Differenziazione delle linee del sistema nervoso enterico dalle cellule staminali pluripotenti umane

Sommario

La derivazione di linee del sistema nervoso enterico (ENS) da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) fornisce una fonte scalabile di cellule per studiare lo sviluppo e la malattia dell'ENS e per l'uso nella medicina rigenerativa. Qui viene presentato un protocollo dettagliato in vitro per derivare neuroni enterici da hPSC utilizzando condizioni di coltura chimicamente definite.

Abstract

Il sistema nervoso enterico umano, ENS, è una vasta rete di tipi di cellule gliali e neuronali con una notevole diversità di neurotrasmettitori. L'ENS controlla la motilità intestinale, la secrezione enzimatica e l'assorbimento dei nutrienti e interagisce con il sistema immunitario e il microbioma intestinale. Di conseguenza, i difetti dello sviluppo e acquisiti dell'ENS sono responsabili di molte malattie umane e possono contribuire ai sintomi del morbo di Parkinson. Le limitazioni nei sistemi modello animale e l'accesso al tessuto primario pongono sfide sperimentali significative negli studi sull'ENS umano. Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per un'efficace derivazione in vitro dei lignaggi ENS da cellule staminali pluripotenti umane, hPSC, utilizzando condizioni di coltura definite. Il nostro protocollo inizia con la differenziazione diretta delle hPSC in cellule della cresta neurale enterica entro 15 giorni e produce diversi sottotipi di neuroni enterici funzionali entro 30 giorni. Questa piattaforma fornisce una risorsa scalabile per studi sullo sviluppo, modellazione di malattie, scoperta di farmaci e applicazioni rigenerative.

Introduzione

Il sistema nervoso enterico (ENS) è il componente più grande del sistema nervoso periferico. L'ENS contiene più di 400 milioni di neuroni che si trovano all'interno del tratto gastrointestinale e controllano quasi tutte le funzioni dell'intestino¹. La comprensione molecolare dello sviluppo e della funzione dell'ENS e dei suoi difetti nelle neuropatie enteriche richiede l'accesso a una fonte affidabile e autentica di neuroni enterici. L'accesso al tessuto primario umano è limitato e i modelli animali non riescono a ricapitolare i fenotipi chiave della malattia in molte neuropatie enteriche. La tecnologia delle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) si è dimostrata estremamente vantaggiosa nel fornire una fonte illimitata dei tipi di cellule desiderate, in particolare quelle che sono difficili da isolare da fonti primarie 2,3,4,5,6,7. Qui, forniamo i dettagli di un metodo in vitro graduale e robusto per ottenere colture ENS da hPSC. Queste colture scalabili derivate da hPSC aprono la strada per studi sullo sviluppo, modellazione della malattia e screening di farmaci ad alto rendimento e possono fornire cellule trapiantabili per la medicina rigenerativa.

Le linee neuronali enteriche derivano dalle cellule della cresta neurale (NC) che seguono il percorso di sviluppo dell'ENS durante l'embriogenesi. Negli embrioni, le cellule NC emergono lungo i margini della placca neurale ripiegata. Proliferano, migrano e danno origine a molti tipi di cellule diverse, tra cui neuroni sensoriali, cellule di Schwann, melanociti, scheletro craniofacciale e neuroni enterici e glia ^8,9,10. La decisione sul destino cellulare dipende dalla regione distinta lungo l'asse antero-posteriore da cui emergono le cellule NC, cioè NC cranica, NC vagale, NC del tronco e NC sacrale. L'ENS si sviluppa da cellule NC vagali e sacrali, con le prime che dominano la popolazione dei neuroni enterici a causa dell'estesa migrazione lungo la lunghezza dell'intestino e colonizzano l'intestino¹¹.

