Articolo metodologico

Effetto antagonista di Jiawei Shengjiang San su un modello di nefropatia diabetica di ratto: correlato alla via di segnalazione EGFR/MAPK3/1

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DOI:

10.3791/66179

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10 maggio 2024

 ,  ,  ,  , 
1Graduate School, Hebei University of Chinese Medicine, 2School of Basic Medical Sciences, Hebei University of Chinese Medicine, 3Department of Endocrinology and Nephrology, Renal Research Institute of Beijing University of Chinese Medicine, Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, 4Hebei Province Academy of Chinese Medicine Sciences, 5Department of Nephrology, First Affiliated Hospital, Hebei University of Chinese Medicine

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In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo che descrive la farmacologia di rete e le tecniche di docking molecolare per esplorare il meccanismo d'azione di Jiawei Shengjiang San (JWSJS) nel trattamento della nefropatia diabetica.

Abstract

Abbiamo mirato ad approfondire i meccanismi alla base dell'azione di Jiawei Shengjiang San (JWSJS) nel trattamento della nefropatia diabetica e nell'implementazione della farmacologia di rete. Utilizzando la farmacologia della rete e le tecniche di docking molecolare, abbiamo previsto i componenti attivi e i bersagli di JWSJS e costruito una meticolosa rete "farmaco-componente-bersaglio". Le analisi di arricchimento dell'ontologia genica (GO) e dell'enciclopedia di Kyoto dei geni e dei genomi (KEGG) sono state utilizzate per discernere i percorsi terapeutici e i bersagli dei JWSJ. Autodock Vina 1.2.0 è stato utilizzato per la verifica dell'attracco molecolare ed è stata condotta una simulazione di dinamica molecolare a 100 ns per confermare i risultati dell'attracco, seguita dalla verifica in vivo degli animali. I risultati hanno rivelato che JWSJS condivideva 227 bersagli intersecanti con la nefropatia diabetica, costruendo una topologia di rete di interazione proteina-proteina. L'analisi dell'arricchimento KEGG ha denotato che JWSJS mitiga la nefropatia diabetica modulando i lipidi e l'aterosclerosi, la via di segnalazione PI3K-Akt, l'apoptosi e la via di segnalazione HIF-1, con la proteina chinasi 1 attivata dal mitogeno (MAPK1), MAPK3, il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) e la serina/treonina-proteina chinasi 1 (AKT1) identificati come bersagli collettivi di più percorsi. Il docking molecolare ha affermato che i componenti principali di JWSJS (quercetina, acido palmitoleico e luteolina) potrebbero stabilizzare la conformazione con tre bersagli cardine (MAPK1, MAPK3 e EGFR) attraverso il legame idrogeno. Gli esami in vivo hanno indicato un notevole aumento del peso corporeo e riduzioni delle proteine sieriche glicate (GSP), del colesterolo lipoproteico a bassa densità (LDL-C), dell'uridina trifosfato (UTP) e dei livelli di glucosio nel sangue a digiuno (FBG) dovuti a JWSJS. La microscopia elettronica accoppiata con ematossilina ed eosina (HE) e la colorazione periodica con acido-Schiff (PAS) hanno evidenziato il potenziale di ciascun gruppo di trattamento nell'alleviare il danno renale in misura diversa, esibendo vari cali di p-EGFR, p-MAPK3/1 e BAX e incrementi dell'espressione di BCL-2 nei tessuti renali dei ratti trattati. In conclusione, queste intuizioni suggeriscono che l'efficacia protettiva della JWSJS sulla nefropatia diabetica potrebbe essere associata alla soppressione dell'attivazione della via di segnalazione EGFR/MAPK3/1 e all'alleviamento dell'apoptosi delle cellule renali.

Introduzione

Il diabete mellito (DM) è una malattia cronica che colpisce più sistemi e può causare varie complicanze dovute all'iperglicemia continua, come la nefropatia diabetica (DN), la retinopatia e la neuropatia1. La DN è una grave complicanza della DM, che rappresenta circa il 30%-50% della malattia renale allo stadio terminale (ESRD)2. La sua manifestazione clinica è la microalbuminuria, che può progredire in ESRD caratterizzata da aumento del volume glomerulare, iperplasia stromale mesangiale e ispessimento della membrana basale glomerulare3. La patogenesi della DN è complessa e non è stata completamente chiarita. Metodi clinici come l'abbassamento della glicemia, la regolazione della pressione sanguigna e la riduzione della proteinuria sono utilizzati principalmente per ritardarne il progresso, ma l'effetto è generale.

