa ipotesi: la raccolta di essudato in acqua pura probabilmente crea uno shock osmotico per le piante, che causa l'aumento dell'abbondanza di metaboliti rispetto a un solvente di raccolta equimolare alla soluzione di crescita (20 mM di acetato di ammonio è equimolare a 0,5 volte il mezzo MS). L'indagine delle classi chimiche dei composti identificati di entrambe le condizioni di crescita ha mostrato che la maggior parte dei composti sono acidi organici e derivati (28,6%) seguiti da composti organici dell'ossigeno (18%), composti organoeterociclici (14,2%) e lipidi (13,2%). Solo un piccolo sottogruppo di metaboliti appartiene ai fenilpropanoidi e ai polichetidi (8,7%) e ai benzenoidi (6%). I composti organici azotati, i nucleosidi, i composti organosolforati, gli alcaloidi, i lignani e i composti correlati rappresentano tra il 2% e lo 0,5% dei composti classificati (Figura 6B). La distribuzione dei metaboliti qui illustrata corrisponde ai dati già pubblicati utilizzando altri tipi di sistemi di raccolta degli essudati radicali²⁴.

Figura 1: Configurazione del barattolo di vetro. (A) Barattolo con perle di vetro. (B) Barattolo con perle di vetro pronto per essere sterilizzato in autoclave. (C) Piantine in barattoli (vista dall'alto). (D) Piantine in barattolo (vista dall'alto) con nastro microporoso da 1,25 cm. (E) Piantine in barattoli (vista laterale) con nastro microporoso da 1,25 cm. (F) Piantine in barattoli (vista laterale) con nastro microporoso da 1,25 cm e coperchio. (G) Configurazione completa del barattolo con piantine in barattoli (vista laterale) con nastro microporoso da 1,25 cm, coperchio e nastro microporoso da 2,5 cm. (H) Completare la configurazione del barattolo (vista dall'alto). (I) Piante di 21 giorni e pronte per il raccolto (vista dall'alto). Dimensioni del barattolo: 147 mm di altezza x 100 mm di diametro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Piantine sterilizzate in superficie su piastre di agar medio Murashige e Skoog 0,5x in una camera di crescita. (A) Arabidopsis thaliana (6 giorni), (B) Brachypodium distachyon (6 giorni), (C) Medicago truncatula (6 giorni), (D) A. thaliana (18 giorni). Dimensioni piastra di agar 120 mm x 120 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Piante di Arabidopsis thaliana Col-0 coltivate in barattoli in condizioni di luce a breve e lungo giorno. (A) Barattolo con tre piante di 33 giorni coltivate in condizioni di giorno corto (10 ore di luce/14 ore di buio, 220 μmol ^{m-2 s-1} di intensità luminosa, 21 °C di giorno/18 °C di notte) e (B) barattolo con cinque piante di 21 giorni coltivate in condizioni di giorno lungo (16 ore di luce/8 ore di buio, 150-160 μmol ^{m-2 s-1} intensità luminosa, 22 °C giorno/18 °C notte). Peso delle radici di (C) tutte le piante di un barattolo e (D) di piante singole. ** rappresentano i valori di significatività del test t (p < 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Cinque specie filogeneticamente distinte al giorno 21 nella configurazione del sistema di barattoli di vetro sterile. (A) Monocotiledone modello Brachypodium distachyon, (B) leguminosa modello Medicago truncatula, (C) dicotiledonile Solanum lycopersicum (pomodoro), (D) dicotiledonida Sorghum bicolor, (E) monocotiledone Triticum aestivum (grano). (F) Peso fresco delle radici e dei germogli delle specie coltivate in barattoli di vetro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Arabidopsis thaliana Col-0 (33 giorni) coltivata in condizioni di giorno corto. (A) In un ambiente sterile o (B) inoculato per 12 giorni con un consorzio di batteri commensali. (C) Unità formanti colonie per vasi sterili (di controllo) e inoculati del substrato di crescita (a sinistra) e della radice (a destra). N = 4 vasetti per la condizione di controllo sterile e n = 8 vasetti per la condizione inoculata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Profili distinti dell'essudato radicolare per A. thaliana Col-0 di 21 giorni. Gli essudati sono stati raccolti per 2 ore in acetato di ammonio sterile da 20 mM (pH 5,7) seguiti da una raccolta di 2 ore in acqua deionizzata filtrata sterile. I metaboliti sono stati rilevati mediante spettrometria di massa mediante iniezione diretta. (A) Analisi delle componenti principali di 436 metaboliti rilevati al di sopra del livello di fondo (confronto di vasi con piante e vasi senza piante). PC: componente principale con la quantità di varianza spiegata. Blu: essudati raccolti in acqua, giallo: essudati raccolti in acetato di ammonio. (B) Grafico a torta di 416 metaboliti significativamente diversi tra le condizioni sperimentali (test di Tukey) colorati secondo la superclasse (https://cfb.fiehnlab.ucdavis.edu/). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Specie		Preparazione del seme	Tempo in etanolo al 70% (min)	Concentrazione di ipoclorito di sodio (NaClO) (v/v % candeggina)		Tempo in candeggina (min)
Thaliana di Arabidopsis			15	Nessuno; 100% etanolo		15
Brachypodium distachyon*		Decorticazione	0.5	6		5
Medicago truncatula*a			30	6		30
Solanum lycopersicum*			0.5	6		5
Sorgo bicolore*		Decorticazione	0.5	6		30
Triticum aestivum*		Decorticazione	0.5	12		20