La derivazione di cellule NC da PSC comporta comunemente una combinazione di doppia inibizione SMAD e attivazione della via WNT^12,13. Fino a poco tempo fa, tutti i protocolli di induzione NC coinvolgevano siero e altri additivi di prodotti animali nelle condizioni di coltura. I terreni chimicamente indefiniti non solo riducono la riproducibilità dell'induzione di NC, ma mettono anche in discussione gli studi meccanicistici sullo sviluppo. Per superare queste sfide, Barber et al¹⁴ hanno sviluppato un protocollo di induzione NC utilizzando condizioni di coltura chimicamente definite ed è stato quindi vantaggioso rispetto ai metodi alternativi che si basano su fattori di sostituzione del siero (ad esempio, KSR)^13,14. Questo è stato ottenuto mediante sostituzioni di terreni basali e ottimizzando un protocollo originariamente presentato da Fattahi et al per derivare cellule NC enteriche da hPSC. Questo sistema migliorato è la base del protocollo di differenziazione hPSC qui presentato. Inizia con l'induzione delle cellule della cresta neurale enterica (ENC) in un periodo di 15 giorni mediante una modulazione precisa della segnalazione BMP, FGF, WNT e TGFβ oltre all'acido retinoico (RA). Quindi deriviamo i lignaggi ENS trattando le cellule con il fattore neurotrofico derivato dalla linea cellulare gliale (GDNF). Tutte le composizioni dei terreni sono chimicamente definite e producono robuste colture neuronali enteriche entro 30-40 giorni.

Oltre al sistema di coltura cellulare monostrato qui descritto, sono stati sviluppati approcci alternativi di induzione NC che utilizzano corpi embrioidi liberi fluttuanti^15,16. È stato dimostrato che le cellule migratorie in queste colture esprimono marcatori NC con un sottogruppo che rappresenta la NC vagale. Le co-colture con tessuto intestinale primario sono state utilizzate per arricchire i precursori enterici della NC in queste colture. Le composizioni dei media in questi studi contengono una combinazione di diversi fattori come il fattore di crescita nervoso, NT3 e il fattore neurotrofico derivato dal cervello. In questa fase, non è del tutto chiaro come questi fattori possano influenzare le identità di impegno dei precursori dei neuroni enterici. Per un confronto efficiente dell'induzione enterica delle NC nel monostrato e nelle colture basate su corpi embrioidi sono necessari ulteriori dati. Dati i diversi layout culturali in queste strategie, l'uso di ciascun metodo dovrebbe essere considerato e ottimizzato in base all'applicazione specifica in mente.

Il protocollo qui presentato è riproducibile ed è stato testato con successo da noi e da altri utilizzando diverse linee di hPSC (indotte ed embrionali) ^8,14,16.

Protocollo

1. Preparazione dei terreni

NOTA: Le concentrazioni menzionate nel protocollo sono concentrazioni finali dei componenti del fluido. Preparare tutti i terreni in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare e conservarli a 4 °C al buio. Utilizzare entro 2 settimane.

1. Terreno di mantenimento hPSC: Miscelare l'integratore di terreno di mantenimento hPSC senza alimentatore (20 μL/mL) con il suo terreno di base.
2. Terreno A: aggiungere la proteina morfogenetica ossea 4 (BMP4; 1 ng/mL), SB431542 (10 μM) e CHIR99021 (600 nM) al terreno di base di differenziazione.
3. Mezzo B: aggiungere SB431542 (10 μM) e CHIR99021 (1,5 μM) al mezzo di base di differenziazione.
4. Mezzo C: aggiungere SB431542 (10 μM), CHIR99021 (1,5 μM) e RA (1 μM) al mezzo di base di differenziazione.
5. Terreno completo della cresta neurale (NCC): aggiungere FGF2 (10 ng/mL), CHIR99021 (3 μM), integratore di N2 (10 μL/mL), integratore di B27 (20 μL/mL), integratore di L-glutammina (10 μL/mL) e MEM NEAAs (10 μL/mL) al terreno neurobasale.
6. ENC Medium: aggiungere GDNF (10 ng/mL), acido ascorbico (100 μM), integratore di N2 (10 μL/mL), integratore di B27 (20 μL/mL), integratore di L-glutammina (10 μL/mL) e MEM NEAAs (10 μL/mL) al terreno neurobasale.
7. Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) 1x: diluire 500 mM di EDTA (1000x) a una concentrazione finale di 500 μM in PBS.
   NOTA: Utilizzare PBS libero da Ca²⁺ e Mg²⁺ in tutto questo protocollo, se non diversamente specificato.