Attualmente, non è stato trovato alcun farmaco specifico per il trattamento della DN4. Per secoli, tuttavia, le erboristerie cinesi sono state ampiamente utilizzate nel trattamento della DM e delle sue complicanze5 e hanno migliorato i sintomi clinici dei pazienti e ritardato la progressione della malattia. A causa dei vantaggi degli effetti multicomponente, multi-target e multi-percorso, si prevede che le erboristerie cinesi siano una fonte di farmaci innovativa per il trattamento del DN6.

"Shengjiang san" ha avuto origine dal "Wanbing Huichun" del medico della dinastia Ming Gong Tingxian. Il libro "Neifu Xianfang" descrive l'uso di Bombyx Batryticatus, Cicadae Periostracum, Curcumaelongae Rhizoma e Radix Rhei et Rhizome. Sulla base di ciò, dopo aver aggiunto Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba e Smilacis Glabrae Rhixoma, esercita la funzione dello shengjiang san di aumentare la lucidità, diminuire la torbidità, rilasciare "calore" stagnante e armonizzare il "qi" e il sangue 7,8. Aumenta anche l'effetto di rafforzamento della milza e di tonificazione dei reni. La sua efficacia è coerente con la patogenesi del "qi" di DN per salire e scendere fuori ordine a causa della carenza di "energia vitale", dell'eccessiva secchezza e "calore" e del ristagno di "calore" causato da un triplo energizzante 7,8.

Precedenti studi clinici hanno dimostrato che le erboristerie cinesi sono state utilizzate per trattare il DM e le sue complicanze, e jiawei shengjiang san (JWSJS) ha dimostrato di regolare la glicemia e i lipidi, ridurre la proteinuria e migliorare significativamente l'efficacia clinica dei pazienti con DN7 precoce. La capacità di JWSJS di ridurre i livelli di proteine urinarie e glucosio nel sangue nei ratti DN è stata confermata da studi precedenti. Ciò probabilmente accade inibendo le vie di segnalazione TXNIP/NLRP3 e RIP1/RIP3/MLKL, riducendo la piroptosi dei podociti e prevenendo l'apoptosi necrotica nei tessuti renali dei ratti DN, ottenendo così la protezione renale9. JWSJS può aumentare l'espressione delle proteine nefrina e podocina e ridurre il danno da podociti nei ratti DN, suggerendo così che JWSJS ha un effetto inibitorio sul danno da podociti. JWSJS ha un certo effetto anti-DN con buoni profili di sicurezza, ma ci sono poche ricerche su di esso e questo lavoro si concentra principalmente sulla piroptosi e sull'apoptosi necrotica. La letteratura non è sufficientemente approfondita o sistematica10. I nostri risultati precedenti hanno confermato che JWSJS può ridurre la proteinuria e alleviare il danno renale nei ratti DN7. Tuttavia, ci sono solo pochi studi sul meccanismo della JWSJS per il trattamento della DN, e questi mancano di profondità e sistematizzazione. Pertanto, questo studio mira ad analizzare le sostanze molecolari e i meccanismi d'azione di JWSJS per il trattamento della DN utilizzando la farmacologia di rete e fornire una solida base per la ricerca futura.

La farmacologia delle reti è un metodo emergente per studiare il meccanismo d'azione dei farmaci, tra cui la chemioinformativa, la biologia delle reti, la bioinformatica e la farmacologia11,12. Il disegno della ricerca farmacologica di rete è abbastanza simile al concetto olistico della medicina tradizionale cinese13,14 ed è un metodo importante per studiare il meccanismo delle medicine erboristiche cinesi. Il docking molecolare può studiare le interazioni tra le molecole e prevedere i loro modelli di legame e affinità. Il docking molecolare è emerso come una tecnica fondamentale nel campo della ricerca farmacologica assistita da computer15. Pertanto, questo studio ha costruito una rete di interazione JWSJS-DN-target attraverso la farmacologia di rete e i metodi di docking molecolare che offre una base teorica affidabile per ulteriori esplorazioni del trattamento DN con JWSJS.