Tabella 1: Metodi di sterilizzazione dei semi di superficie per più specie. *Lavato 4-5 volte con acqua deionizzata filtrata tra etanolo e candeggina e alla fine; ^{un'incubazione}di 3-6 ore dopo la candeggina, sostituendo con acqua deionizzata filtrata ogni 30 min.

Specie	Giorno ai barattoli	Numero di piante
Brachypodium distachyon	da 4 a 5	3
Sorgo bicolore	da 4 a 5	3
Triticum aestivum	da 4 a 5	2
Medicago truncatula	da 5 a 6	3
Lycopersicum di Solanum	da 7 a 8	3
Thaliana di Arabidopsis	17	Da 3 a 5

Tabella 2: Età delle piantine in giorni per il trasferimento in vaso e numero di piante per vaso per varie specie vegetali.

Discussione

Il sistema sperimentale qui presentato si basa su barattoli di vetro e perle di vetro e fornisce quindi un sistema semiidroponico semplice, a bassa manutenzione e versatile per studiare l'essudazione delle radici in vari contesti. È stato utilizzato in studi che indagano i profili di essudazione di diverse specie vegetali²⁵, le risposte dell'essudazione a diverse condizioni di crescita²⁵, nonché l'influenza delle proprietà fisico-chimiche del suolo sull'essudazione²². Il sistema è adatto a tutte le specie vegetali testate qui per periodi di crescita prolungati, che vanno da settimane a mesi. Il mantenimento delle condizioni di sterilità è semplice, così come l'inoculazione con i batteri, che persistono per il periodo di crescita di 2 settimane analizzato. Pertanto, il sistema sperimentale non solo consente una raccolta controllata di essudati radicali in condizioni sterili, ma può anche essere utilizzato per studiare le interazioni pianta-microbi. Inoltre, i substrati di crescita delle piante possono essere variati per studiare le risposte metaboliche a diversi livelli di nutrienti e i periodi di crescita possono essere regolati adattando le condizioni di luce o utilizzando barattoli di dimensioni diverse.

Lo studio degli essudati radicali in condizioni idroponiche o semiidroponiche rimane standard nel campo principalmente a causa della maggiore risoluzione dei metaboliti a bassa concentrazione¹¹. Molti approcci idroponici si basano su piastre di Petri, piastre multipozzetto o altri piccoli contenitori che consentono sterilità e alta produttività, ma limitano la sperimentazione a piccole piante o piantine coltivate in ambienti ad alta umidità 17,18,26,27. Nella configurazione del barattolo di vetro presentata, lo spazio di testa è fornito dai barattoli relativamente grandi, consentendo periodi di crescita prolungati. Le strisce di nastro microporoso assicurano il ricambio d'aria mantenendo la sterilità. In questo modo, anche le monocotiledoni alte come l'orzo e il mais possono essere coltivate in barattoli di vetro per più settimane. Piccole piante come A. thaliana e trifoglio possono essere studiate per 4-5 settimane dopo la germinazione, comprese le fasi vegetative e riproduttive.

