Articolo metodologico

Misura a singola molecola delle dinamiche di interazione proteica all'interno di condensati biomolecolari

DOI:

10.3791/66169

⸱

5 gennaio 2024

 , 
1Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology, 2Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

È stato dimostrato che molte proteine intrinsecamente disordinate partecipano alla formazione di condensati biomolecolari altamente dinamici, un comportamento importante per numerosi processi cellulari. Qui, presentiamo un metodo basato sull'imaging a singola molecola per quantificare le dinamiche con cui le proteine interagiscono tra loro nei condensati biomolecolari nelle cellule vive.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I condensati biomolecolari formati tramite separazione di fase liquido-liquido (LLPS) sono stati considerati critici nell'organizzazione cellulare e in un numero crescente di funzioni cellulari. La caratterizzazione delle LLPS nelle cellule vive è importante anche perché la condensazione aberrante è stata collegata a numerose malattie, tra cui tumori e disturbi neurodegenerativi. La LLPS è spesso guidata da interazioni selettive, transitorie e multivalenti tra proteine intrinsecamente disordinate. Di grande interesse sono le dinamiche di interazione delle proteine che partecipano alle LLPS, che sono ben riassunte dalle misurazioni del loro tempo di residenza di legame (RT), cioè la quantità di tempo che trascorrono legate all'interno dei condensati. Qui, presentiamo un metodo basato sull'imaging di singole molecole di cellule vive che ci consente di misurare la RT media di una specifica proteina all'interno dei condensati. Visualizziamo simultaneamente le singole molecole proteiche e i condensati a cui si associano, utilizziamo il tracciamento di singole particelle (SPT) per tracciare le traiettorie delle singole molecole e quindi adattiamo le traiettorie a un modello di legame proteina-gocciolina per estrarre l'RT medio della proteina. Infine, mostriamo risultati rappresentativi in cui questo metodo di imaging a singola molecola è stato applicato per confrontare gli RT medi di una proteina nei suoi condensati LLPS quando fusa e non fusa in un dominio oligomerizzante. Questo protocollo è ampiamente applicabile alla misurazione delle dinamiche di interazione di qualsiasi proteina che partecipa alle LLPS.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un numero crescente di lavori suggerisce che i condensati biomolecolari svolgono un ruolo importante nell'organizzazione cellulare e in numerose funzioni cellulari, ad esempio la regolazione trascrizionale 1,2,3,4,5, la riparazione del danno al DNA 6,7,8, l'organizzazione della cromatina 9,10,11,12, il cromosoma X inattivazione 13,14,15 e segnalazione intracellulare 16,17,18. Inoltre, la disregolazione dei condensati biomolecolari è implicata in molte malattie, tra cui i tumori 19,20,21 e le malattie neurodegenerative 22,23,24,25,26. La formazione di condensa è spesso guidata da interazioni transienti, selettive e multivalenti proteina-proteina, proteina-acido nucleico o acido nucleico-acido nucleico27. In determinate condizioni, queste interazioni possono portare alla separazione di fase liquido-liquido (LLPS), una transizione di densità che arricchisce localmente biomolecole specifiche in goccioline prive di membrana. Tali interazioni multivalenti sono spesso mediate dalle regioni intrinsecamente disordinate (IDR) delle proteine 1,28,29. La caratterizzazione biofisica di queste interazioni a livello molecolare è fondamentale per la nostra comprensione di numerose funzioni cellulari sane e aberranti, data la pervasività dei condensati attraverso di esse. Sebbene le tecniche basate sulla microscopia a fluorescenza confocale, ad esempio il recupero della fluorescenza dopo il fotosbiancamento (FRAP)30,31,32, siano state ampiamente utilizzate per dimostrare qualitativamente che gli scambi molecolari tra i condensati e l'ambiente cellulare circostante sono dinamici, quantificare le dinamiche di interazione di specifiche biomolecole all'interno dei condensati non è generalmente possibile utilizzando la microscopia confocale convenzionale o la microscopia a singola molecola microscopia senza metodi specializzati di analisi dei dati. La tecnica di tracciamento di singole particelle (SPT) descritta in questo protocollo si basa sulla microscopia a singola molecola di cellule vive33 e fornisce uno strumento straordinariamente potente per quantificare le dinamiche di interazione tra proteine specifiche all'interno dei condensati. La lettura dell'SPT per tale misurazione è il tempo medio di permanenza di una proteina di interesse nei condensati.