Protocollo

Tutti gli animali sono stati mantenuti e utilizzati in conformità con la Guida del Consiglio Nazionale delle Ricerche degli Stati Uniti per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, 8a edizione, e sono stati segnalati come raccomandato nelle linee guida ARRIVE 16,17. Lo studio è stato condotto in conformità con la Guida del Consiglio Nazionale delle Ricerche cinese per la cura e l'uso degli animali da laboratorio ed è stato approvato dal Comitato Etico Animale dell'Università di Medicina Cinese di Hebei (DWLL2019030).

1. Principi attivi JWSJS e raccolta target

  1. Inserisci la composizione medicinale JWSJS (Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba, Smilacis Glabrae Rhixoma, Radix Rhei et Rhizome e Curcumaelongae Rhizoma) nel database di farmacologia dei sistemi di medicina tradizionale cinese e nel database della piattaforma di analisi (TCMSP)18 per recuperare tutti i componenti chimici.  Secondo lo screening di assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione (ADME) la biodisponibilità orale (OB) ≥ il 30% e le proprietà simili ai farmaci (DL) ≥ 0,18 ingredienti chimici19,20.
  2. Utilizzare il database TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php, versione 2.3) per recuperare i target corrispondenti degli ingredienti chimici.
  3. Ottieni i principi attivi di Bombyx Batryticatus e Cicadae Periostracum effettuando una ricerca nei database di Medicina Tradizionale Cinese e Composizione Chimica21.
  4. Per la credibilità sperimentale, selezionare composti con numeri CAS (Chemical Abstracts Service) per questo studio. Quindi scarica i diagrammi di struttura 2D (formato .sdf) dei principi attivi da PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/, aggiornati nel 2021)22.
  5. Utilizzare SwissADME (www.swissadme.ch, aggiornato nel 2021)23per lo screening dei componenti con elevato assorbimento gastrointestinale (IG) come similarità farmacologica (Lipinski, Ghose, Veber, Egan, Muegge) i cui ≥ 2 item erano "Sì". Ciò ha portato ai componenti attivi di Bombyx Batryticatus e Cicadae Periostracum.
  6. Importali nel database TCMSP per la previsione della proteina bersaglio (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php, versione 2.3)18.
  7. Standardizzare gli obiettivi nel database UniProt (https://www.uniprot.org, aggiornato nel 2021) con lo stato impostato come Revisionato e le specie impostate come Umano24.

2. Raccolta target corrispondente DN

  1. Cerca Nefropatia diabetica tramite GeneCards (https://www.genecards.org/, versione 5.1)25, OMIM (https://omim.org/, aggiornato nel 2021)26, TTD (http://db.idrblab.net/ttd/, aggiornato nel 2021)27, PharmGKB (https://www.pharmgkb.org/, aggiornato nel 2021)28 e database DrugBank (https://www.drugbank.ca/, aggiornato nel 2021)29. Ottieni i target di DN dopo la combinazione e la deduplicazione.
  2. Screening degli obiettivi comuni di JWSJS e DN e costruzione di reti
    1. Esamina i bersagli comuni di JWSJS e DN utilizzando il software R 4.2.0 e disegna diagrammi di Venn. Importa i principi attivi e i potenziali bersagli di JWSJS nel software Cytoscape 3.8.030 per creare un diagramma di rete farmaco-ingrediente-bersaglio che visualizza la connessione tra farmaci, ingredienti, bersagli e malattie.
    2. Lascia che la dimensione del nodo rifletta la dimensione del valore del grado, dove un valore di grado più alto indica che il nodo è più importante nella rete.
  3. Costruzione della rete di interazione proteina-proteina PPI e screening dei bersagli core
    1. Analizzare i geni che si intersecano utilizzando la piattaforma online STRING (Versione: 11.5) per costruire una rete di interazione proteina-proteina (PPI)31. Costruisci la rete utilizzando una modalità di analisi di proteine multiple , imposta la specie su Homo sapiens e imposta il punteggio minimo di interazione richiesto su >0,930.
    2. Utilizza Cytoscape 3.8.0 per analizzare topologicamente la rete, calcolare la centralità tra (BC), la centralità di prossimità (CC), la centralità del grado (DC), la centralità degli autovettori (EC), il metodo basato sulla connettività media locale (LAC) e i valori di centralità della rete (NC) per ciascun nodo e escludere i sei nodi con tutti i valori maggiori della mediana32. Ripetere questo processo più volte per identificare i bersagli principali della JWSJS per la terapia DN.
  4. Analisi funzionali GO e analisi dell'arricchimento della via KEGG
    1. Esegui analisi di arricchimento di OB e KEGG per identificare i processi biologici, le funzioni molecolari, i componenti cellulari e i percorsi associati ai bersagli comuni di JWSJS e DN.
    2. Usa l'org. Hs.eg.db pacchetto per ottenere gli ID delle destinazioni di intersezione e utilizzare clusterProfiler, org. Pacchetti Hs.eg.db, enrichplot e ggplot2 per analisi di arricchimento33.
    3. Screening per l'analisi dell'arricchimento funzionale di OB sui primi 10 risultati biologici con un valore P corretto < 0,05 e selezionare i primi 30 percorsi con il più alto arricchimento per l'analisi KEGG.

