In questo articolo, descriviamo uno strumento avanzato progettato per il monitoraggio della biosintesi della clorofilla durante le prime fasi di de-eziolamento delle piantine di Arabidopsis . La nuova metodologia fornisce immagini non invasive in tempo reale della fluorescenza della clorofilla ad alta risoluzione spaziale e temporale.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Test non invasivo per la determinazione della cinetica della biosintesi della clorofilla durante le prime fasi della deeziolazione dell'Arabidopsis
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La biosintesi della clorofilla è un segno distintivo della deeziolazione, una delle fasi più drammatiche del ciclo di vita delle piante. Il processo strettamente controllato e altamente dinamico della biosintesi della clorofilla viene innescato durante il passaggio dal buio alla luce nelle piante da fiore. Nel momento in cui le piantine eziolate sono esposte alle prime tracce di luce solare, la rapida (in ordine di secondi) conversione della protoclorofilla in clorofilla è mediata da complessi proteici unici che accettano la luce, portando attraverso le successive fasi metaboliche alla produzione di clorofilla completamente funzionale. Le tecniche standard per l'analisi del contenuto di clorofilla includono l'estrazione di pigmenti da tessuti vegetali distaccati, che non si applica allo studio di processi così veloci. Per studiare la cinetica della clorofilla in vivo con elevata precisione e risoluzione spazio-temporale nelle prime ore dopo la de-eziolazione indotta dalla luce, sono stati sviluppati uno strumento e un protocollo. Qui, presentiamo una procedura dettagliata progettata per una quantificazione statisticamente robusta della clorofilla nelle prime fasi della deeziolazione di Arabidopsis .
Introduzione
La deeziolazione rappresenta la fase più drammatica del ciclo vitale della pianta, caratterizzata da una serie di cambiamenti morfologici e da un completo riarrangiamento del metabolismo della pianta (da etero- ad auto-tropico)1. La biosintesi della clorofilla è un segno distintivo della deeziolazione indotta dalla luce nelle piante e un processo molto dinamico. La formazione di clorofilla dai precursori protoclorofillidi prodotti dall'oscurità deve essere strettamente coordinata per evitare danni dovuti a sottoprodotti reattivi2. La riduzione della protoclorofillide a clorofillide è catalizzata dalle protoclorofillide ossidoreduttasi (POR) dipendenti dalla luce, enzimi unici attivati direttamente dalla luce. La reazione è molto veloce, avviene nell'ordine da ms a s3, portando ad un accumulo riconoscibile di clorofilla entro pochi minuti dall'irradiazione della piantinaeziolata 4,5,6. È necessario più tempo (da ore a giorni) affinché la biogenesi dei cloroplasti stabilisca un apparato fotosintetico completamente funzionante3.
Esistono vari metodi per analizzare il contenuto di clorofilla, tra cui la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) o la spettrofotometria. Di solito, queste tecniche richiedono la distruzione del tessuto vegetale 4,5,6, limitando la determinazione delle variazioni dei livelli di clorofilla nel tempo. I metodi che consentono l'instaurazione di una cinetica clorofilliana non invasiva possono aprire una prospettiva completamente nuova per studiare le piante in diversi aspetti che vanno da domande di ricerca fondamentale, come l'analisi del processo di sintesi della clorofilla nel tempo e nello spazio, ad applicazioni più pratiche, come la valutazione della tolleranza allo stress o l'effetto dei biostimolanti sulla cinetica della clorofilla. In considerazione di ciò, abbiamo introdotto un sistema per monitorare la formazione di clorofilla, iReenCAM7. Incorpora una telecamera CCD, filtri di emissione, sorgenti luminose e una tubazione per l'analisi automatizzata della fluorescenza (Figura 1). La caratteristica principale del dispositivo sviluppato è l'elevata risoluzione spaziale e temporale, le prestazioni superiori nei parametri utilizzati negli approcci attuali e la sensibilità e specificità sufficienti rispetto ai metodi analitici standard7.
