Articolo metodologico

Monitoraggio dell'evoluzione meccanica del tessuto durante la chiusura del tubo neurale dell'embrione di pulcino

DOI:

10.3791/66117

⸱

10 novembre 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Wayne State University, 2Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo è stato sviluppato per monitorare longitudinalmente le proprietà meccaniche del tessuto della placca neurale durante la neurulazione dell'embrione di pulcino. Si basa sull'integrazione di un microscopio Brillouin e di un sistema di incubazione sul palco, che consente l'imaging meccanico dal vivo del tessuto della placca neurale in embrioni di pulcino in coltura exovo .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La chiusura del tubo neurale (NTC) è un processo critico durante lo sviluppo embrionale. Il fallimento di questo processo può portare a difetti del tubo neurale, causando malformazioni congenite o addirittura la mortalità. L'NTC coinvolge una serie di meccanismi a livello genetico, molecolare e meccanico. Sebbene la regolazione meccanica sia diventata un argomento sempre più interessante negli ultimi anni, rimane in gran parte inesplorata a causa della mancanza di una tecnologia adeguata per condurre test meccanici del tessuto embrionale 3D in situ. In risposta, abbiamo sviluppato un protocollo per quantificare le proprietà meccaniche del tessuto embrionale di pollo in modo non invasivo e senza contatto. Ciò si ottiene integrando un microscopio confocale Brillouin con un sistema di incubazione sul palco. Per sondare la meccanica dei tessuti, un embrione pre-coltivato viene raccolto e trasferito in un'incubatrice sul palco per la coltura ex ovo . Allo stesso tempo, le immagini meccaniche del tessuto della placca neurale vengono acquisite dal microscopio Brillouin in diversi momenti durante lo sviluppo. Questo protocollo include descrizioni dettagliate della preparazione del campione, l'implementazione degli esperimenti di microscopia di Brillouin e la post-elaborazione e l'analisi dei dati. Seguendo questo protocollo, i ricercatori possono studiare longitudinalmente l'evoluzione meccanica del tessuto embrionale durante lo sviluppo.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I difetti del tubo neurale (NTD) sono gravi difetti congeniti del sistema nervoso centrale causati da errori nella chiusura del tubo neurale (NTC) durante lo sviluppo embrionale1. L'eziologia delle NTD è complessa. Gli studi hanno dimostrato che l'NTC coinvolge una sequenza di processi morfogenetici, tra cui l'estensione convergente, la flessione della placca neurale (ad esempio, la costrizione apicale), l'elevazione della piega neurale e infine l'adesione della piega neurale. Questi processi sono regolati da molteplici meccanismi molecolari e genetici 2,3 e qualsiasi malfunzionamento in questi processi può provocare NTD 4,5,6. Poiché prove crescenti suggeriscono che anche i segnali meccanici svolgono un ruolo cruciale durante le NTC 3,7,8,9,10,11 e sono state trovate relazioni tra geni e segnali meccanici 12,13,14, diventa imperativo studiare la biomeccanica dei tessuti durante la neurulazione.

Sono state sviluppate diverse tecniche per misurare le proprietà meccaniche dei tessuti embrionali, tra cui l'ablazione laser (LA)15, la dissezione e il rilassamento tissutale (TDR)16,17, l'aspirazione con micropipette (MA)18, la nanoindentazione basata sulla microscopia a forza atomica (AFM)19, i micropenetratori (MI) e le micropiastre (MP)20, la microreologia (MR) con pinzette ottiche/magnetiche 21,22,23e sensori basati su goccioline24. I metodi esistenti sono in grado di misurare le proprietà meccaniche a risoluzioni spaziali che vanno dalle scale subcellulari a quelle tissutali. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi sono invasivi perché richiedono il contatto con il campione (ad es. MA, AFM, MI e MP), l'iniezione di materiale esterno (ad es. MR e sensori basati su goccioline) o la dissezione tissutale (ad es. LA e TDR). Di conseguenza, è difficile per i metodi esistenti monitorare l'evoluzione meccanica del tessuto della placca neurale in situ25. Recentemente, l'elastografia a coerenza ottica riverberante si è dimostrata promettente per la mappatura meccanica senza contatto ad alta risoluzionespaziale 26.