Configurazioni idroponiche alternative sono disponibili anche per piante più grandi, ma spesso richiedono scatole e ingressi su misura realizzati con rete, pannelli di schiuma e cestini di attecchimento per il supporto delle piante 15,28,29,30. Inoltre, questi dispositivi di solito non sono configurati per essere sterili o richiedono procedure di configurazione e manutenzione impegnative per mantenerli privi di contaminazioni microbiche e/o chimiche. L'impostazione e il mantenimento della sterilità nel sistema sperimentale presentato sono semplici. Inoltre, l'uso del vetro per barattoli e perline riduce la presenza di contaminanti che fuoriescono dalla plastica e consente di risparmiare risorse in quanto può essere facilmente lavato e riutilizzato.

Le perle di vetro sono state applicate in precedenza per imitare le particelle di terreno. Inducono lo sviluppo naturale delle radici nei dispositivi di campionamento dell'essudazione radicale come le trappole per l'essudazione³¹ o altri sistemi semiidroponici¹⁹. La configurazione del barattolo di vetro sfrutta questo sviluppo e introduce le perle come superficie di colonizzazione per i microbi. Nel suolo, il microbioma intorno alle radici delle piante si evolve in un ambiente semisolido, con particelle compatte e spazi pieni di aria o acqua. Anche se la configurazione del barattolo di vetro non include l'aerazione attiva del mezzo di crescita, a causa della quale la fase liquida inferiore probabilmente non contiene livelli ottimali di ossigeno, la combinazione di un volume di perle più grande con un volume di terreno di crescita più piccolo crea una fase superiore umida ma aerata in cui i microbi possono crescere in condizioni ossiche. Altri hanno proposto di scuotere i contenitori di crescita^26,28 o di utilizzare tubi accoppiati a pompe ad aria^19,29 per mantenere l'alimentazione d'aria nei sistemi di crescita idroponica. Tuttavia, questi sistemi sono impostati per non essere sterili o richiedono materiale specializzato e una sorveglianza costante per mantenere la sterilità. Inoltre, in caso di scuotimento, molta attenzione per evitare l'immersione dei germogli nelle soluzioni di crescita e danni agli apparati radicali. Tuttavia, se lo si desidera, la configurazione sperimentale presentata potrebbe essere adattata con materiale aggiuntivo per l'aerazione.

Un aspetto cruciale da considerare in tutti gli studi di interazione pianta-microbi che studiano il metabolismo è che i microbi degradano i composti di origine vegetale e producono metaboliti da soli. Senza una configurazione sperimentale sterile specializzata, non è possibile distinguere tra metaboliti di origine vegetale e microbica. Per inibire l'attività microbica e arricchire i composti di origine vegetale, Oburger et al. hanno proposto di sterilizzare chimicamente la soluzione di campionamento dell'essudato radicale per inibire la degradazione batterica³². L'effetto degli inibitori chimici potrebbe essere studiato nel sistema sperimentale presentato, confrontando i profili di essudazione di piante sterili rispetto a quelle non sterili trattate con o senza l'inibitore.