Il protocollo può essere suddiviso in due parti: acquisizione e analisi dei dati. Il primo passo dell'acquisizione dei dati di imaging è quello di esprimere nelle cellule una proteina di interesse che viene fusa con un HaloTag34. Ciò consente di marcare la proteina di interesse con due fluorofori, dove la maggior parte delle molecole proteiche devono essere marcate con un fluoroforo non fotoattivabile (ad esempio, JFX549 Halo ligando35) e una piccola frazione di esse deve essere marcata con un fluoroforo spettralmente distinto e fotoattivabile (ad esempio, PA-JF646 Halo ligando36). Ciò consente l'acquisizione simultanea di tutte le posizioni dei condensati nella cellula e l'acquisizione di film a singola molecola della proteina di interesse che si lega e si dislega ai condensati. Nel frattempo, lo stesso tipo di cellule viene modificato per esprimere stabilmente H2B con Halo-tagged, un istone che è in gran parte immobile sulla cromatina. Le cellule vengono quindi colorate con il ligando PA-JF646 Halo per consentire l'imaging di una singola molecola di H2B. Come verrà discusso in dettaglio in seguito, questo esperimento tiene conto del contributo del fotosbiancamento per consentire una quantificazione precisa delle dinamiche di interazione della proteina di interesse. Le cellule per gli esperimenti di imaging devono quindi essere coltivate su vetrini coprioggetti puliti, colorate con ligandi HaloTag e assemblate in una camera di imaging per cellule vive. Da lì, il campione viene ripreso sotto l'illuminazione di un foglio ottico altamente inclinato e laminato (HILO) su un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) in grado di eseguire l'imaging a due canali e il rilevamento di una singola molecola. L'emissione viene quindi suddivisa su due telecamere, una che traccia le posizioni del condensato e una che traccia le singole molecole. L'acquisizione viene eseguita con un lungo tempo di integrazione (dell'ordine di centinaia di ms) per offuscare le proteine che diffondono liberamente e catturare solo le proteine che sono meno mobili a causa del legame con strutture stabili nella cellula37.

Il primo passo dell'analisi dei dati consiste nell'utilizzare un algoritmo di tracciamento a singola particella (SPT)38,39 per localizzare le singole molecole proteiche in ogni fotogramma del filmato e assemblare le localizzazioni in una traiettoria per ciascuna molecola nel corso della sua vita rilevabile. Le traiettorie vengono quindi ordinate in quelle che rappresentano le molecole all'interno e quelle che rappresentano le molecole all'esterno dei condensati confrontando le localizzazioni delle molecole lungo le loro traiettorie con le localizzazioni di tutti i condensati nei tempi corrispondenti1.

Successivamente, viene generata una curva di sopravvivenza (1 - CDF) utilizzando le lunghezze di tutte le traiettorie in condensa. Il tempo medio apparente di permanenza delle molecole viene quindi estratto adattando la curva di sopravvivenza al seguente modello esponenziale a due componenti di legame proteico,

figure-introduction-1,

con A come frazione di molecole non specificamente legate e con kobs,ns e kobs,s come i tassi di dissociazione osservati delle molecole non specificamente legate e specificamente legate, rispettivamente. Da qui in poi vengono considerati solo kobs,s . La dinamica sia della dissociazione proteica, ktrue,s, che del fotosbiancamento del fluoroforo, kpb, contribuisce a kobs,s come

figure-introduction-2;

quindi, per isolare gli effetti della dissociazione proteica, viene misurato il tasso di dissociazione specifico di H2B-Halo nella linea cellulare menzionata in precedenza.

figure-introduction-3

L'H2B è una proteina che è stabilmente integrata nella cromatina e che sperimenta una dissociazione minima nella scala temporale dell'acquisizione di un film a singola molecola37. Il suo tasso di dissociazione specifica è quindi uguale al tasso di fotosbiancamento del ligando PA-JF646 Halo, o

figure-introduction-4.

Il tempo medio di permanenza nel condensato della proteina di interesse, figure-introduction-5, è quindi

figure-introduction-6.

Vengono mostrati i risultati rappresentativi di Irgen-Gioro et al.40 , dove questo protocollo è stato applicato per dimostrare che la fusione di un dominio di oligomerizzazione con l'IDR si traduce in tempi di permanenza più lunghi dell'IDR nei suoi condensati. Questo risultato suggerisce che il dominio di oligomerizzazione aggiunto stabilizza le interazioni omotipiche dell'IDR che guida le LLPS. In linea di principio, lo stesso metodo con protocolli leggermente modificati può essere applicato per caratterizzare le interazioni omotipiche o eterotipiche di qualsiasi proteina che partecipi alla formazione di qualsiasi tipo di condensato.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Marcatura delle proteine nelle cellule

  1. Esprimere la proteina di interesse fusa con HaloTag nella linea cellulare desiderata.
  2. Esprime stabilmente H2B con tag alogeno nello stesso tipo di cellule di cui alla versione 1.1 utilizzando trasposoni o trasduzione virale.