3. Attracco molecolare

  1. Utilizzare il software AutoDock Vina per eseguire l'aggancio molecolare tra i componenti principali di JWSJS e i bersagli principali per la terapia DN34.
  2. Cerca nel database di PubChem per ottenere il file sdf della struttura 2D dei componenti principali di JWSJS. Utilizza il software ChemBio 3D Ultra14.0 per generare e ottimizzare la sua struttura 3D, salvarla in formato mol2 e utilizzarla come file ligando.
  3. Trova e scarica il formato pdb della struttura 3D dei bersagli principali dal database della Banca Dati Proteiche (PDB) del Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB). Utilizzare il software Pymol 2.4.0 per rimuovere le molecole d'acqua e i ligandi dalla struttura proteica, salvarlo in formato pdb e utilizzarlo come file recettore.
  4. Importa il file pdb del recettore nel software AutoDockTools 1.5.7 per l'idrogenazione, converti sia la proteina del recettore che il ligando di piccole molecole in formato pdbqt, imposta la tasca attiva per la proteina del recettore con il coefficiente di spaziatura impostato su 1.
  5. Utilizzare Autodock vina 1.2.0 per il docking molecolare e calcolare l'energia di legame; se Affinità < 0, si consideri che la molecola si lega spontaneamente con le proteine, un valore assoluto maggiore di Affinità indica un legame più stabile tra di loro. Infine, visualizza i risultati dell'attracco utilizzando i software Pymol 2.3.0 e LigPlot 2.2.5.

4. Simulazione dinamica molecolare

  1. Per eseguire simulazioni MD utilizzando il software Desmond, attenersi alla seguente procedura:
    1. Utilizzare la versione accademica 2019-1 del software Desmond per valutare la stabilità e la flessibilità delle interazioni proteina-ligando.
    2. Condurre indagini di dinamica molecolare (MD) su un trio dei complessi di ligandi più promettenti derivati da studi di docking. Condurre simulazioni in un ambiente acquoso SPC con NaCl 0,15 M, replicando le condizioni ioniche fisiologiche. La scatola di simulazione è progettata in modo da garantire che il soluto rimanga ad almeno 10 Å di distanza dai suoi confini. I controioni vengono introdotti per neutralizzare la carica elettrica del sistema. Inoltre, vengono applicate condizioni al contorno periodiche, governate dai parametri del campo di forza OPLS 2005.
    3. Avvia una fase di minimizzazione dell'energia per 100 ps utilizzando i parametri predefiniti di Desmond.
    4. Garantire la stabilizzazione della temperatura e della pressione a 26,85 °C (300 K) e 1,01325 bar attraverso la catena Nosé-Hoover e le metodologie Martyna-Tobias-Klein in tutti i sistemi MD di produzione. La simulazione di dinamica molecolare viene eseguita con un timestep di 2 fs per una durata totale di 100 ns, registrando le coordinate atomiche ogni 100 ps.
    5. Aprire il modulo SID (Simulation Interactions Diagram). Caricare i file di dati dei risultati della simulazione nel modulo.
    6. Selezionare il tipo di analisi desiderato tra le opzioni disponibili nel modulo (ad esempio, deviazione quadratica media [RMSD], fluttuazione quadratica media [RMSF], analisi del legame idrogeno, ecc.). Specificate eventuali parametri aggiuntivi necessari per il tipo di analisi scelto.
    7. Esegui l'analisi facendo clic sul pulsante Analizza o Avvia.
    8. Una volta completata l'analisi, visualizzare e interpretare i risultati all'interno dell'interfaccia del modulo SID. Esporta i risultati, se necessario, per un ulteriore utilizzo o presentazione.