La microscopia confocale Brillouin è una modalità ottica emergente che consente la quantificazione senza contatto della biomeccanica tissutale con risoluzione subcellulare 27,28,29,30. La microscopia di Brillouin si basa sul principio della diffusione spontanea della luce di Brillouin, che è l'interazione tra la luce laser incidente e l'onda acustica indotta dalle fluttuazioni termiche all'interno del materiale. Di conseguenza, la luce diffusa subisce uno spostamento di frequenza, noto come spostamento di Brillouin ωR, seguendo l'equazione31:

figure-introduction-1 (1)

Qui, è l'indice di rifrazione del materiale, figure-introduction-2 λ è la lunghezza d'onda della luce incidente, M' è il modulo longitudinale, ρ è la densità di massa e θ è l'angolo tra la luce incidente e la luce diffusa. Per lo stesso tipo di materiali biologici, il rapporto tra indice di rifrazione e densità figure-introduction-3 è approssimativamente costante 28,32,33,34,35,36. Pertanto, lo spostamento di Brillouin può essere utilizzato direttamente per stimare i cambiamenti meccanici relativi nei processi fisiologici. La fattibilità della microscopia di Brillouin è stata convalidata in vari campioni biologici 29,37,38. Recentemente, è stata dimostrata l'imaging meccanico time-lapse di un embrione di pulcino vivo combinando un microscopio Brillouin con un sistema di incubazione sul palco39. Questo protocollo fornisce descrizioni dettagliate della preparazione del campione, dell'implementazione dell'esperimento, della post-elaborazione e dell'analisi dei dati. Ci auguriamo che questo sforzo faciliti l'adozione diffusa della tecnologia Brillouin senza contatto per lo studio della regolazione biomeccanica nello sviluppo embrionale e nei difetti alla nascita.

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Protocollo

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Il protocollo è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Wayne State University.

1. Preparazione sperimentale

  1. Usa una soluzione di etanolo al 70% per pulire e sterilizzare le forbici e le pinzette. Inoltre, prepara pipette monouso e una siringa.
  2. Preparare un mezzo di lavaggio aggiungendo 3.595 g di NaCl a 495 ml di acqua deionizzata. Quindi, aggiungere 5 ml di Penicillina-Streptomicina (5 U/mL) al terreno. Riempire una capsula di Petri da 100 mm con il mezzo di lavaggio e riscaldarla a 37 °C.
  3. Preparare i piatti di coltura secondo la Figura 1, che illustra la configurazione generale.
    1. Preparare un pezzo di carta da filtro, tagliarlo in una forma rettangolare di circa 17 mm × 20 mm e rimuovere i quattro angoli. Creare un centro cavo nella carta da filtro, di circa 7 mm × 10 mm per fissare l'embrione (Figura 1, a sinistra).
      NOTA: La raccolta degli embrioni è descritta nella fase 2.
    2. Fissare un anello disponibile in commercio (Φ = 1 pollice, vedere la tabella dei materiali) con uno strato di pellicola flessibile (ad es. pellicola di paraffina), assicurandosi che anche la pellicola flessibile abbia un centro cavo. Questo anello con la pellicola servirà a contenere la carta da filtro con l'embrione.
    3. Infine, posizionare l'anello preparato in una capsula di Petri da 35 mm (Figura 1, a destra).
      NOTA: La carta da filtro serve per fissare e trattenere l'embrione estratto posizionando la carta da filtro sulla membrana e lasciando l'embrione nell'area cava centrale (che verrà descritta in dettaglio nel passaggio 2). I quattro angoli sono stati tagliati per adattarsi alle dimensioni dell'anello esterno (non necessario se è già montato). Viene utilizzata una piastra di coltura con fondo in vetro da 35 mm per una migliore propagazione del raggio laser. Il piatto ha un pozzetto interno (Φ = 23 mm), che può essere riempito con albume per la coltura ex ovo . Il diametro dell'anello deve essere maggiore del diametro del pozzetto interno in modo che il pozzetto possa essere coperto dalla pellicola flessibile sull'anello (Figura 1, riquadro). La dimensione della carta da filtro non è limitata e può essere modificata in base alle dimensioni dell'anello scelto e della piastra di coltura. In alternativa, il fondo del piatto può essere pre-rivestito con uno strato di agarosio (spessore: ~1 mm). Rimuovendo l'agarosio dal centro dello strato utilizzando una lama, è possibile creare un pozzetto con una forma simile al centro cavo del film flessibile per caricare l'albume. Un punto critico è che i quattro lati della carta da filtro cava devono avere una larghezza sufficiente (> 5 mm) per garantire l'adesione dell'embrione.