2. Preparazione dei vetrini coprioggetti

  1. Prima di utilizzare i vetrini coprioggetti per la coltura cellulare, pulire i vetrini coprioggetti per rimuovere i contaminanti autofluorescenti.
    1. Montare vetrini coprioggetti #1,5 di diametro 25 mm su un rack per colorazione in ceramica e inserirli in un contenitore in polipropilene.
    2. Immergere completamente i vetrini coprioggetti in una soluzione 1 M di KOH e sonicare per 1 ora.
    3. Sciacquare tre volte i vetrini coprioggetti con acqua bidistillata (ddH2O).
    4. Immergere completamente i vetrini coprioggetti in etanolo al 100% e sonicare per 1 ora.
    5. Immergere completamente i vetrini coprioggetti in etanolo al 20% diluito con ddH2O e conservare a 4 °C fino al momento dell'uso.

3. Preparazione delle cellule per la microscopia

NOTA: Eseguire i passaggi di questa sezione in una cabina di biosicurezza per evitare la contaminazione delle cellule.

  1. Piastre su vetrini coprioggetti puliti. Eseguire 2 giorni prima dell'imaging se la proteina Halo-tagged deve essere espressa in modo transitorio. Eseguire 1 giorno prima dell'imaging se la proteina Halo-taggata è espressa in modo stabile o endogeno.
    1. Utilizzare una pinza sterile per posizionare i vetrini coprioggetti in una piastra a 6 pozzetti (un vetrino coprioggetti/pozzetto per campione di cellula) e lasciare evaporare l'etanolo residuo.
    2. Placcare ogni pozzetto con un numero appropriato di cellule per ottenere il 70% di confluenza al momento dell'imaging. Placcare un ulteriore pozzetto con cellule che esprimono stabilmente H2B-Halo con la stessa confluenza target.
    3. Seguire questo passaggio solo se si esprime transitoriamente la proteina Halo-tagged di interesse. Incubare le cellule per 24 ore a 37 °C e 5% di CO2 . Quindi, trasfettare le cellule con il plasmide che codifica la proteina marcata di interesse utilizzando reagenti di trasfezione appropriati e seguendo le linee guida del produttore.
    4. Incubare le cellule per 24 ore a 37 °C e 5% di CO2 .
  2. Colorare le cellule che esprimono la proteina Halo-taggata di interesse sia con un ligando Halo non fotoattivabile (ad esempio, JFX549) che con un ligando Halo fotoattivabile (ad esempio, PA-JF646). Colora le cellule che esprimono H2B-Halo con solo il ligando Halo fotoattivabile.
    NOTA: Le concentrazioni dei ligandi dell'alone qui elencate devono essere utilizzate come punto di partenza; La concentrazione ottimale dipenderà dal livello di espressione e dalla concentrazione locale in condensato della proteina di interesse.
    1. Per ogni campione di cellule che esprime la proteina Halo-tagged di interesse, diluire 100 nM JFX549 Halo ligando35 e 20 nM PA-JF646 Halo ligando36 in 500 μL di terreno cellulare appropriato. Per ogni campione che esprime H2B-Halo, diluire solo 20 nM PA-JF646 Halo ligando in 500 μL di terreno cellulare appropriato.
    2. Per ogni pozzetto, aspirare i terreni esistenti, aggiungere 2 mL di PBS 1x, quindi aspirare PBS (questo è indicato come "risciacquo" per il resto del protocollo) e sostituire con terreni contenenti i ligandi Halo appropriati.
    3. Incubare per 1 ora a 37 °C e 5% di CO2 .
    4. Risciacquare con PBS quattro volte e sostituirlo con un terreno fresco privo di ligandi Halo.
    5. Incubare per 15 minuti a 37 °C e 5% di CO2 .
    6. Ripetere i passaggi 3.2.4 e 3.2.5 tre volte (quattro cicli di risciacquo-incubazione in totale).
    7. Utilizzare una pinza sterile per trasferire il vetrino coprioggetto con le cellule in una camera di vetrino coprioggetto per coltura cellulare compatibile con il tavolino del microscopio.
    8. Aggiungere alla camera un terreno privo di rosso fenolo e procedere all'imaging. Incubare i campioni non immediatamente sottoposti a imaging a 37 °C e al 5% di CO2 fino al momento del bisogno.

4. Imaging di una singola molecola

NOTA: Esperimenti indipendenti che misurano i tempi di permanenza sia dell'H2B che della proteina di interesse devono essere condotti per più giorni (≥3) per generare risultati statisticamente significativi. Prima di eseguire l'imaging dei campioni di cellule al microscopio, allineare le due telecamere utilizzando microsfere colorate da 0,1 μm (Tabella dei materiali) o uno standard di calibrazione simile.