5. Convalida degli esperimenti sugli animali

  1. Animali e disegno sperimentale
    NOTA: Questo studio ha coinvolto 75 ratti maschi di Sprague-Dawley, ottenuti da un impianto di produzione animale di grado SPF e di 8 settimane con una massa corporea di 150 g ± 20 g (certificato di produzione animale numero SCXK [Hebei] 2018-004).
    1. Ospita i ratti in un laboratorio per animali di livello SPF e dividili casualmente in gruppi normali e modello dopo 1 settimana di alimentazione adattiva. Fornire al gruppo normale una dieta normale e al gruppo modello una dieta ricca di zuccheri e grassi. Dopo 4 settimane, digiunare i ratti ma non privarli dell'acqua per 12 ore.
    2. Iniettare nel gruppo modello un'iniezione intraperitoneale di streptozotocina (STZ; 35 mg·kg-1). Dopo 72 ore, testare i livelli di zucchero nel sangue attraverso il prelievo di sangue della vena caudale. Se il livello di glucosio nel sangue a digiuno è ≥16,7 mmol· L-1, confermarlo come un modello diabetico di successo.
    3. Confermare il successo del modello DN osservando i cambiamenti istopatologici nel rene di ratto.
    4. Dividere casualmente i modelli replicati con successo nel gruppo modello, che ha ricevuto JWSJS a 4,37 g/kg, 8,73 g/kg e 17,46 g/kg (equivalenti a 3,2, 6,3 e 12,6 volte la dose clinica equivalente) e in un gruppo irbesartan (0,014 g/kg). Ogni gruppo era composto da 10 ratti. Somministrare tutti i farmaci tramite sonda gastrica orale una volta al giorno. Mantenere questo regime di dosaggio in modo costante per 4 settimane.
    5. Anestetizzare i ratti utilizzando un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico all'1% (50 mg/kg) e confermare la corretta anestesia perdendo il riflesso di ritiro del pedale. Raccogliere campioni di sangue dall'aorta addominale prima dell'eutanasia.
    6. Raccogliere i reni dopo l'eutanasia dei ratti utilizzando un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico alla dose di 150 mg/kg.
      NOTA: Gli animali sono stati soppressi umanamente, seguendo le linee guida (https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals) più aggiornate dell'American Veterinary Medical Association (AVMA) per l'eutanasia.
  2. Analisi istologiche renali
    NOTA: I tessuti renali sono stati fissati in paraformaldeide al 4% e disidratati in etanolo dopo 48 ore; Le sezioni erano incorporate nella paraffina. Le sezioni sono state tagliate in fette sottili (4 μm) per l'ematossilina e l'eosina (HE) e la colorazione periodica acido-Schiff (PAS) e i cambiamenti morfologici dell'istologia renale sono stati osservati al microscopio ottico.
    1. Colorazione HE:
      1. Deceratura e idratazione: trattare le sezioni di tessuto con xilene I e II (10 minuti ciascuno), alcol assoluto I e II (3 minuti ciascuno). Quindi, immergere le sezioni di tessuto in etanolo al 95%, 90%, 80% e 70% (2 minuti ciascuna), quindi lavare con acqua distillata per 5 minuti.
      2. Mettere le sezioni di tessuto nella colorazione con ematossilina per 5 minuti e poi differenziare le sezioni con alcol cloridrico per 5 s.
      3. Mettere la sezione nella soluzione colorante eosina per 3 minuti.
      4. Disidratazione, schiaritura e montaggio: disidratare le sezioni in tempi diversi in diversi etanoli (70%, 80%, 90%, 95% ed etanolo assoluto), quindi eliminarle in xilene I e II, quindi montarle con gomma neutra.
    2. Colorazione PAS:
      1. Seguire i passaggi di deceratura descritti al punto 5.2.1 e trattare la sezione con la soluzione di colorazione acida periodica per ~8 minuti.
      2. Sciacquare le sezioni in acqua distillata per 2 minuti e poi macchiarle con il reagente Schiff per 15 minuti al buio.
      3. Lavare le sezioni in acqua di rubinetto per 10 minuti dopo averle trattate con il reagente Schiff.
      4. Controcolorare le sezioni con ematossilina per 1 minuto e poi differenziarle con HCl-alcol per 30 s. Lavare nuovamente le sezioni in acqua di rubinetto per 5 minuti per colorare il nucleo di blu.
    3. Microscopia:
      1. Fissare i campioni in glutaraldeide al 2,5% per 3 ore, quindi sciacquarli in PBS per 3 ore. Inoltre, trattare i campioni con acido osmico all'1% per 3 ore e poi risciacquare nuovamente in PBS per 3 ore.
      2. Disidratare attraverso una serie graduale di bagni alcolici che terminano in acetone (ogni passaggio dura circa 2 ore totali).