2. Rivestimento di piastre di coltura

1. Piastre rivestite con matrice di membrana basale: Scongelare rapidamente e diluire un'aliquota congelata da 500 μl di matrice di membrana basale in 50 mL di DMEM:F12 refrigerato mediante pipettaggio energico con una pipetta sierologica da 50 mL. Rivestire i pozzetti con la soluzione diluita della matrice della membrana basale (100 μl per cm² di superficie del pozzetto) e incubarli per una notte a 37 °C. Aspirare il mezzo di rivestimento prima dell'uso. Per prevenire la gelatinizzazione della matrice della membrana basale, eseguire questo passaggio il più rapidamente possibile e utilizzare DMEM:F12 freddo per sciogliere l'aliquota congelata.
   NOTA: La temperatura della matrice della membrana basale deve essere mantenuta fredda durante lo scongelamento (su ghiaccio) e l'aliquotazione (provette su ghiaccio) per prevenire la coagulazione.
2. Piastre rivestite di PO/FN/laminina: Preparare una soluzione di poliornitina (PO) da 15 μg/mL in PBS diluendo un stock 1000x. Rivestire i pozzetti con 100 μL di soluzione PO/PBS per cm² di superficie del pozzetto e incubare le piastre per una notte a 37 °C. Il giorno seguente, aspirare PO/PBS e rivestire i pozzetti a 100 μL per cm² di superficie del pozzetto con una soluzione di FN/laminina/PBS appena preparata contenente 2 μg/mL di fibronectina (FN) e 2 μg/mL di laminina. Le piastre possono essere utilizzate dopo un minimo di 2 ore di incubazione a 37 °C. Aspirare FN/laminina/PBS prima dell'uso.

3. Mantenimento della coltura hPSC

NOTA: Tutte le fasi di incubazione delle cellule sono al 5% di CO₂ e a 37 °C in un incubatore umidificato.

1. Aspirare il terreno hPSC dalla coltura hPSC e aggiungere terreno fresco (200 μL per cm² di superficie del pozzetto) a giorni alterni fino a quando le colonie sono ~80% confluenti.
2. Per il passaggio, aspirare il terreno hPSC e lavare le celle con 100 μL di PBS per cm² di superficie del pozzetto.
   NOTA: È importante utilizzare PBS libero da Ca²⁺ e Mg²⁺ per lavare le cellule.
3. Aggiungere 500 μM di EDTA (100 μl per cm² di superficie del pozzetto). Riposizionare il coperchio della piastra. Osserva attraverso un microscopio invertito e monitora le cellule per il distacco dei bordi della colonia (2-4 minuti).
4. Utilizzare una pipetta sierologica da 5 o 10 ml per trasferire lo stesso volume di terreno hPSC in ciascun pozzetto e raccogliere meccanicamente le cellule pipettando su e giù alcune volte.
   NOTA: Il tempo di incubazione ottimale dell'EDTA dipende dalla linea iPSC. Evitare un pipettaggio vigoroso per il distacco delle colonie, in quanto può portare a un'eccessiva dissociazione delle colonie e alla morte cellulare. Quando si passa per iniziare una piastra di differenziazione, incubare le cellule con EDTA per 1-2 minuti in più.
5. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL. Centrifugare le cellule (2 min, 290 x g, 20-25 °C) ed eliminare con cura il surnatante.
6. Risospendere le cellule in un volume appropriato di terreno hPSC e trasferirle nei pozzetti di una nuova piastra rivestita di matrice di membrana basale.
   NOTA: Per la manutenzione regolare dell'hPSC utilizzare un rapporto di passaggio 1:18 - 1:24 (1:18 significa trasferire un terzo delle cellule dissociate da un singolo pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in una nuova piastra completa). Per iniziare una piastra di differenziazione, seguire un rapporto di passaggio 5:6.
7. Incubare al 5% di CO₂ e 37 °C.

4. Induzione della cresta neurale

NOTA: Questo passaggio è rappresentato schematicamente nella Figura 1A. Inizia la differenziazione NC quando le cellule sono confluenti per circa l'80%. Ciò si otterrà entro 1-2 giorni quando le cellule vengono fatte passare con un rapporto 5:6 (vedi sopra). Iniziare la differenziazione NC il giorno 0 con cellule hPSC pluripotenti e completamente indifferenziate. Per un'elevata efficienza, i bordi delle colonie dovrebbero avere celle di differenziazione minime. Passaggio e piastra hPSC per la differenziazione quando le colonie sono grandi o il centro della colonia inizia ad ispessirsi/scurirsi se monitorato con un microscopio invertito. Prestare attenzione alla confluenza e alla morfologia tende ad essere più affidabile del numero di cellule piastre, poiché questo può variare a seconda della linea cellulare e può variare da 50.000 a 200.000 per cm².