2. Estrazione ed ex ovocoltura dell'embrione di pollo

NOTA: questo passaggio è stato modificato rispetto ai report 40,41 pubblicati in precedenza.

  1. Dopo la pre-coltura, prelevare l'uovo dall'incubatrice e posizionarlo sul suo asse lungo sul vassoio del cartone delle uova. Pulite il guscio d'uovo con etanolo al 70%, avendo cura di coprire tutta la superficie, e poi lasciatelo riposare per 15 min.
  2. Tieni l'uovo sul suo asse corto e rompilo sul fondo. Aprire l'uovo su una capsula di Petri pulita da 100 mm per estrarne il contenuto, come illustrato nella Figura 2. Assicurati di non ruotare l'uovo mentre lo tieni e lo rompi.
  3. Utilizzando una pipetta, trasferire e raccogliere circa 10 mL di albume sottile (cioè l'albume liquido42) in una provetta da 15 mL per l'uso ex ovocoltura . Riempire il pozzetto centrale della piastra di coltura con l'albume sottile raccolto (circa 0,9 ml), come mostrato nella Figura 3. Il processo di riempimento deve essere lento, evitando la formazione di eventuali bolle all'interno del pozzetto. Assicurarsi che il piatto di coltura con albume sia riscaldato a 37 °C.
    NOTA: Questa parabola verrà utilizzata per la coltura dell'embrione ex ovo. Durante l'imaging di Brillouin verranno utilizzate nuove piastre di coltura riempite con terreno di lavaggio (vedere fase 3).
  4. Usando carta velina, rimuovere delicatamente l'albume denso (cioè l'albume viscoso) attaccato all'embrione separando con cura l'albume dalla membrana vitellina, come mostrato nella Figura 4. Evitare il contatto diretto con la membrana vitellina.
  5. Dopo aver rimosso tutto l'albume denso, fissare con cura la carta da filtro alla membrana vitellina. Assicurarsi che l'asse del corpo dell'embrione sia allineato con l'asse lungo del rettangolo centrale sulla carta da filtro. Usa le forbici per tagliare la membrana che circonda la carta da filtro.
  6. Usando una pinzetta, allontana delicatamente la carta da filtro isolata dal tuorlo in direzione obliqua. Capovolgere la carta da filtro per posizionare l'embrione con il lato dorsale rivolto verso il basso (per la configurazione al microscopio invertito). Immergere con cautela l'intera carta da filtro da un lato dell'asse lungo nella capsula di Petri da 100 mm con il mezzo di lavaggio in modo obliquo.
  7. Lavare via il tuorlo residuo spruzzando delicatamente il mezzo di lavaggio parallelamente alla carta da filtro utilizzando una pipetta pulita. Evitare di spruzzare direttamente il mezzo di lavaggio sulla membrana.
  8. Dopo aver eliminato tutto il tuorlo, rimuovere con cautela la carta da filtro dal mezzo di lavaggio e utilizzare carta velina per assorbire il mezzo in eccesso dai bordi. Quindi, posizionare la carta da filtro con l'embrione sulla piastra di coltura, assicurandosi che il lato dorsale dell'embrione sia rivolto verso il basso, come illustrato nella Figura 5. Per mantenere l'umidità, metti una carta velina inumidita nel piatto.
  9. Trasferire il piatto di coltura nell'incubatrice sul palco per la coltura ex ovo .