La procedura non invasiva qui descritta richiede una quantità minima di reagenti e comprende semplici passaggi, che consentono di ottenere un profilo cinetico della clorofilla nelle piantine vive di Arabidopsis durante le primissime fasi di de-eziolamento. Il protocollo può essere utile per lo studio di processi altamente dinamici di sintesi della clorofilla influenzati da una serie di fattori, sia esogeni (salsedine, siccità, biostimolanti, metalli pesanti, ecc.) che endogeni (tipicamente associati a cambiamenti nell'attività genica) di origine senza la necessità di staccare alcun tessuto vegetale, evitando così ulteriori stress.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Preparazione media
- Preparare il terreno di coltura mescolando 0,75 g di gelificante con 50 ml di acqua deionizzata sterile in un flacone di vetro per ottenere una concentrazione dell'1,5% (p/v) per una piastra di Petri (120 x 120 x 17 mm). Agitare delicatamente la miscela e poi riscaldarla nel microonde fino all'ebollizione per sciogliere il gelificante (la soluzione diventa limpida).
- Lasciare raffreddare il terreno a 58-60 °C prima di procedere ai passaggi successivi. Tutte le fasi successive devono essere eseguite in condizioni sterili all'interno di una cappa a flusso laminare per evitare contaminazioni.
- Utilizzare piastre di Petri con bordi a tenuta di luce per evitare un'eccessiva riflessione della luce attinica e un'elevata autofluorescenza di fondo durante le misurazioni. A tale scopo, applicare del nastro adesivo nero (o altri mezzi disponibili) per coprire tutti i lati della piastra di Petri vuota (Figura 2).
- Eseguire la sterilizzazione della/e piastra/e dopo l'applicazione del nastro mediante irradiazione con lampada UV germicida per 20-30 min.
- Se l'esperimento prevede un trattamento chimico (ad esempio, fattori di stress abiotici/biotici, ormoni vegetali e/o regolatori della crescita, ecc.), aggiungere la quantità appropriata di sostanza chimica corrispondente direttamente al terreno. Prestare attenzione alla stabilità chimica scelta aggiunta al mezzo (ad esempio, se il prodotto chimico non è termostabile, aggiungerlo al mezzo quando si è raffreddato subito prima di versarlo nel piatto). Mescolare accuratamente il terreno agitando per garantire una distribuzione uniforme della sostanza chimica.
- Evitare l'illuminazione delle lastre alla luce UV dopo che il terreno è stato versato (porterebbe alla produzione di radicali dell'ossigeno che potrebbero interferire con l'esperimento).
- Versare il terreno preparato nella/e piastra/e di Petri quadrata/e e lasciare che il terreno si solidifichi a temperatura ambiente.
2. Sterilizzazione della superficie del seme e condizioni di crescita delle piante
- Prelevare la quantità necessaria di semi di Arabidopsis thaliana Col-0 dal brodo (10-20 mg) e aggiungerla a una provetta da microcentrifuga da 2 ml.
NOTA: Non sono necessarie modifiche specifiche quando si lavora con diverse linee di Arabidopsis (linee di ecotipi/mutanti). La revisione della griglia di taglio e delle fasi di misurazione deve essere eseguita per altre specie vegetali tenendo conto della differenza nelle dimensioni dei semi, nel tasso di germinazione e nelle dimensioni delle piantine. - Sterilizzare in superficie i semi di Arabidopsis aggiungendo etanolo al 70% nella provetta per 2 minuti. Agitare delicatamente le provette durante la sterilizzazione.
- Rimuovere l'etanolo pipettando con cura, facendo attenzione a non perdere i semi. Lavare i semi aggiungendo acqua sterile al tubo per 5 minuti per rimuovere eventuali residui di etanolo (scuotere delicatamente i tubi durante il periodo di lavaggio).
- Lascia che i semi sedimentino sul fondo del tubo per gravità, rimuovi l'acqua rimanente.