1. Il giorno 0, sostituire il terreno di mantenimento hPSC con un terreno A contenente 1 ng/mL di BMP4, 10 μM SB431542, 600 nM CHIR99021 (200 μL di terreno per cm² di superficie del pozzetto).
2. Il giorno 2, le cellule dovrebbero essere confluenti al 100%. Aspirare delicatamente il terreno A esaurito e alimentare le cellule con il terreno B contenente 10 μM di SB431542, 1,5 μM CHIR99021 (200 μl di terreno per cm² di superficie del pozzetto).
   NOTA: Man mano che le colture crescono durante l'induzione NC, le cellule possono staccarsi dal monostrato sottostante. Evitare l'eccessiva perdita di cellule rimuovendo delicatamente i vecchi terreni e aggiungendo nuovi terreni sul lato del pozzetto.
3. Il giorno 4, alimentare nuovamente le celle con il terreno B (200 μl di terreno per cm² di superficie del pozzetto).
4. Il giorno 6, sostituire il terreno B con il terreno C contenente 10 μM di SB431542, 1,5 μM di CHIR99021 e 1 μM di acido retinoico (400 μl di terreno per cm² di superficie del pozzetto).
5. Nei giorni 8 e 10, somministrare come giorno 6.

5. Formazione di sferoidi ENC

NOTA: Questo passaggio è rappresentato schematicamente nella Figura 1B.

1. Il giorno 12, aspirare delicatamente il terreno C e lavare le celle con 100 μl di PBS per cm² di superficie del pozzetto. Aggiungere lo stesso volume di soluzione di distacco cellulare e incubare per 30 minuti al 5% di CO₂ e 37 °C.
2. Diluire la soluzione di distacco cellulare aggiungendo lo stesso volume di terreno NCC contenente 10 ng/mL di FGF2, 3 μM di CHIR99021, 10 μL/mL di integratore di N2, 20 μL/mL di integratore di B27, 10 μL/mL di L-glutammina e 10 μL/mL di MEM NEAA. Utilizzando una pipetta sierologica, prelevare la sospensione di una singola cellula e aggiungerla a una provetta conica da 15 mL.
3. Centrifugare le cellule (2 min, 290 x g, 20-25 °C) ed eliminare con cura il surnatante.
4. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, aggiungere 12 mL (per una piastra completa a 6 pozzetti) di terreno NCC e risospendere completamente le cellule pipettando meccanicamente su e giù 1-2 volte. Trasferire la sospensione cellulare su una piastra di fissaggio ultrabassa.
   NOTA: Circa 10 cm² di cellule monostrato ENC vengono risospese in 2 mL di terreno NCC e trasferite in un pozzetto di una piastra di attacco ultra-bassa. Ciò equivale a una piastra di induzione NC a 6 pozzetti completa trasferita in una piastra di attacco ultra-bassa a 6 pozzetti.
5. Il giorno 14, agitare delicatamente le piastre fino a quando piccoli sferoidi non si sono raccolti al centro di ogni pozzetto. Utilizzando una micropipetta P1000 e con un lento movimento circolare, aspirare il terreno NCC esaurito attorno alla circonferenza di ciascun pozzetto. Cerca di evitare di rimuovere gli sferoidi fluttuanti.
6. Alimentare le cellule con il volume originale di terreno NCC.

6. Induzione EN

NOTA: Questo passaggio è rappresentato schematicamente nella Figura 1B.