3. Misurazione di Brillouin dell'embrione

  1. Prepara un altro set di piatti di coltura e riempili con il terreno di lavaggio. Assicurarsi che il mezzo di lavaggio sia riscaldato a 37 °C.
  2. Quando l'embrione raggiunge lo stadio di sviluppo desiderato, trasferire la carta da filtro con l'embrione nella piastra di coltura riempita con il terreno di lavaggio. Posizionare la capsula di coltura nell'incubatrice sul tavolino del microscopio Brillouin (vedere Tabella dei materiali).
    1. Prima di eseguire la misurazione di Brillouin, salvare un'immagine in campo chiaro dell'intero embrione come riferimento. La configurazione dettagliata del microscopio Brillouin è stata descritta in precedenza30 ed è riassunta nella sezione Risultati (Figura 6).
  3. Misurare il segnale di Brillouin di acqua e metanolo, che verrà utilizzato nella fase 4 per il processo di calibrazione.
  4. Regolare la potenza del laser incidente e il tempo di esposizione della fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica a moltiplicazione di elettroni (EMCCD, vedere la tabella dei materiali) per ottenere almeno 10.000 conteggi del segnale di Brillouin. Utilizzando l'immagine in campo chiaro come guida, impostare l'intervallo di scansione e la dimensione del passo. Acquisire un'immagine di Brillouin della regione di interesse scansionando l'embrione utilizzando uno stadio traslazionale 2D.
    NOTA: L'intervallo di scansione orizzontale può essere determinato in base all'immagine in campo chiaro e l'intervallo di scansione verticale (cioè in profondità) può essere determinato in base alla potenza del segnale ottenuta da una scansione rapida e grossolana. Per evitare qualsiasi fotodanneggiamento dell'embrione, limitare la potenza incidente a 25 mW e impostare il tempo di esposizione della fotocamera EMCCD a 50 ms. È possibile scegliere una dimensione del passo di 2 μm in direzione orizzontale e 1 μm in direzione verticale per bilanciare la qualità dell'imaging e il tempo di acquisizione.
  5. Dopo aver completato la scansione, rimuovere con cautela la carta da filtro con l'embrione e utilizzare carta velina per assorbire il mezzo di lavaggio in eccesso. Quindi, rimetti la carta da filtro nel piatto di coltura pieno di albume sottile per la coltura continua nell'incubatrice sul palco.
  6. Ripetere i passaggi 3.2-3.5 a intervalli di tempo regolari (ad esempio, 1,5 ore) per acquisire immagini di Brillouin time-lapse durante lo sviluppo dell'embrione.
  7. Ricostruire l'immagine 2D di Brillouin seguendo il passaggio 4.