  1. Preparare il microscopio.
    1. Accendere il microscopio e il computer che controlla il microscopio.
    2. Accendere i componenti di incubazione delle cellule vive (riscaldatore e CO2 ) sul microscopio e impostarlo a 37 °C e 5% di CO2 . Lasciare che il sistema si equilibri.
    3. Mettere una goccia dell'olio appropriato su un obiettivo a immersione in olio TIRF 100x sul microscopio e caricare il campione di cellule sul tavolino del microscopio.
  2. Identificare una cellula da visualizzare.
    1. Visualizzare il campione di cellule in campo chiaro e regolare la posizione z fino a quando le cellule non sono a fuoco.
    2. Identificare una cellula che presenta le caratteristiche morfologiche delle cellule sane.
    3. Ritaglia il campo visivo (FOV) in modo che catturi solo il nucleo della cellula bersaglio.
    4. Utilizzare l'illuminazione laser e regolare l'angolo TIRF fino a ottenere l'illuminazione HILO41 con un rapporto segnale/rumore ottimale delle singole molecole.
  3. Immagine H2B-Halo in cellule vive.
    NOTA: Le potenze laser utilizzate in questa sezione sono specifiche per questo esperimento e incluse come esempio. Le potenze laser appropriate devono essere scelte in base ai criteri elencati nella discussione.
    1. Impostare una configurazione di acquisizione come indicato di seguito. Impostare il tempo di esposizione su 500 ms. Durante ogni esposizione di 500 ms, eccitare le molecole di H2B-Halo marcate PA-JF646 con un fascio di 9,1 mW, 640 nm. Durante il tempo morto tra i fotogrammi (158,01 μs sul sistema di imaging qui utilizzato), fotoattivare le molecole con un fascio di 111 μW, 405 nm.
    2. Cattura 2000 fotogrammi in modo continuo con queste impostazioni. Aumentare gradualmente la potenza del fascio di 405 nm nel corso dell'acquisizione quando il numero di molecole fotoattivate diventa insufficiente.
  4. Immagina la proteina Halo-taggata di interesse nelle cellule vive.
    1. Utilizzare uno specchio dicroico passa-lungo per dividere le lunghezze d'onda di emissione tra due telecamere, una per rilevare PA-JF646 e l'altra per rilevare JFX549. Utilizzare filtri di emissione appropriati davanti alle telecamere.
    2. Utilizzare la stessa configurazione di acquisizione descritta in 4.3.1 con la seguente modifica. Aggiungi un ulteriore canale JFX549 per tenere traccia delle posizioni dei condensati proteici con Halo-tagged, nel tempo. Ogni 10 s, acquisire un fotogramma (500 ms, 2,1 mW, 561 nm di eccitazione) nel canale JFX549 mantenendo l'acquisizione del canale PA-JF646. Ciò causerà un'emorragia nel canale PA-JF646, che verrà gestita nell'analisi dei dati post-acquisizione.
    3. Cattura 2000 fotogrammi in modo continuo con queste impostazioni. Aumentare gradualmente la potenza del fascio di 405 nm nel corso dell'acquisizione quando il numero di molecole fotoattivate diventa insufficiente.

5. Analisi dei dati di imaging di singole molecole

NOTA: i parametri utilizzati nella sezione 5 sono specifici per questo esperimento e inclusi come esempio. I parametri appropriati dovrebbero essere scelti in base ai criteri elencati nella discussione.