1. Il giorno 15, applicare la stessa tecnica utilizzata il giorno 14 per rimuovere delicatamente il terreno e lavare gli sferoidi con PBS. Rimuovi quanto più PBS possibile evitando gli sferoidi.
2. Aggiungere la soluzione di distacco cellulare (100 μL per cm² di superficie del pozzetto) e dissociare gli sferoidi in singole cellule incubando per 30 minuti al 5% di CO₂ e 37 °C.
3. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, aggiungere un volume uguale di terreno ENC (contenente 10 ng/mL di GDNF, 100 μM di acido ascorbico, 10 μL/mL di integratore di N2, 20 μL/mL di integratore di B27, 10 μL/mL di L-glutammina e 10 μL/mL DI MEM NEAA in terreno neurobasale) a ciascun pozzetto e rompere gli sferoidi rimanenti con 2-3 cicli di pipettaggio meccanico. Trasferire le cellule in una provetta conica da 50 mL.
   NOTA: Evitare l'eccessivo stress e la morte cellulare che possono verificarsi a causa del pipettaggio forzato o dell'uso di pipette con apertura del puntale più piccola.
4. Centrifugare le cellule (2 min, 290 x g, 20-25 °C) ed eliminare con cura il surnatante. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, aggiungere ~ 5-10 mL di terreno ENC e risospendere completamente le cellule pipettando su e giù 1-2 volte.
5. Contare la concentrazione di cellule vitali utilizzando il blu di tripano e un metodo di conteggio delle cellule come un emocitometro.
   ATTENZIONE: Il blu di tripano è un sospetto cancerogeno. Maneggiare con cura, smaltire in modo appropriato.
6. Aggiungere un volume sufficiente di terreno ENC con l'obiettivo di piastrare circa 300.000-400.000 cellule vitali per cm² di superficie a una densità di circa ~ 1.000.000 di cellule per mL. Aspirare la soluzione FN/laminina/PBS dai pozzetti della piastra.
   NOTA: Scegliere il formato della piastra in base ai saggi pianificati per le colture EN, poiché questa fase segna la fase finale di ri-placcatura del protocollo. I progenitori dei neuroni enterici possono essere congelati il giorno 15. Dopo aver dissociato le sfere con la soluzione di distacco cellulare, risospendere i progenitori a circa 5 x 10⁶ cellule/mL in mezzo di congelamento come DMSO al 10% o Stem-cellbanker. Se necessario, scongelare in terreno ENC caldo con l'inibitore ROCK Y-27632 da 5 μM. Piastre nel formato di piastra desiderato. Sostituire il supporto con un nuovo ENC dopo un paio d'ore.
7. Aggiungere delicatamente le cellule nei pozzetti rivestiti di PO/FN/laminina. Evitare che le bolle rimangano intrappolate sotto la sospensione cellulare impedendo l'adesione delle cellule al rivestimento PO/FN/laminina, soprattutto quando si utilizzano piastre con pozzetti di dimensioni inferiori come le piastre a 384 pozzetti. Questo potrebbe portare alla morte cellulare.
8. Alimentare le celle a giorni alterni con terreno ENC (200 μL per cm² di superficie del pozzetto) fino al giorno 30-40, dopodiché ridurre la frequenza di alimentazione (a una o due volte alla settimana) ma raddoppiare il volume di alimentazione (a 400 μL di terreno per cm² di superficie del pozzetto).
   NOTA: Questo è importante in quanto un'eccessiva rimozione e aggiunta di terreni potrebbe facilitare il distacco della coltura neuronale dalla superficie dei pozzetti. Per prevenire in modo prospettico il distacco, soprattutto per le colture a lungo termine, integrare ENC con FN (2 μg/mL) e laminina (2 μg/mL) una volta alla settimana.

Risultati

Questo protocollo fornisce un metodo per derivare la cresta neurale enterica e i neuroni enterici dalle hPSC utilizzando condizioni di coltura chimicamente definite (Figura 1A-B). La generazione di neuroni di alta qualità dipende da un'efficiente fase di induzione della cresta neurale enterica. Questo può essere valutato visivamente controllando la morfologia delle sfere fluttuanti che dovrebbero apparire rotonde con superfici lisce con una dimensione di circa 0,1 - 0,4 mm, come mostrato nella Figura 1C. Questi sferoidi dovrebbero anche esprimere il fattore di trascrizione SRY-Box 10 (SOX10)^17,18, come si può vedere nella Figura 1D. Durante la fase di induzione dei neuroni enterici, i neuriti possono diventare visibili già dal giorno 25-30 (Figura 1E). Tuttavia, questo può essere ritardato nelle differenziazioni con un'efficienza inferiore contenente contaminazioni cellulari mesenchimali indesiderate. Il sistema nervoso enterico umano è un insieme di neuroni diversi che esprimono diversi neurotrasmettitori. Questa eterogeneità è ricapitolata nel protocollo in vitro fornito e l'espressione di marcatori chiave può essere valutata con metodi di colorazione cellulare come l'imaging a immunofluorescenza e la citometria a flusso secondo i protocolli precedentemente descritti 13,14,19,20,21 (Figura 1F,G).