      3. Infiltrare i campioni con una miscela di propano epossidico e resina epossidica (1:1) a temperatura ambiente (RT) per 2 ore, seguita da resina epossidica pura a 37 °C per altre 2 ore.
      4. Successivamente, polimerizzare e indurire i campioni a temperature sempre più elevate per un periodo di 36 ore prima del sezionamento. Questo processo garantisce che il tessuto sia completamente infiltrato con la resina, che viene quindi indurita per consentire un taglio sottile per la microscopia elettronica.
      5. Doppia colorazione con acetato di uranile al 3% e piombo acido, osservazione e fotografia dei campioni al microscopio elettronico entro 15 minuti.
        NOTA: Le impostazioni della microscopia elettronica a trasmissione (TEM) sono le seguenti: un ingrandimento di 7000x in modalità ad alto contrasto (Zoom-1 HC-1), con una tensione di accelerazione di 80,0 kV su un sistema TEM.
  3. Immunoistochimica
    1. Deceratura: Posizionare le sezioni di tessuto nello xilene I e II per 10 minuti ciascuna.
    2. Reidratazione: reidratare le sezioni di tessuto decerate mettendole successivamente in etanolo assoluto I e II per 3 minuti ciascuna, seguite da etanolo al 95%, 90%, 80% e 70% per 2 minuti ciascuna.
    3. Recupero dell'antigene: immergere le sezioni di tessuto in una soluzione tampone di citrato 0,1 M e acido citrico ad alta pressione per circa 5 minuti e poi raffreddare a RT.
    4. Bloccaggio: per prevenire il legame aspecifico degli anticorpi, bloccare incubando le sezioni di tessuto con il 5% di siero normale di capra a circa 37 °C per 30 minuti.
    5. Incubazione degli anticorpi primari: aggiungere gli anticorpi primari p-EGFR (diluito 1:200) e p-MAPK3/1 (diluito 1:200) su sezioni di tessuto e incubare per una notte a 4 °C all'interno di una camera umidificata.
    6. Incubazione degli anticorpi secondari: lavare le sezioni tre volte con PBS, quindi aggiungere anticorpi secondari marcati con biotina (diluiti in PBS secondo le istruzioni del produttore) sulle sezioni e incubare a 37 °C per 30 minuti.
    7. Applicare la soluzione di lavoro di streptavidina coniugata con perossidasi di rafano sulle sezioni di tessuto a 37 °C, quindi risciacquare tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
    8. Per lo sviluppo DAB, incubare le sezioni con la soluzione di sviluppo DAB (3 minuti al buio a RT), quindi risciacquare con acqua distillata. Il DAB agisce come substrato cromogeno per l'enzima perossidasi di rafano (HRP), che diventa marrone dopo l'ossidazione.
    9. Utilizzare l'ematossilina per controcolorare per circa 2 minuti, differenziare le sezioni con alcool cloridrico all'1% per 5 s, quindi lavare sotto l'acqua corrente per diventare blu.
    10. Disidratare ponendo successivamente le sezioni in una serie di etanolo da bassa ad alta concentrazione, limpido in xilene I e II, e montare le sezioni con gomma neutra.
      NOTA: Questa procedura richiede circa 18-24 ore, compresa l'incubazione notturna degli anticorpi primari.
    11. Seleziona casualmente tre campi visivi (200x) per ogni sezione e analizza i risultati della colorazione delle sezioni utilizzando il software di analisi delle immagini. Il software Image Pro Plus 6.0 è stato utilizzato seguendo i passaggi seguenti.
    12. Innanzitutto, importa un'immagine della sezione nel software.
    13. Correzione della densità: per garantire risultati accurati, eseguire una correzione della densità.
      1. Passare a Misura > Calibrazione > intensità > Nuovo > Std. Opzioni di > densità opzionali > immagine. Quindi, fare clic su un'area vuota dell'immagine per registrare il valore di sfondo e confermarlo facendo clic su OK.
    14. Impostazione dei parametri di misurazione: Impostazione dei parametri di misurazione per calcolare l'area e la densità ottica integrata (IOD).
      1. Fare clic su Misura > Conteggio/Taglia > Misura > selezionare Misure. Selezionare Area(100) e IOD, quindi fare clic su OK.
      2. Vai su Opzioni, seleziona Sfondo scuro sul campione, Prefiltro 4-Connect e fai clic su OK.
    15. Selezione del colore: per determinare con precisione la positività, selezionare i colori per rilevare le aree macchiate rispetto alle aree non colorate.
      1. Fare clic su Seleziona colori > istogramma basato > HSI. Regolare il valore H in base all'immagine mantenendo S invariato e I compreso tra zero e il valore di sfondo. Quindi, conferma facendo clic su Chiudi.