  1. Preparare i dati di imaging grezzi per l'elaborazione.
    1. Per i dati della proteina di interesse, convertire ciascun canale dal file di dati di imaging grezzo in un file di .tif indipendente utilizzando ImageJ o un software di elaborazione delle immagini simile. Per i dati di H2B, convertire il singolo canale dal file di dati di imaging grezzo in un file .tif allo stesso modo.
      NOTA: A seconda del software di acquisizione utilizzato, possono essere presenti fotogrammi vuoti nel filmato della condensa, poiché viene acquisito un solo fotogramma di tracciamento della condensa ogni 10 s. I frame vuoti devono essere popolati con il frame di condensa più recente (alcuni software di acquisizione lo fanno automaticamente). Inoltre, se c'è un significativo bleedthrough dal canale del condensato (JFX549) al canale della singola molecola (PA-JF646) durante quei frame di tracciamento del condensato, i corrispondenti frame a singola molecola devono essere sostituiti con il frame a singola molecola più recente.
    2. Se ci sono fotogrammi che devono essere sostituiti in uno dei filmati per i motivi di cui sopra, sostituirli con il fotogramma più recente di quel filmato modificando (se necessario) ed eseguendo pretracking_comb.txt, una macro ImageJ disponibile in Chong et al.1, e seguendo le istruzioni.
  2. Generare traiettorie a singola particella utilizzando un software SPT, ad esempio SLIMfast39, un'implementazione GUI dell'algoritmo MTT38 disponibile in Teves et al.42.
    1. Caricare il file dalla versione 5.1.2 contenente il filmato a singola molecola in SLIMfast cliccando su Carica > Imagestack.
    2. Impostare i parametri (tasso di errore di localizzazione: 10-6; cicli di deflazione: 3) per la localizzazione facendo clic su OPT > Foglio: Localizzazione.
    3. Impostare i parametri (emissione di picco: 664 nm; tempo di ritardo: 500 ms) per l'acquisizione facendo clic su OPT > Foglio: Acquisizione.
    4. Visualizzare le localizzazioni di tutte le molecole in un unico fotogramma per garantire che i parametri scelti siano appropriati (TEST LOC). Se non è appropriato, modificare i parametri nei passaggi 5.2.2 e 5.2.3 e ripetere questo passaggio.
    5. Genera un file contenente le localizzazioni di tutte le molecole in ogni frame (LOC ALL).
    6. Caricare il file dalla versione 5.2.5 in SLIMfast facendo clic su Carica > dati particellari > SLIMfast.
    7. Impostare i parametri (coefficiente di diffusione massimo previsto: 0,1 μm2/s; numero massimo di concorrenti: 5) per la generazione della traiettoria cliccando su OPT > Foglio: Inseguimento.
    8. Generare un file contenente le traiettorie di tutte le molecole (GEN TRAJ).
  3. Filtrare le traiettorie che sono più corte di tmin, 2,5 s, usando evalSPT39, disponibile in Drosopoulos et al.43, per tenere conto degli errori di tracciamento che si traducono in traiettorie artificialmente corte.
    1. Caricare il file dalla versione 5.2.8 in evalSPT (+ > file dalla versione 5.2.8 > OK).
    2. Impostare i parametri (min: 5 fotogrammi; max: lunghezza massima della traiettoria per il file da 5.2.8) per filtrare le traiettorie più corte di 2.5 s.
    3. Generare un file con tutte le traiettorie filtrate (EXPORT DATA).
  4. Segui questo passaggio solo per le traiettorie della proteina di interesse. Ordinare le traiettorie in quelle nelle condense e nelle condense, quindi estrarre il tempo medio di permanenza nella condensa.
    NOTA: Tutti i codici per questa sezione sono disponibili in Chong et al.1.
    1. Limita tutti i fotogrammi del filmato acquisiti nel canale JFX549 per generare un filmato time-lapse popolato con la maschera binaria che si evolve nel tempo evidenziando le posizioni della condensa eseguendo la macro, il nucleo e il cluster ImageJ mask_v2.txt e seguendo le istruzioni.
    2. Riformattare le traiettorie a singola molecola generate in 5.3.3. utilizzando lo script MATLAB, ConvertASCII_SlowTracking_css3.m, e regolando i nomi dei file, i percorsi e i parametri in base alle esigenze. (Parametri: Esposizione, 0,5 s; Risoluzione, 0,16 μm/pixel).
    3. Ordina le traiettorie in base alla frazione della vita che una data molecola trascorre in un condensato, F, utilizzando lo script MATLAB, categorization_v4.m, e regolando i nomi dei file e i percorsi in base alle esigenze.
    4. Procedere utilizzando solo traiettorie in condensa.
  5. Estrarre kobs,s e kpb e calcolare il tempo medio di permanenza corretto, figure-protocol-1.
    1. Estrai kobs,s dalle traiettorie della proteina di interesse in-condensate utilizzando lo script MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m, e regolando i nomi dei file, i percorsi e i parametri in base alle esigenze.
      (Parametri: Esposizione, 0,5 s; StartFrameForFit, 5 fotogrammi).
    2. Estrai kpb dalle traiettorie H2B utilizzando lo script MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m, e regolando i nomi dei file, i percorsi e i parametri in base alle esigenze.
      (Parametri: Esposizione, 0,5 s; StartFrameForFit, 5 fotogrammi).
    3. Calcolare il tempo medio corretto di permanenza della proteina di interesse specificamente legata ai suoi condensati, figure-protocol-2come
      figure-protocol-3
      NOTA: I controlli devono essere eseguiti per verificare che tempi di esposizione diversi che sono abbastanza lunghi da offuscare le particelle mobili, ad esempio 300 ms e 800 ms, si traducano ancora nello stesso tempo medio di permanenza della proteina di interesse.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo i risultati rappresentativi di Irgen-Gioro et al.40, dove abbiamo utilizzato questo protocollo SPT per confrontare le dinamiche di interazione di due proteine nei rispettivi condensati LLPS auto-assemblati. TAF15 (TATA-box binding protein associated factor 15) contiene un IDR che può essere sottoposto a LLPS in seguito a sovraespressione nelle cellule umane. Abbiamo ipotizzato che la fusione di TAF15 (IDR) con FTH1 (catena pesante di ferritina 1), che forma un oligomero a 24 subunità, porterebbe a interazioni omotipiche proteina-proteina più stabili che guidano le LLPS. Per testare questa ipotesi, abbiamo espresso transitoriamente nelle cellule U2OS la fusione Halo-TAF15 (IDR) o TAF15 (IDR)-Halo-FTH1 e abbiamo eseguito l'imaging a due colori di una singola molecola di ciascuna proteina seguendo il protocollo di cui sopra. Un fotogramma rappresentativo di un filmato TAF15(IDR)-Halo-FTH1 è mostrato nella Figura 1A. Le molecole rilevate nel canale PA-JF646 sono state localizzate e tali localizzazioni sono state assemblate in traiettorie. Le traiettorie risultanti sono state quindi ordinate tra popolazioni in-condensate e out-of-condensate confrontandole con una maschera binaria che evidenzia le posizioni dei condensati (Figura 1B). Mentre mostriamo solo una piccola frazione delle traiettorie per una buona visibilità, c'è una chiara distinzione tra le traiettorie delle molecole legate ai condensati e quelle legate all'esterno dei condensati. Successivamente, una curva di sopravvivenza delle lunghezze della traiettoria in condensa è stata confrontata con il modello esponenziale a due componenti (Figura 1C). Infine, i tempi medi di permanenza dopo la correzione per il fotosbiancamento sono stati estratti e tracciati per entrambe le proteine (Figura 1D). Abbiamo scoperto che il tempo medio di permanenza di Halo-TAF15 (IDR) nei suoi condensati LLPS era di 10,23 s ± 1,10 s mentre quello di TAF15 (IDR)-Halo-FTH1 era di 64,15 s ± 11,65 s. Questo risultato suggerisce che l'aggiunta del dominio oligomerizzante a TAF15 (IDR) stabilizza effettivamente il legame proteina-condensato.