Figura 1: Derivazione di cellule ENC umane e sottotipi di neuroni enterici da hPSC. (A) Induzione della cresta neurale enterica (ENC) da hPSC. Protocollo (giorni 0-12) che mostra le composizioni dei terreni per derivare le cellule ENC dalle hPSC. (B) Formazione di sferoidi ENC e induzione di neuroni enterici dal protocollo ENC. (giorni 12-15) che mostra una composizione media per la formazione di sferoidi ENC. Successivamente, i neuroni enterici vengono generati e maturati trattandoli con un terreno contenente GDNF e AA. (C) Immagini rappresentative a contrasto di fase di hPSC differenziate in diversi punti temporali del protocollo. Barra della scala: 1000 μM. (D) SOX10::GFP che esprime sferoidi ENC derivati da H9 iPSC il giorno 14. Barra della scala: 1000 μm. (E) Immagine di contrazione di fase dei neuroni del giorno 33. Barra della scala: 400 μm. (F-G) Imaging in immunofluorescenza (F) e citometria a flusso (G) di marcatori di neurotrasmettitori nei neuroni del giorno 40. Barra di scala: 50 μm. Abbreviazioni: BMP4 = proteina BMP4 umana ricombinante; RA = acido retinoico; FGF2 = FGF umano ricombinante basico; GDNF = fattore neurotrofico ricombinante derivato da linee cellulari gliali umane; AA = acido ascorbico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il protocollo di differenziazione qui descritto fornisce un robusto metodo in vitro per ottenere neuroni enterici da hPSC entro 30-40 giorni (Figura 1E) e glia enterica che esprimono proteina acida fibrillare gliale, GFAP e SOX10 in colture più vecchie (> giorno 55)13,14,19,22. Questi neuroni e la glia sono indotti dalla differenziazione graduale delle hPSC in cellule della cresta neurale vagale ed enterica seguite dai progenitori enterici dei neuroni e della glia^13,14. Le cellule della cresta neurale esprimono marcatori della cresta neurale, fattore di trascrizione AP-2 alfa e beta, TFAP2A e TFAP2B, rispettivamente²¹. In precedenza abbiamo dimostrato che il CD49 può essere utilizzato come marcatore per indicare l'efficienza delle cellule della cresta neurale derivate da hPSC¹⁴. L'efficienza e il successo di questo metodo dipendono da una combinazione di fattori. Innanzitutto, è fondamentale eseguire tutti i passaggi in condizioni sterili. L'analisi delle colture di hPSC per la contaminazione da micoplasma è importante in quanto può influenzare negativamente la crescita delle cellule staminali e non è rilevabile visivamente. In secondo luogo, l'uso di piastre rivestite in modo uniforme e corretto riduce la possibilità di crescita irregolare della coltura di hPSC e il distacco delle colture NC e dei neuroni più vecchi dalla superficie dei pozzetti. In terzo luogo, per un'elevata efficienza nel differenziamento è essenziale iniziare con cellule hPSC pluripotenti e completamente indifferenziate. Le colonie di hPSC dovrebbero avere cellule differenzianti minime ai bordi della colonia. Le hPSC devono essere fatte passare o piastrate per la differenziazione quando le colonie sono grandi o il centro della colonia inizia ad ispessirsi/scurirsi di colore, come osservato attraverso un microscopio a contrasto di fase. Le cellule differenziate indesiderate (di solito cellule mesenchimali), non solo riducono l'efficienza di differenziazione complessiva, ma possono provocare il distacco dei neuroni dalla superficie del pozzetto man mano che le colture invecchiano. Si raccomanda quindi di monitorare attentamente le colture ENC nei primi 15 giorni. In condizioni di differenziazione efficiente, sulla superficie della coltura compaiono dischi scuri ~ giorno 6, il che indica un'efficiente formazione di sferoidi nei giorni 12-15. Inoltre, nella fase sferoidale (giorno 12-15) le sfere fluttuanti dovrebbero avere superfici lisce (Figura 1D). Mantenere la fase sferoidale 3D nei giorni 12-15 è generalmente sufficiente per migliorare la purezza delle ENC per la differenziazione a valle delle colture in linee ENS. Tuttavia, per gli studi che richiedono popolazioni precoci e pure di cellule progenitrici ENC, si raccomanda la FACS con CD49D. CD49D è un marcatore di superficie specifico per le linee NC derivate da SOX10:hPSC ed è stato utilizzato con successo in linee cellulari^13,14. Per ulteriori informazioni sull'isolamento delle cellule CD49D+ utilizzando FACS e raccomandazioni sulla strategia di gating, i lettori possono fare riferimento all'articolo di Barber et al, Figura 2D, Box1 e Figura supplementare 6¹⁴. In quarto luogo, per massimizzare l'efficienza, la differenziazione dovrebbe iniziare quando le colture hPSC sono monostrato e ~80% confluenti. Ciò significa avere una cultura completamente confluente il giorno 2. Una confluenza più bassa influisce negativamente sull'efficienza e colture molto dense tendono ad avere un tasso più elevato di morte cellulare e possono potenzialmente portare all'emergere di cellule differenziate indesiderate.