- Sciacquare nuovamente i semi 2 volte con acqua sterile come descritto nel passaggio 2.3 per assicurarsi che siano privi di qualsiasi tratto di etanolo. Lascia che i semi sedimentino sul fondo del tubo per gravità, rimuovi l'acqua rimanente.
- Aggiungere un volume uguale di acqua sterile al tubo contenente i semi per creare una sospensione di acqua e semi.
- Utilizzare una griglia di semina per distribuire uniformemente la sospensione di seme-acqua del genotipo dato sulle aree selezionate della piastra del terreno (Figura 2 e Figura 1 supplementare). Distribuire i semi (circa 30-40) in fila in ogni zona utilizzando una punta larga per pipetta.
- Lasciare asciugare l'acqua nelle aree di semina per circa 30 minuti, mantenendo le piastre aperte in una cappa a flusso laminare per evitare contaminazioni. Sigillare la piastra con nastro adesivo microporoso e avvolgerla con un foglio di alluminio.
- Stratificare i semi per 3 giorni a 4 °C al buio per (a seconda dell'ecotipo utilizzato) superare la dormienza del seme e/o favorire una germinazione uniforme.
- Trasferire la piastra con i semi stratificati alla luce bianca (150 μmol/m2/s) per 1 ora per indurre la germinazione (scartare la pellicola solo per il trattamento della luce).
- Dopo il trattamento con luce, avvolgere la piastra con un foglio di alluminio per proteggere i semi dalla luce e posizionarla in posizione verticale in una camera di crescita e coltivare per 4 giorni al buio a 21 °C.
3. Misurazione e analisi della fluorescenza della clorofilla
- Accendere il sistema iReenCAM e assicurarsi che il sistema sia pronto e configurato correttamente nel software del server PS avviato automaticamente (ad esempio, se c'è abbastanza spazio di archiviazione per i dati dell'esperimento, se la telecamera a fluorescenza è collegata al PC, ecc.).
- Attivare il software Scheduler per creare il piano sperimentale per la misurazione facendo clic su Esperimenti > Nuovo esperimento. Specificare un nome descrittivo per l'esperimento e inserire i dettagli (descrizione).
- Impostare le azioni necessarie per l'esperimento facendo clic su Aggiungi azione che condurrà alla pianificazione delle azioni sperimentali.
NOTA: La parola azione qui significa eseguire un esperimento completo (cioè, compresi tutti i passaggi necessari per eseguire una misurazione su piastra). - Specificare le condizioni per una singola misurazione circolare (ad esempio, la durata del periodo di luce/oscurità).
- Facendo clic su Genera elenco , definire gli intervalli di tempo tra i cicli di misurazione. Scegli l'ora in cui il round inizierà e finirà (4 ore in totale) e gli intervalli tra i round (nella configurazione attuale un round ogni 2 minuti).
- Fare clic su Genera e assicurarsi che l'intervallo di tempo e gli intervalli tra gli impulsi luminosi siano corretti controllando l'elenco generato sul lato sinistro dello schermo.
- Scegliere il protocollo di misurazione (Figura 2 supplementare). Salvare tutte le modifiche apportate al database per riferimento futuro.
- Poco prima dell'inizio della misurazione, utilizzare una luce verde di bassa intensità (vedere Tabella dei materiali) all'interno della camera oscura e regolare il livello del ripiano all'interno della camera di misura o eseguire altre fasi di preparazione prima di rimuovere la pellicola dalla piastra di Petri. Quindi spegnere la luce e trasferire le piastre nella camera di misurazione nella completa oscurità.
- Rimuovere con cautela il foglio di alluminio che copre la piastra di Petri contenente le piantine di 4 giorni. Posizionare la piastra di Petri orizzontalmente all'interno della camera di misura del dispositivo. All'interno della camera, indurre impulsi luminosi attinici ed eseguire l'imaging secondo il piano dell'esperimento (azioni) impostato nei passaggi 3.1-3.7.