Una delle principali limitazioni della configurazione del barattolo di vetro presentata è che le condizioni di crescita rimangono molto artificiali rispetto al suolo. Gli essudati delle piante coltivate in terra vengono spesso raccolti da sistemi di percolazione¹³, in cui i flussi di solventi sono raccolti alla base di contenitori di crescita, o da sistemi ibridi suolo-idroponici, in cui le piante vengono inizialmente coltivate nel terreno e poi trasferite in condizioni idroponiche ^16,33. A differenza della configurazione del barattolo di vetro, queste procedure di solito sono distruttive, non consentendo raccolte multiple nel tempo in ambienti di crescita mutevoli. Inoltre, mentre nei sistemi percolanti il fondo del suolo viene campionato insieme agli essudati, nei sistemi ibridi suolo-idroponica il problema dell'elevato fondo metabolico del suolo viene aggirato con il trasferimento in condizioni idroponiche per la raccolta dell'essudato. Sebbene i tempi di recupero siano stati implementati per ridurre la perdita di metaboliti attraverso le radici ferite¹¹, il trasferimento delle piante è molto dirompente ed è probabile che le ferite persistano e il metabolismo delle piante potrebbe cambiare in risposta al trasferimento in condizioni idroponiche. Inoltre, in molti casi, uno shock osmotico è indotto dal trasferimento delle piante all'acqua invece che a una soluzione di crescita adeguata^16,33. Nel protocollo presentato, la soluzione di crescita viene scambiata con una soluzione equimolare per mantenere l'equilibrio osmotico, consentendo comunque di catturare l'essudazione entro una breve finestra temporale definita. Il cambiamento della soluzione di crescita è una pratica comune in molti studi pubblicati e può essere facilmente ottenuto in configurazioni idroponiche senza ferire le radici 12,16,26,34. Grazie alla sua versatilità, il sistema sperimentale presentato può essere facilmente adattato per simulare condizioni più naturali, ad esempio utilizzando l'estratto di terreno sterile o non sterile come soluzione di crescita con o senza la presenza di particelle solide di terreno. Il graduale cambiamento verso le condizioni naturali permette di studiare l'impatto delle diverse proprietà fisico-chimiche del suolo e della presenza microbica sul metabolismo e sulla fisiologia delle piante. Prima che la comunità scientifica abbia una buona comprensione dell'essudazione in vari ambienti, è auspicabile impiegare sistemi basati sul suolo e sistemi idroponici in parallelo, poiché entrambe le configurazioni hanno i loro vantaggi e limiti¹³.

In conclusione, la configurazione sperimentale semiidroponica a base di vetro presentata si distingue per la sua semplicità combinata con un'elevata versatilità di applicazioni. Rappresenta un modo accessibile e a basso costo per raccogliere e studiare l'essudazione in condizioni sterili o in combinazione con microbi e interazioni pianta-microbi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Polvere di agar per batteriologia	VWR	20767.298
Foglio di alluminio	FORA GmbH
Acetato di ammonio	Sigma-Aldrich	32301-1KG	Reagente ACS, Eur >- 98%
Autoclave VX-150	Systec	1150
Balance	Sartorius	QUINTIX64-1S
Centrifuga	Hermle Labortechnik GmbH	305.00 V05
Cuvette	Greiner Bio-One	613101
Difco LB Brodo, Lennox	BD	240210
Etanolo	Reuss-Chemie AG	RC-A15-A-005L
Acqua deionizzata filtrata	Merck	Millipore Milli-Q IQ7000
Perle di vetro	Carl Roth	HH56.1	5 mm
Acido cloridrico	Merk	1.00317.1000
Circuito di inoculazione	Karl Hammacher GmbH	HWO_070-21
Barattoli	Weck	105741	850 mL
Liofilizzante	Christ	Alpha 2-4 LSCplus
Cloruro di magnesio esaidrato	Carl Roth	2189.1
Matrix Agitatore termico orbitale	IKA	10006248
Provetta per microcentrifuga	Sarstedt AG & Co. KG	72.695.500	Provetta di reazione SafeSeal, 2 mL, PP
Nastro per micropori	3M	1530-0	da 1,25 cm x 9,1 m
	3M	1530-1	2,5 cm x 9,1 m
Murashige & Skoog Medium (MS)	Duchefa Biochemie	M0221.0050
Camera di crescita	Percival	SE41-TLCU4	16 ore di luce/8 buio. 22 gradi C giorno/18 notte
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003.1000
Idrossido di potassio	Sigma-Aldrich	8.14353.0100
Spettrofotometro SmartSpec Plus	Bio-Rad	170-2525
Soluzione di ipoclorito di sodio, 12% Cl	Carl Roth	9062.4
Piastra di Petri quadrata	Greiner Bio-One	688102	120x120x17 mm, con prese d'aria
Stericup Sgancio rapido	Millipore	S2GPU05RE	0,22 & micro; m PES, 500 mL
Banco sterile	FASTER S.r.l.	FlowFast H 18