Questo protocollo è stato sviluppato per monitorare longitudinalmente le proprietà meccaniche del tessuto della placca neurale durante la neurulazione dell'embrione di pulcino. Si basa sull'integrazione di un microscopio Brillouin e di un sistema di incubazione sul palco, che consente l'imaging meccanico dal vivo del tessuto della placca neurale in embrioni di pulcino in coltura exovo .
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Articolo metodologico
Monitoraggio dell'evoluzione meccanica del tessuto durante la chiusura del tubo neurale dell'embrione di pulcino
In questo articolo
Sommario
Abstract
La chiusura del tubo neurale (NTC) è un processo critico durante lo sviluppo embrionale. Il fallimento di questo processo può portare a difetti del tubo neurale, causando malformazioni congenite o addirittura la mortalità. L'NTC coinvolge una serie di meccanismi a livello genetico, molecolare e meccanico. Sebbene la regolazione meccanica sia diventata un argomento sempre più interessante negli ultimi anni, rimane in gran parte inesplorata a causa della mancanza di una tecnologia adeguata per condurre test meccanici del tessuto embrionale 3D in situ. In risposta, abbiamo sviluppato un protocollo per quantificare le proprietà meccaniche del tessuto embrionale di pollo in modo non invasivo e senza contatto. Ciò si ottiene integrando un microscopio confocale Brillouin con un sistema di incubazione sul palco. Per sondare la meccanica dei tessuti, un embrione pre-coltivato viene raccolto e trasferito in un'incubatrice sul palco per la coltura ex ovo . Allo stesso tempo, le immagini meccaniche del tessuto della placca neurale vengono acquisite dal microscopio Brillouin in diversi momenti durante lo sviluppo. Questo protocollo include descrizioni dettagliate della preparazione del campione, l'implementazione degli esperimenti di microscopia di Brillouin e la post-elaborazione e l'analisi dei dati. Seguendo questo protocollo, i ricercatori possono studiare longitudinalmente l'evoluzione meccanica del tessuto embrionale durante lo sviluppo.
Introduzione
I difetti del tubo neurale (NTD) sono gravi difetti congeniti del sistema nervoso centrale causati da errori nella chiusura del tubo neurale (NTC) durante lo sviluppo embrionale1. L'eziologia delle NTD è complessa. Gli studi hanno dimostrato che l'NTC coinvolge una sequenza di processi morfogenetici, tra cui l'estensione convergente, la flessione della placca neurale (ad esempio, la costrizione apicale), l'elevazione della piega neurale e infine l'adesione della piega neurale. Questi processi sono regolati da molteplici meccanismi molecolari e genetici 2,3 e qualsi....
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Protocollo
Il protocollo è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Wayne State University.
1. Preparazione sperimentale
- Usa una soluzione di etanolo al 70% per pulire e sterilizzare le forbici e le pinzette. Inoltre, prepara pipette monouso e una siringa.
- Preparare un mezzo di lavaggio aggiungendo 3.595 g di NaCl a 495 ml di acqua deionizzata. Quindi, aggiungere 5 ml di Penicillina-Streptomicina (5 U/mL) al terreno. Riempire una capsula di Petri da 100 mm con il mezzo di lavaggio e riscaldarla a 37 °C.
- Preparare i piatti di coltura secondo la Figura 1
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Risultati
La figura 6 mostra lo schema del microscopio Brillouin. Il sistema utilizza un laser a 660 nm come sorgente luminosa. Un isolatore viene posizionato subito dopo la testa laser per respingere qualsiasi luce retroriflessa e un filtro a densità neutra (ND) viene utilizzato per regolare la potenza del laser. Per espandere il raggio laser viene utilizzata una coppia di lenti, L1 e L2, con lunghezze focali rispettivamente di f1 = 16 mm e f2 = 100 mm. Una piastra a semionda (HWP) e un polarizzatore.......
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Discussione
Lo sviluppo precoce dell'embrione può essere facilmente influenzato da disturbi esterni. Pertanto, è necessaria la massima cautela durante l'estrazione e il trasferimento del campione. Un potenziale problema è il distacco dell'embrione dalla carta da filtro, che può portare al restringimento della membrana vitellina e provocare un artefatto inclinato della placca neurale nell'imaging di Brillouin. Inoltre, questo restringimento può arrestare lo sviluppo dell'embrione. È necessario prestare attenzione a diversi passaggi c.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è sostenuto dall'Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health (K25HD097288, R21HD112663).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra di Petri da 100 mm | Fisherbrand | FB0875713 | |
| palcoscenico motorizzato 2D | Prior Scientific | H117E2 | |
| Piastra di Petri da 35 mm | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Microscopio Brillouin con incubatore su tavolino | N/A | N/A | Si tratta di un sistema di microscopio Brillouin costruito su misura basato su Ref. 30 |
| Uova di gallina | Università del Connecticut | N/A | |
| Fotocamera | CMOS Thorlabs | CS2100M-USB | |
| Telecamera EMCCD | Andor | iXon | |
| Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | #2701 | |
| Carta da filtro | Whatman | 1004-070 | |
| Incubatore per in ovo coltura | GQF Manufacturing Company Inc. | GQF 1502 | |
| Ring | Thorlabs | SM1RR | |
| Corpo del microscopio | Olympus | IX73 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Incubatore al palco | Oko labs | OKO-H301-PRIOR-H117 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Penicillina-Streptomicina | Gibco | 15070-063 | |
| Pipette | Fisherbrand | 13-711-6M | |
| Forbici | Artman instruments | N/A | 3pc Micro Forbici 5 |
| Siringhe | BD | 305482 | |
| Carta velina | Kimwipes | N/A | |
| Tubo | Corning | 430052 | |
| Pinzette | DR Instruments | N/A | Set di pinze per microdissezione |
Riferimenti
- Greene, N. D. E., Copp, A. J. Neural tube defects. Annual Review of Neuroscience. 37 (1), 221-242 (2014).
- Suzuki, M., Morita, H., Ueno, N. Molecular mechanisms of cell shape changes that contribute to vertebrate neural tube closure. Development, Growth....
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Ristampe e permessi