NOTA: È fondamentale evitare qualsiasi illuminazione delle piastre con piantine eziolate prima di inserirle nella camera di misurazione. La manipolazione con la piastra con piantine eziolate deve essere eseguita in camera oscura (per un eventuale setup sperimentale vedi Figura 3 supplementare).
4. Estrazione e analisi dei dati
- Dopo aver completato la misurazione, aprire l'esperimento corrispondente nel software dell'analizzatore.
- Per analizzare la fluorescenza delle piantine, genera due tipi di maschere: una maschera ruvida (vassoio) che copre l'area in cui si trovano le piantine e una maschera precisa (pianta) che copre solo il tessuto di interesse (tipicamente cotiledoni).
- Generare una maschera di vassoio facendo clic sull'opzione Crea nuovo tipo di vassoio . Assegnare i nomi di genotipo appropriati alle rispettive aree sull'immagine della piastra.
- Per assegnare il genotipo, scegli un numero di immagine in Round e quindi fai clic su Carica immagine nella parte superiore dello schermo. L'immagine della targa verrà visualizzata sullo schermo. Facendo clic su uno qualsiasi dei pulsanti che rappresentano diversi strumenti di disegno delle forme (Figura 4 supplementare), accedere alla modalità Nuova forma che consente di disegnare l'area di interesse sull'immagine della lastra. Scegli le aree necessarie (ad esempio, diversi genotipi sul piatto) e fornisci la loro denominazione appropriata.
- Fare clic su Esc per uscire dalla modalità forma. Salvare la maschera del vassoio generata (dopo averle assegnato un nome) facendo clic su Memorizza tipo di vassoio.
- Tornate indietro di un passaggio e applicate la maschera generata nei passaggi precedenti selezionandone il nome dall'opzione Cambia per tipo di vassoio .
- Per generare una maschera vegetale con elevata precisione, utilizzare l'immagine acquisita dopo 180 minuti di misurazione (round 91) per impostare il valore di soglia minimo per l'intensità del segnale di fluorescenza, abilitando la sottrazione del rumore di fondo. A tale scopo, rimuovere il segno di spunta da Soglia automatica e impostare una Soglia manuale su 0 (Figura 4 supplementare).
- Fare clic su Anteprima per assicurarsi che la maschera del vassoio copra tutte le aree necessarie (genotipi) sull'immagine della piastra. A tale scopo, scegliete il round 91 e fate clic su Aggiorna anteprima.
- Accedere al menu Esegui facendo clic su Esegui. Eseguire l'analisi esclusivamente per il round 91 mettendo un segno di spunta solo sul round 91. Scegliete quindi il percorso di output e fate clic su Avvia analisi (Start Analysis).
- Al termine dell'analisi, si aprirà automaticamente il menu Fine. Selezionare il round eseguito (sarà l'unico) dagli esperimenti e fare clic su Passa analizzatore a dati analizzati per esportare i dati per questo punto temporale specifico (round 91).
- Estrarre il file .xsel dall'archivio esportato, poiché questo file contiene le informazioni essenziali sulla maschera vegetale, facendo clic sull'icona Apri parte di esportazione .
- Riaprire l'esperimento facendo clic sull'icona Apri parte di analisi locale . Entra di nuovo nel menu Mask Builder , fai clic su Carica immagine, scegli round 1 e poi Carica da file nell'angolo in alto a destra dello schermo e carica il file .xsel estratto in precedenza. L'immagine della lastra verrà visualizzata con la maschera vassoio applicata.
- Salvare la maschera facendo clic su Memorizza tipo vassoio e applicarla selezionandone il nome nell'opzione Cambia per tipo di vassoio .
- Generare la maschera vegetale regolando la soglia di intensità del segnale di fluorescenza. Aumentare il valore di Soglia manuale fino a quando la maschera generata nel menu Anteprima si adatta perfettamente al ROI (ad esempio, cotiledoni) in ciascuno dei genotipi (Figura 4 supplementare). Controlla se la maschera si adatta a tutti i giri delle misurazioni scorrendo i giri (controllare il corretto posizionamento della maschera al giro 1, 61 e 121 dovrebbe essere sufficiente) nel menu Anteprima .