4. Ricostruzione dell'immagine di Brillouin

  1. Calibrare lo spettrometro Brillouin utilizzando i segnali Brillouin dell'acqua e del metanolo per calcolare l'intervallo spettrale libero (FSR) e il rapporto di conversione pixel-frequenza (PR) dello spettrometro30. I valori calibrati di FSR e PR saranno utilizzati per calcolare lo spostamento di Brillouin dell'embrione ad ogni pixel.
    NOTA: La Figura 7A mostra uno spettro di Brillouin grezzo catturato dalla telecamera EMCCD. Sommando verticalmente lo spettro e quindi eseguendo un fitting lorentziano, è possibile ottenere la distanza di picco Δd dei due punti (Figura 7B). Ottenendo la distanza di picco dell'acqua Δdacqua e metanolo Δdmetanolo, l'FSR e il PR possono essere calcolati in base alle equazioni30: PR = 2· (ωmetanolo-ω acqua)/(Δdacqua- Δdmetanolo) e FSR = 2·ωacqua + PR·Δdacqua, con il noto spostamento di Brillouin dell'acqua ωacqua = 6,01 GHz e metanolo ωmetanolo = 4,49 GHz a 660 nm.
  2. Ottenere la distanza di picco del segnale di Brillouin in corrispondenza di ciascun pixel del campione. Calcolare lo spostamento di Brillouin in base all'FSR calibrato e al PR:campione ω = 0,5 (FSR - PR xcampione Δd)30, dove ilcampione ω è lo spostamento di Brillouin del campione e ilcampione Δd è la distanza di picco del segnale di Brillouin.
  3. Ricostruisci l'immagine di Brillouin 2D in base agli spostamenti di Brillouin di tutti i pixel.
    NOTA: Per condurre un'analisi locale, è possibile selezionare una regione di interesse (ad esempio, la placca neurale) dall'immagine di Brillouin acquisita e quantificarne le proprietà meccaniche. Un approccio comune consiste nel calcolare lo spostamento medio di Brillouin della regione selezionata.

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Risultati

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La figura 6 mostra lo schema del microscopio Brillouin. Il sistema utilizza un laser a 660 nm come sorgente luminosa. Un isolatore viene posizionato subito dopo la testa laser per respingere qualsiasi luce retroriflessa e un filtro a densità neutra (ND) viene utilizzato per regolare la potenza del laser. Per espandere il raggio laser viene utilizzata una coppia di lenti, L1 e L2, con lunghezze focali rispettivamente di f1 = 16 mm e f2 = 100 mm. Una piastra a semionda (HWP) e un polarizzatore...

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Discussione

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Lo sviluppo precoce dell'embrione può essere facilmente influenzato da disturbi esterni. Pertanto, è necessaria la massima cautela durante l'estrazione e il trasferimento del campione. Un potenziale problema è il distacco dell'embrione dalla carta da filtro, che può portare al restringimento della membrana vitellina e provocare un artefatto inclinato della placca neurale nell'imaging di Brillouin. Inoltre, questo restringimento può arrestare lo sviluppo dell'embrione. È necessario prestare attenzione a diversi passaggi c...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è sostenuto dall'Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health (K25HD097288, R21HD112663).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra di Petri da 100 mm FisherbrandFB0875713
palcoscenico motorizzato 2D Prior ScientificH117E2
Piastra di Petri da 35 mmWorld Precision InstrumentsFD35-100
Microscopio Brillouin con incubatore su tavolinoN/AN/ASi tratta di un sistema di microscopio Brillouin costruito su misura basato su Ref. 30
Uova di gallinaUniversità del ConnecticutN/A
FotocameraCMOS ThorlabsCS2100M-USB
Telecamera EMCCDAndoriXon
EthanolDecon Laboratories, Inc.#2701
Carta da filtroWhatman1004-070
Incubatore per in ovo colturaGQF Manufacturing Company Inc.GQF 1502 
RingThorlabsSM1RR
Corpo del microscopioOlympusIX73
NaClSigma-AldrichS9888
Incubatore al palcoOko labsOKO-H301-PRIOR-H117
ParafilmBemisPM-996
Penicillina-StreptomicinaGibco15070-063
PipetteFisherbrand13-711-6M
ForbiciArtman instrumentsN/A3pc Micro Forbici 5
SiringheBD305482
Carta velinaKimwipesN/A
TuboCorning430052
PinzetteDR InstrumentsN/ASet di pinze per microdissezione

Riferimenti

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