figure-results-1
Figura 1: Il metodo basato su SPT risolve le differenze nei tempi di permanenza delle proteine nei loro condensati. Fotogrammi rappresentativi di un filmato a due colori a singola molecola di TAF15(IDR)-Halo-FTH1. Le proteine sono state marcate con una combinazione di una maggiore concentrazione di colorante non fotoattivabile (100 nM JFX549, giallo) per visualizzare le posizioni dei condensati e una concentrazione inferiore di colorante fotoattivabile (20 nM PA-JF646, magenta) per visualizzare le singole proteine, consentendo SPT. I filmati nelle stesse condizioni di imaging sono stati acquisiti per Halo-TAF15 (IDR) e i filmati PA-JF646 a canale singolo sono stati acquisiti per H2B-Halo. Una linea tratteggiata bianca delinea il nucleo. B. Immagine rappresentativa unita che si sovrappone a una maschera binaria di posizione del condensato (grigio) e traiettorie (multicolore). C. Curva di sopravvivenza rappresentativa di TAF15(IDR)-Halo-FTH1 con il modello esponenziale a due componenti. D. Il tempo medio di permanenza di Halo-TAF15 in è stato significativamente più breve di quello di TAF15(IDR)-Halo-FTH1 nei rispettivi condensati. Il valore per ciascuna proteina è stato calcolato in media da 20 cellule misurate in esperimenti indipendenti eseguiti nell'arco di tre giorni. L'errore si è propagato come errore standard della media e l'asterisco rappresenta una differenza significativa nel tempo di permanenza delle due proteine (p<0,05, test di Wilcoxon). Questa cifra è stata adattata con il permesso di Irgen-Gioro et al.40. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo qui presentato è progettato per sistemi come quelli studiati in Irgen-Gioro et al.40. A seconda dell'applicazione, alcuni componenti del protocollo possono essere modificati, ad esempio il metodo per generare linee cellulari marcate con fluorescenza, il sistema di marcatura fluorescente e lo stile di vetrino coprioggetto utilizzato. L'halo-tagging di una proteina in una cellula può essere fatto usando due strategie, a seconda di quale sia più adatta per un determinato esperimento. 1) Espressione esogena: fusione della proteina di interesse con un HaloTag ed espressione della fusione in una linea cellulare bersaglio sia transitoriamente utilizzando la trasfezione che stabilmente utilizzando trasposoni o trasduzione virale. 2) Genome editing: knock in un HaloTag nel locus genico che codifica per la proteina endogena di interesse in una linea cellulare bersaglio utilizzando tecniche di genome editing, ad esempio CRISPR44. I vantaggi e gli svantaggi di ciascuno di essi sono discussi altrove45, ma in breve, la strategia di espressione esogena richiede meno tempo ma produce una popolazione di cellule con un'ampia gamma di livelli di espressione che sono spesso non fisiologici. La strategia di editing del genoma richiede molto più tempo, ma etichetta le proteine di interesse espresse endogenamente ai loro livelli di espressione nativa.