- Eseguire l'analisi per tutti i cicli di misura ed esportare i dati.
NOTA: Il file di output include i valori di fluorescenza della clorofilla di un determinato genotipo per ogni punto temporale, consentendo la costruzione di grafici a scelta e facilitando un'ulteriore valutazione statistica.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
L'output tipico ottenuto utilizzando la procedura di nuova concezione nelle piantine di Arabidopsis deeziolate di 4 giorni di vita di tipo selvatico (WT), ecotipo Columbia-0 (Col-0) è mostrato nella Figura 3. In condizioni di controllo (terreni MS integrati con DMSO), la curva biosintetica della clorofilla inizia con un primo burst della sintesi clorofilliana, in cui il pool di protoclorofillidi sintetizzato durante la fase scotomorfogenica della crescita, viene rapidamente converti...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Passaggi critici del protocollo e risoluzione dei problemi: nessuna luce e prendersi cura della maschera
Come evidenziato direttamente nella descrizione del protocollo di cui sopra, è di fondamentale importanza evitare anche le tracce di luce sia durante la coltivazione delle piantine di piante eziolate che appena prima di iniziare il protocollo11. Nella nostra configurazione, utilizziamo una camera oscura dedicata situata nel fitotrone walk-in e separata dal resto del fitotron...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Z.B. e K.P. sono dipendenti del PSI e Martin Trtilek è CEO e proprietario della società PSI che produce l'iReenCAM. Tutti questi autori sono stati coinvolti nello sviluppo dello strumento come descritto in precedenza7.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo Europeo di Sviluppo Regionale-Progetto SINGING PLANT (n. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). Questo progetto è stato finanziato attraverso il progetto MSCA4Ukraine (ID 1233580), finanziato dall'Unione Europea. Siamo grati a Lenka Sochurkova per il design grafico della Figura 1.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 6-benzilamminopurina | Duchefa Biochemie | B0904.0001 | |
| Foglio di alluminio | Merck | Z691577 | |
| Arabidopsis thaliana Col-0 semi | NASC collezione | N1092 | |
| Camera di coltivazione | PSI | su misura | |
| Dimetilsulfoxide | Thermo Fisher Scientific | 042780.AK | |
| Eppendorf monocanale, variabile (100-1000 μ L) | Merck | EP3123000063 | |
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101 | |
| iReenCAM dispositivo | PSI | su misura/prototipo | |
| Bottiglie da laboratorio, con tappi (Duran), 100mL | Merck | Z305170-10EA | |
| Scatola a flusso laminare | UniGreenScheme | ITEM-31156 | |
| Nastro di giunzione in gomma linerless, larghezza 19 mm, nero, Scienza scozzese | 3M. Applicato a Life | 7000006085 | |
| Provetta per microcentrifuga, 2 mL con coperchio, PPT, MARCA | Merck | BR780546-500EA | |
| Nastro per micropori | 3M Science. Applicato a Life | 7100225115 | |
| Osram lumilux verde l18w/66 | Ovalamp | 200008833 | |
| piastre Petri - Piastre Greiner, quadrate, 120 x 120 x17mm, ventilate | Merck | Z617679-240EA | |
| Punte per pipette, 1000 μ L, Axygen | Merck | AXYT1000B | |
| PSI | l'analisi dei dati sullo schermo | dell'impianto fornito come parte di iReenCAM |
Riferimenti
- Arsovski, A. A., Galstyan, A., Guseman, J. M., Nemhauser, J. L. Photomorphogenesis. Arabidopsis Book. 10, e0147(2012).
- Reinbothe, S., Reinbothe, C., Apel, K., Lebedev, N. Evolution of chlorophyll biosynthesis--the challenge to survive photooxidation. Cell. 86 (5), 703-705 (1996).