Il riposizionamento delle celle il giorno 15 segna un passo importante in questo protocollo. Questa è l'ultima fase di trasferimento cellulare per una coltura neuronale monostrato e quindi il layout della piastra deve essere scelto in base ai saggi pianificati. Il numero di cellule trasferite in ciascun pozzetto può influenzare notevolmente la diversità neuronale e i neuroni più vecchi che rimangono attaccati alla superficie dei pozzetti. In generale, è auspicabile una densità cellulare nell'intervallo di 250.000-350.000 cellule per cm² (circa 75.000-100.000 celle per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti o 500.000-700.000 per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti). A partire dal giorno 30-40, si potrebbe prendere in considerazione l'aggiunta di fibronectina e laminina al mezzo di alimentazione (non più di una volta alla settimana) per prevenire in modo prospettico il distacco dei neuroni, soprattutto per le cellule pianificate per colture neuronali più lunghe. A questo punto si consiglia di ridurre la frequenza di alimentazione a una volta ogni 5-7 giorni e di lasciare un po' di terreno in ogni pozzetto prima di aggiungere ulteriore terreno fresco. Ciò riduce la possibilità di applicare uno stress fisico non necessario alle proiezioni neuronali. Considerando l'evaporazione del terreno (specialmente per i pozzetti nel bordo della piastra) si possono rimuovere 75 μL e aggiungere 100 μL di terreno fresco a ciascun pozzetto. Sulla base dell'esperienza, le colture coltivate su piastre improbanti con fondo in polimero tendono a vivere e a rimanere attaccate alla superficie del pozzetto per un tempo più lungo. Pertanto, si consiglia di considerare le piastre di imaging inferiori in polimero per esperimenti che richiedono colture neuronali molto vecchie, come le co-colture con altri tipi di cellule. Sebbene le piastre rivestite di PO/FN/laminina essiccate all'aria possano ancora produrre una differenziazione efficiente, ciò non è stato testato sistematicamente ai fini di questo protocollo. Pertanto, si consiglia l'uso di lastre appena rivestite.