Inoltre, questo protocollo non richiede specificamente l'utilizzo di un HaloTag; Piuttosto, è compatibile con qualsiasi tag che consenta l'etichettatura simultanea di una singola molecola e di un insieme della stessa proteina nella cellula. Pertanto, il protocollo può essere modificato per l'uso con altri tag autoetichettanti come SNAP-tag46. Infine, al posto delle camere di vetrini coprioggetto possono essere utilizzate piastre commerciali prepulite con fondo in vetro per colture cellulari, come le piastre MatTek (MatTek Life Sciences, P35G-1.5-20-C), a condizione che siano compatibili con l'obiettivo del microscopio e l'olio da immersione; Tuttavia, i vetrini coprioggetti possono essere puliti più a fondo immediatamente prima dell'uso, quindi sono preferibili.

Mentre le modifiche di cui sopra al protocollo sono facoltative, ci sono parametri sperimentali e di analisi che devono essere ottimizzati, vale a dire, le concentrazioni dei ligandi HaloTag, le potenze del laser, i parametri di localizzazione e tracciamento e tmin. La concentrazione del ligando HaloTag non fotoattivabile deve essere scelta in modo tale che la condensa sia etichettata in modo sufficientemente denso da consentire la generazione della maschera. La concentrazione del ligando HaloTag fotoattivabile e la potenza del laser di fotoattivazione devono essere scelte in modo tale che le molecole proteiche siano marcate e fotoattivate in modo sufficientemente scarso da generare traiettorie di qualità a singola particella, poiché un eccesso di localizzazioni in ogni fotogramma si tradurrà in una generazione di traiettoria imprecisa. Per gli esperimenti mostrati nei risultati rappresentativi, c'erano generalmente meno di cinque localizzazioni per fotogramma. La potenza del laser di eccitazione deve essere mantenuta sufficientemente bassa da ridurre al minimo il fotosbiancamento rapido, ma sufficientemente alta da localizzare con precisione le singole molecole. I parametri di localizzazione e tracciamento di una singola molecola devono essere regolati in base alla densità di eccitazione e alle dinamiche di diffusione attese della proteina di interesse. Infine, i valori di figure-discussion-1 devono essere calcolati in un intervallo di tmin (a partire da 0 s e aumentando con incrementi del tempo di esposizione). I valori di figure-discussion-2 dovrebbero convergere al di sopra di una certa soglia di tmin; questo tmin dovrebbe essere usato nel passaggio 5.3.

Il metodo qui descritto quantifica le dinamiche di interazione delle proteine all'interno dei condensati con una precisione inaccessibile alle tecniche convenzionali. Inoltre, può farlo in cellule vive con una perturbazione minima del campione. Questo è fondamentale, poiché i comportamenti di interazione degli IDR, compresa la loro formazione di condensa, dipendono fortemente dal loro ambiente locale40.

I risultati rappresentativi di Irgen-Gioro et al.40 dimostrano la capacità di questo metodo di estrarre i tempi di permanenza per le proteine che si legano ai loro condensati LLPS auto-assemblati. È importante sottolineare che questo metodo può essere facilmente esteso a qualsiasi proteina che si lega a qualsiasi tipo di condensato attraverso interazioni omotipiche o eterotipiche. Inoltre, non si limita a misurare le dinamiche di interazione delle proteine sottoposte a LLPS. È stato dimostrato che l'oncoproteina di fusione EWS::FLI1, che è nota per causare il sarcoma di Ewing, forma hub locali ad alta concentrazione che svolgono un ruolo essenziale nella sua attivazione trascrizionale e nelle funzioni di trasformazione oncogenica 1,2. Mentre la formazione di questi hub è guidata da interazioni IDR-IDR transitorie, selettive e multivalenti di EWS::FLI1, finora non ci sono ancora prove convincenti che siano veri e propri condensati di LLPS 1,2. Ciononostante, abbiamo utilizzato il metodo qui presentato per misurare il tempo medio di permanenza di EWS::FLI1 nei suoi hub e abbiamo dimostrato che la mutazione di residui specifici e la delezione del suo IDR hanno destabilizzato significativamente il legame di EWS::FLI1 ai suoi hub1.