- Heyes, D. J., et al. Photocatalysis as the 'master switch' of photomorphogenesis in early plant development. Nat Plants. 7 (3), 268-276 (2021).
- Hu, X. Y., Tanaka, A., Tanaka, R. Simple extraction methods that prevent the artifactual conversion of chlorophyll to chlorophyllide during pigment isolation from leaf samples. Plant Methods. 9 (1), 19(2013).
- Chazaux, M., Schiphorst, C., Lazzari, G., Caffarri, S. Precise estimation of chlorophyll a, b and carotenoid content by deconvolution of the absorption spectrum and new simultaneous equations for chl determination. Plant J. 109 (6), 1630-1648 (2022).
- Marr, I. L., Suryana, N., Lukulay, P., Marr, M. I. Determination of chlorophyll-a and chlorophyll-b by simultaneous multicomponent spectrophotometry. Fresenius J Anal Chem. 352 (5), 456-460 (1995).
- Balakhonova, V., et al. Ireencam: Automated imaging system for kinetic analysis of photosynthetic pigment biosynthesis at high spatiotemporal resolution during early deetiolation. Front Plant Sci. 14, 1093292(2023).
- Virgin, H. I., Kahn, A., Vonwettstein, D. The physiology of chlorophyll formation in relation to structural changes in chloroplasts. Photochem Photobiol. 2 (2), 83-91 (1963).
- Reinbothe, C., et al. Chlorophyll biosynthesis: Spotlight on protochlorophyllide reduction. Trends Plant Sci. 15 (11), 614-624 (2010).
- Kobayashi, K., Masuda, T. Transcriptional regulation of tetrapyrrole biosynthesis in arabidopsis thaliana. Front Plant Sci. 7, 1811(2016).
- Wang, Y., Folta, K. M. Contributions of green light to plant growth and development. Am J Bot. 100 (1), 70-78 (2013).
- Brzezowski, P., Richter, A. S., Grimm, B. Regulation and function of tetrapyrrole biosynthesis in plants and algae. Biochim Biophys Acta. 1847 (9), 968-985 (2015).
- Pipitone, R., et al. A multifaceted analysis reveals two distinct phases of chloroplast biogenesis during de-etiolation in arabidopsis. eLife. 10, e62709(2021).
- Stirbet, A. G. On the relation between the kautsky effect (chlorophyll a fluorescence induction) and photosystem ii: Basics and applications of the ojip fluorescence transient. J Photochem Photobiol B-Biol. 104 (1-2), 236-257 (2011).
- Kupper, H., et al. Analysis of ojip chlorophyll fluorescence kinetics and q(a) reoxidation kinetics by direct fast imaging. Plant Physiol. 179 (2), 369-381 (2019).
- Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
- Kósa, A., Preininger, É, Böddi, B. Nitrogen deficiency hinders etioplast development in stems of dark-grown pea (pisum sativum) shoot cultures. Physiol Plant. 155 (3), 330-337 (2015).
- Liang, Y., et al. A nondestructive method to estimate the chlorophyll content of arabidopsis seedlings. Plant Met. 13 (1), 26(2017).
- Pérez-Patricio, M., et al. Optical method for estimating the chlorophyll contents in plant leaves. Sensors. 18 (2), 650(2018).
- Spyroglou, I., et al. Mixed models as a tool for comparing groups of time series in plant sciences. Plants (Basel). 10 (2), (2021).
- Tanaka, R., Kobayashi, K., Masuda, T. Tetrapyrrole metabolism in arabidopsis thaliana. The Arabidopsis book / Am Soc Plant Biol. 9. 9, e0145(2011).
- De Wit, M., Galvao, V. C., Fankhauser, C. Light-mediated hormonal regulation of plant growth and development. Annu Rev Plant Biol. 67, 513-537 (2016).
- Liu, X., Li, Y., Zhong, S. Interplay between light and plant hormones in the control of arabidopsis seedling chlorophyll biosynthesis. Front Plant Sci. 8, 1433(2017).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