Il protocollo qui descritto si basa su un protocollo precedentemente pubblicato da Barber et al¹⁴. Rispetto ai vecchi metodi di induzione ENC che utilizzano terreni contenenti fattori di sostituzione del siero (ad esempio, KSR)^13,14, le attuali condizioni dei terreni del protocollo sono chimicamente definite. Ciò è vantaggioso per differenziazioni più coerenti e consente studi di sviluppo più precisi manipolando le condizioni di coltura. Questo robusto protocollo genera in modo riproducibile colture di neuroni enterici da linee di cellule staminali embrionali indotte indipendenti che sono state testate, come H9, UCSF4 e WTC11. Un aspetto potente del protocollo presentato è la sua capacità di generare una varietà di sottotipi neuronali ENS simili a quelli che si trovano nell'ENS umano. Ad esempio, l'espressione di marcatori specifici per diverse identità neurochimiche dell'ENS può essere verificata mediante citometria a flusso e imaging a fluorescenza (Figura 1F, G). L'intervallo tipico delle popolazioni neuronali enteriche derivate da hPSC positive per l'ossido nitrico sintasi 1 (NOS1) è del 5%-20%; la colina O-acetiltransferasi (CHAT) è del 40%-60%; l'acido gamma-aminobutirrico (GABA) è del 15%-30% e la serotonina (5-HT) è del 15%-30%. Tuttavia, la misura in cui la connettività strutturale e funzionale in vitro tra questi sottotipi modella accuratamente le reti cellulari in vivo richiede ulteriori studi. Inoltre, le analisi di singole cellule per espandere la profilazione trascrizionale dei singoli sottotipi non solo aiuterebbero a confrontare meglio le identità cellulari in vivo e in vitro, ma andrebbero anche a beneficio degli studi molecolari e dello sviluppo, nonché delle future ottimizzazioni dei protocolli per arricchire sottotipi specifici per la scoperta di farmaci e la medicina rigenerativa.

Nonostante le colture contengano diverse cellule neuronali e, nelle colture più vecchie, cellule gliali, questo protocollo non genera gli altri tipi di cellule che si trovano naturalmente nella nicchia in vivo dell'ENS, come le cellule muscolari, le cellule epiteliali e le cellule immunitarie. Lo studio dell'interazione dell'ENS con questi tipi di cellule nel contesto della salute e della malattia richiede investimenti nell'ottimizzazione dei sistemi di co-coltura e organoidi intestinali. Nel complesso, qui viene descritto un potente metodo per generare diversi sottotipi di ENS da hPSC in vitro . Le colture scalabili sono adatte per studi sullo sviluppo dell'ENS umano, test tossicologici ed esperimenti di modellazione delle malattie volti a sviluppare terapie farmacologiche e fornire cellule trapiantabili per il trattamento delle neuropatie enteriche.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Integratore di acido ascorbico	Sigma-Aldrich	A5960
B27 (senza siero, senza vitamina A)	Gibco	12587-010
Matrice di membrana basale, Geltrex	Gibco	A14133-2
BMP4	R& D systems	314-BP
Centrifuga per colture cellulari	Eppendorf, modello n. 5810R	02262501
Soluzione per il distacco delle cellule, Accutase	Stemcell Technologies	07920
CHIR99021	Tocris	4423
Provette coniche	USA scientific	1475-0511, 1500-1211
Terreno di base di differenziazione, Essential 6	Life Tecnologie	A1516401
DMEM/F-12 senza glutammina	Life Technologies	21331020
EDTA	Corning	MT-46034CI
Mezzo di manutenzione hPSC senza alimentatore, Essential 8 Flex Medium Kit	Life Technologies	A2858501
FGF2	R& D systems	233-FB/CF
Fibronectina	Corning	356008
GDNF	Peprotech	450-10
Emocitometro	Hausser Scientific	1475
Cellule staminali pluripotenti umane, H9 ESC	WiCell	RRID: CVCL_1240
Incubatore con umidità, temperatura e CO2 controllate	Thermo Fisher Scientific	Herralcell 150i
Microscopio invertito	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Cappa a flusso laminare	Thermo Fisher Scientific	serie 1300 classe II, tipo A2
Laminina	Cultrex	3400-010
Integratore di L-glutammina, Glutagro	Corning	25-015-CI
MEM NEAAs	Corning	25-025-CI
Piastre multipozzetto, Falcon	BD	353934, 353075
Integratore N-2	CTS	A1370701
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
PBS (senza Ca e Mg)	Life Technologies	10010023
Riempitrice per pipette	Eppendorf	Z768715-1EA
Puntali per pipette	USA scientifico	1111-2830
Pipette	Fisherbrand	13-678-11E, 13-678-11F
PO	Sigma-Aldrich	P3655
piastre di imaging inferiori per vetrini coprioggetti in polimero, ibidi	ibidi	81156
RA	Sigma-Aldrich	R2625
SB431542	R& D systems	1614
Tintura blu di tripano, 0,4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Piastre di fissaggio ultra-basse	Fisher Scientific	07-200-601
Y-27632 dicloridrato	R& Sistemi D	1254