Nonostante la versatilità di questo metodo nel caratterizzare le dinamiche di legame delle proteine all'interno dei condensati, è necessario prestare attenzione quando si sceglie il modello per il legame delle proteine in contesti specifici. I dati biochimici esistenti supportano l'idea che una distribuzione esponenziale a due componenti sia spesso un modello appropriato per molti sistemi 1,37,40,42, ma la stessa distribuzione ha anche dimostrato di essere una rappresentazione inappropriata del legame proteico in altri sistemi in cui modelli alternativi come l'esponenziale a tre componenti 47,48,49 e le distribuzioni a legge di potenza 50 meglio le osservazioni sperimentali. Per evitare di trarre conclusioni imprecise, è necessario scegliere e motivare con cura un modello, verificare che la qualità dell'adattamento supporti l'uso del modello e interpretare giudiziosamente i risultati.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation Graduate Research Fellowship nell'ambito della sovvenzione n. DGE-1745301 (S.Y.), Pew-Stewart Scholar Award (S.C.), Searle Scholar Award (S.C.), Shurl and Kay Curci Foundation Research Grant (S.C.), Merkin Innovation Seed Grant (S.C.), Mallinckrodt Research Grant (S.C.) e Margaret E. Sovvenzione Early Medical Research Trust 2024 (S.C.). S.C. è anche supportato dal NIH/NCI con il numero di premio P30CA016042.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,1 µ m TetraSpeck microsferaInvitrogenT7279Imaging a singola molecola
25 mm di diametro, #1,5 Vetrini coprioggettiMarienfeld Superior111650Preparazione dei vetrini coprioggetti
Filtro passa-banda 593/40 nmSemrockFF01-593/40-25Imaging a molecola singola
Filtro passa-banda a 676/37 nmSemrockFF01-676/37-25Imaging a molecola singola
6 pozzetti TC PlateGenesee25-105MPPreparazione delle cellule per la microscopia
Linea cellulare: U-2 OSATCCHTB-96Marcatura delle proteine nelle cellule
ConvertASCII_SlowTracking_css3
.m		Analisi dei dati di imaging a singola molecola: Disponibile in Chong et al., 2018
Coverglass Staining RackThomas24957Preparazione dei vetrini
coprioggettiJanelia Fluor deuterata 549 (JFX549)Janelia Research CampusPreparazione di cellule per microscopia
DMEM, basso glucosioGibco10-567-022Marcatura delle proteine nelle cellule: Mezzi di crescita utilizzati: DMEM con il 5% di siero fetale bovino, 1% di penstrep
Eclipse Ti2-E Microscopio invertitoNikonImaging a molecola singola
Etanolo 200 ProofLab AlleyEAP200-1GALPreparazione dei vetrini
coprioggetti evalSPTAnalisi dei dati di imaging a singola molecola: Disponibile in Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine SerumCytivaSH30396.03Marcatura delle proteine nelle cellule: Mezzi di crescita utilizzati: DMEM con il 5% di siero fetale bovino, l'1% di penstrep
FijiAnalisi dei dati di imaging a singola molecola
Ikon Ultra CCD CameraAndorX-13723molecola
Beamsplitter dicroico passa-lungoSemrockDi02-R635-25x36Imaging a singola molecola: Red/Far Red beamsplitter
Unità laser LUN-FNikonImaging a singola molecola: 405/488/561/640
Piatto con fondo in vetro MatTekMatTekP35G-1.5-20-CPreparazione delle cellule per microscopia: 35 mm, #1.5 coverslip dish per coltura cellulare.
NIS-ElementsNikonImaging a singola molecola: software di acquisizione al microscopio
nucleo e cluster mask_v2.txtAnalisi dei dati di imaging a singola molecola: disponibile in Chong et al., 2018
Penicillina-streptomicinaGibco15-140-122Etichettatura delle proteine nelle cellule: Mezzi di crescita utilizzati: DMEM con il 5% di siero fetale bovino, l'1% di penstrep
di fosfato tamponato soluzione salinaThermo Fisher Scientific18912014Marcatura delle proteine nelle cellule
Janelia Fluor 646 fotoattivabile (PA-JF646)Janelia Research CampusPreparazione di cellule per microscopia
PLOT_ResidenceHist_css.mAnalisi dei dati di imaging a singola molecola: disponibile in Chong et al., 2018
Potassium HydroxideMallinckrodt Chemicals6984-06Preparazione di vetrini
coprioggetti pretracking_comb.txtAnalisi dei dati di imaging di una singola molecola: disponibile in Chong et al., 2018
SLIMfastAnalisi dei dati di imaging di una singola molecola: disponibile in Teves et al., 2016
Sistema di incubazione a stadioTokai HitImaging a singola molecola: per l'imaging di cellule vive
Splitter di immagini a doppia emissione TwinCamCairn ResearchPulitore ad ultrasuoni per imaging a singola molecola
Branson5800Preparazione di vetrini coprioggetti
a Imaging a singola

Riferimenti

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