Il protocollo descrive un metodo efficiente e affidabile per quantificare la lunghezza del poli(A) del gene di interesse dal sistema nervoso della Drosophila , che può essere facilmente adattato a tessuti o tipi cellulari di altre specie.
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Articolo metodologico
Misurazione della lunghezza della coda di Poly A dal cervello e dalla linea cellulare della larva di Drosophila
In questo articolo
Sommario
Abstract
La poliadenilazione è una modificazione post-trascrizionale cruciale che aggiunge code di poli(A) all'estremità 3' delle molecole di mRNA. La lunghezza della coda poli(A) è strettamente regolata dai processi cellulari. La disregolazione della poliadenilazione dell'mRNA è stata associata a un'espressione genica anomala e a varie malattie, tra cui cancro, disturbi neurologici e anomalie dello sviluppo. Pertanto, comprendere le dinamiche della poliadenilazione è fondamentale per svelare le complessità dell'elaborazione dell'mRNA e della regolazione genica post-trascrizionale.
Questo articolo presenta un metodo per misurare la lunghezza della coda di poli(A) in campioni di RNA isolati da cervelli larvali di Drosophila e cellule S2 di Drosophila Schneider. Abbiamo utilizzato l'approccio di coda della guanosina/inosina (G/I), che prevede l'aggiunta enzimatica di residui di G/I all'estremità 3' dell'mRNA utilizzando la poli(A) polimerasi del lievito. Questa modifica protegge l'estremità 3' dell'RNA dalla degradazione enzimatica. Le code protette in poli(A) a tutta lunghezza vengono quindi trascritte inversamente utilizzando un primer antisenso universale. Successivamente, l'amplificazione PCR viene eseguita utilizzando un oligo gene-specifico che ha come bersaglio il gene di interesse, insieme a un oligo di sequenza universale utilizzato per la trascrizione inversa.
Questo genera prodotti di PCR che comprendono le code di poli(A) del gene di interesse. Poiché la poliadenilazione non è una modifica uniforme e si traduce in code di lunghezza variabile, i prodotti PCR mostrano una gamma di dimensioni, portando a un modello di striscio sul gel di agarosio. Infine, i prodotti PCR vengono sottoposti a elettroforesi su gel capillare ad alta risoluzione, seguita da quantificazione utilizzando le dimensioni dei prodotti poly(A) PCR e del prodotto PCR gene-specifico. Questa tecnica offre uno strumento semplice e affidabile per l'analisi delle lunghezze della coda di poli(A), consentendoci di ottenere informazioni più approfondite sugli intricati meccanismi che regolano la regolazione dell'mRNA.
Introduzione
La maggior parte degli mRNA eucariotici sono post-trascrizionalmente poliadenilati al loro terminale 3′ nel nucleo mediante l'aggiunta di adenosine non modellate da poli(A) polimerasi canoniche. Una coda di poli(A) intatta è fondamentale per tutto il ciclo di vita dell'mRNA, in quanto è essenziale per l'esportazione nucleare dell'mRNA1, facilita l'interazione con le proteine che legano il poli(A) per migliorare l'efficienza traduzionale2 e conferisce resistenza alla degradazione3. In alcuni casi, la coda di poli(A) può anche subire un'estensione nel citoplasma, facilitata dalle poli(A) polimerasi ....
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Protocollo
1. Allevamento e selezione delle larve di Drosophila
- Mantenere/coltivare il ceppo di mosca (w1118, wildtype) su terreno di coltura standard a 25 °C in un'incubatrice umidificata.
- Selezionare 10 larve vaganti di 3° stadio 72 h dopo la deposizione delle uova.
- Mettere le larve in una capsula di Petri vuota da 35 mm e lavarle delicatamente trasferendole nella nuova capsula contenente l'acqua del rubinetto usando una pinza. Fallo 2 volte per rimuovere eventuali residui di cibo.
2. Isolamento cerebrale dalle
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Risultati
Qui, abbiamo analizzato la lunghezza della coda poli(A) di Dscam1 e GAPDH dai cervelli larvali di Drosophila (Figura 4). Gli RNA isolati sono stati visualizzati su un gel di agarosio per il controllo di qualità. Una singola banda di RNA di circa 600 nucleotidi indica una preparazione di RNA intatta (Figura 2A). Gli RNA sono stati sottoposti al tailing G/I e all'elettroforesi capillare ad alta risoluzione utilizzando un bioanalizzatore .......
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Discussione
In questo protocollo, descriviamo la tecnica per sezionare il cervello larvale di Drosophila dal 3° stadio di stadio errante e la preparazione del campione dalle cellule di Drosophila S2. A causa della natura labile degli mRNA, la raccolta dei campioni richiede particolare cautela. Per la dissezione cerebrale larvale, il cervello non deve essere danneggiato durante l'isolamento e non deve essere tenuto in soluzione per una durata prolungata. È essenziale mantenere il tempo di dissezione a 8-1.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato supportato dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke Grant R01NS116463 a J.K. e dalla struttura Cellular and Molecular Imaging Core presso l'Università del Nevada, Reno, che è stata supportata dal National Institutes of Health Grant P20GM103650 e utilizzata per la ricerca riportata in questo studio.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acido 3-(N-morfolino) propansulfonico (MOPS) | Intervista sui prodotti della ricerca (RPI) | M92020 | |
| Kit DNA ad alta sensibilità Agilent | Tecnologie Agilent | 5067-4626 | |
| Software Agilent 2100 expert download gratuito demo | Agilent Technologies | https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259 | |
| Apex 100 bp-Low DNA Ladder | Genesee Scientific | 19-109 | |
| Bioanalizzatore | Agilent 2100 Bioanalizzatore G2938C | ||
| Pirocarbonato di dietil (DEPC) | Internazionali di prodotti di ricerca (RPI) | D43060 | |
| Colorante DNA (colorante a caricamento di gel, viola (6x) | New England biolabs | Linea cellulare B7024S | |
| Drosophila S2 | Drosophila Genomics Resource Center stock #181 | ||
| Drosophila Schneider' s Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| Bromuro di Ehidium | Genesee scientific | 20-276 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Forcipe Dumont 5 | Strumenti di Fine Science | 11254-20 | |
| Acqua senza nucleasi | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| PBS 10x | Intervista sui prodotti di ricerca (RPI) | P32200 | |
| Kit di analisi della lunghezza della coda Poly(A) | Thermo Fisher Scientific | 764551KT | |
| RiboRuler Scala RNA a basso raggio | Thermo Fisher Scientific | SM1833 | |
| Colorante di caricamento in gel di RNA (2x) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | |
| Kit di microprep per RNA | Zymoresearch | R1050 | |
| kit miniprep per RNA | Zymoresearch | R1055 | |
| Forbici-Forbici a molla Vannas - 2,5 mm tagliente | Fine Science tools | 15000-08 | |
| TopVision Agarosio Compresse | Thermo Fisher Scientific | R2802 | |
| Tris-Acetato-EDTA (TAE) | Thermo Fisher Scientific | B49 |
Riferimenti
- Stewart, M. Polyadenylation and nuclear export of mRNAs. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 2977-2987 (2019).
- Machida, K., et al. Dynamic interaction of poly(A)-binding protein with the ribosome. Scientific Reports. 8 (1), 17435(2018).....
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Ristampe e permessi