      2. Raccolta e calcolo dei dati: eseguire la raccolta e il calcolo dei dati facendo clic su Misura > Raccoglitore dati > Layout, dove sono selezionati Nome, Area (Somma) e IOD (Somma ). Quindi, fai clic su Conta > Raccogli ora > elenco dati per esportare i dati per ulteriori analisi o archiviazione.
        NOTA: Ciò ha portato a una misurazione semiquantitativa dell'espressione proteica in ciascuna sezione in termini di IOD/area, che indica la quantità di proteina presente rispetto all'area totale analizzata.
  4. Western blotting
    1. Ricavate il tessuto renale e tagliatelo a pezzetti. Mettere questi pezzi in una provetta da centrifuga da 1,5 mL, aggiungere la soluzione di lisi proteica pre-raffreddata (50 mM di Tris [pH 7,4], 150 mM di NaCl, 1% di Triton X-100, 1% di desossicolato di sodio, 0,1% di dodecil solfato di sodio [SDS]) e omogeneizzare.
    2. Lasciare in ghiaccio per 30 min, quindi centrifugare a 13400 x g per 20 min a 4 °C. Conservare il campione risultante in un congelatore a -80 °C.
    3. Usa il metodo Bradford per quantificare le proteine.
      1. Preparare la soluzione di lavoro Coomassie Brilliant Blue mescolando il reagente e l'acqua distillata in un rapporto di 1:4.
      2. Stabilire tre gruppi: bianco, gruppo proteico standard e gruppo proteico campione. Aggiungere 3 mL di soluzione di lavoro Coomassie Brilliant Blue a ciascun gruppo, insieme alla soluzione fisiologica per il gruppo bianco, alla proteina standard per il gruppo standard e alla proteina surnatante estratta per il gruppo campione.
      3. Dopo aver lasciato riposare le miscele per 5 minuti, misurarne i valori di assorbanza utilizzando uno spettrofotometro a raggi ultravioletti.
      4. Calcolare la concentrazione del campione utilizzando questa formula: Concentrazione proteica (mg/mL) = (Valore di assorbanza del campione/Valore di assorbanza della provetta standard) x Concentrazione proteica standard x 5.
    4. Aggiungere un volume uguale di tampone di carico 6x a ciascun campione proteico. Far bollire a 100 °C per 5 minuti prima di aliquotarli e conservarli in congelatore a -20 °C fino a nuovo utilizzo.
    5. Eseguire l'elettroforesi standard, il blotting e il blocco.
      1. Eseguire l'elettroforesi standard su gel di poliacrilammide SDS (PAGE) utilizzando un gel risolutivo al 12%. Applicare una tensione costante di 100 V per il gel di impilamento e di 120 V per il gel risolutivo fino a quando la parte anteriore del colorante raggiunge il fondo del gel.
      2. Trasferire le proteine su membrane di polivinilidene difluoruro (PVDF) a 100 V per 2 ore in una cella frigorifera a 4 °C utilizzando un sistema di trasferimento a umido.
      3. Dopo il trasferimento delle proteine, bloccare le membrane con il 5% di latte scremato in TBST per 1 ora a RT.
    6. Diluire gli anticorpi primari EGFR (1:2.000), p-EGFR (1:2.000), MAPK3/1 (1:2.000), p-MAPK3/1 (1:2.000), Bcl-2 (1:2.000), BAX (1:2.000) e CAPDH (1:5.000) in TBST con il 5% di BSA. Aggiungere questi anticorpi primari diluiti e incubare le membrane per una notte a 4 °C con una leggera agitazione.
    7. Dopo aver lavato la membrana tre volte con TBST, aggiungere gli anticorpi secondari diluiti (1:5.000), quindi incubazione per 1 ora. Dopo lo sviluppo del colore, eseguire l'analisi quantitativa delle bande target utilizzando il software ImageJ.
  5. Analisi qPCR
    1. Raggruppamento: assegna campioni ai gruppi: Control, DN, Irbesartan, JWSJS-L, JWSJS-M, JWSJS-H.
    2. Estrazione dell'RNA: eseguire l'omogeneizzazione dei tessuti e l'estrazione dell'RNA, seguite dall'aggiunta di cloroformio, dalla centrifugazione e dalla precipitazione dell'RNA secondo le istruzioni del produttore.
    3. Precipitazione e lavaggio dell'RNA: precipitare l'RNA con isopropanolo e lavare con etanolo.
    4. Solubilizzazione dell'RNA: Essiccare il pellet di RNA e scioglierlo in acqua trattata con DEPC.
    5. Sintesi del cDNA: Eseguire la trascrizione inversa utilizzando miscele di reazione specifiche secondo le istruzioni del produttore.
    6. Amplificazione qPCR: utilizzare primer specifici per GAPDH, MAPK3, MAPK1 ed EGFR per qPCR ed eseguire l'amplificazione secondo le istruzioni del produttore.
      Le sequenze di primer erano le seguenti:
      GAPDH: F-5'-GCAAGTTCAACGGCACAG-3', R-5'-CTCGCTCCTGGAAGATGG-3';
      MAPK3: F-5'-AGATCTGTGATTTTGGCCT-3', R-5'-TCAATGGATTTGGTGTAGC-3';
      MAPK1: F-5'-CCTCAAGCCTTCCAACCTC-3', R-5'-GCCCACAGACCAAATATCA-3';
      EGFR: F-5'-GGGGATGTGATTATTTCTG-3, R-5'-ATTTTGGTCTTTTGATTGG-3'.

6. Metodi statistici

  1. Eseguire l'analisi utilizzando un software appropriato (ad es. SPSS) e rappresentare i dati misurati come media ± deviazione standard. Se i dati soddisfano i criteri di distribuzione normale e omogeneità della varianza, confrontare i gruppi utilizzando l'ANOVA unidirezionale ed effettuare confronti multipli con il metodo Bonferroni.
  2. Utilizzare il test T2 per confronti multipli se la varianza non è omogenea. Considera P < 0,05 come statisticamente significativo.

Risultati

Seguendo il protocollo, 90 principi attivi di JWSJS sono stati infine ottenuti dall'analisi dopo lo screening e la deduplicazione secondo gli standard stabiliti di OB e DL. Questi includevano 20 tipi di Hedysarum Multijugum Maxim, 23 tipi di Epimrdii Herba, 15 tipi di Smilacis Glabrae Rhixoma, 16 tipi di Radix Rhei et Rhizome, quattro tipi di Curcumaelongae Rhizoma, 15 tipi di Cicadae Periostracum e sei tipi di componenti di Bombyx Batryticatus . Poiché ci sono molti ingredienti attivi in JWSJS, solo 20 sono elencati (vedi Tabella 1). Dopo la deduplicazione, sono stati infine ottenuti 396 target corrispondenti ai principi attivi di JWSJS.

Dopo la ricerca di geni correlati alla malattia, sono stati finalmente ottenuti 3035 geni bersaglio correlati a DN dopo la fusione e la deduplicazione. I corrispondenti bersagli di DN sono stati confrontati e analizzati con i bersagli dei principi attivi dei farmaci. L'intersezione è stata determinata, il che ha portato a 227 obiettivi di intersezione di JWSJS e DN. È stato quindi disegnato un diagramma di Wayne (vedi Figura 1A). Il diagramma di rete "farmaco-ingrediente-bersaglio" è stato costruito utilizzando il software Cytoscape 3.8.0 (vedi Figura 1B) ed è stata eseguita l'analisi topologica. Ogni nodo è stato classificato da alto a basso in base al valore del grado. I primi cinque componenti del farmaco erano quercetina, acido palmitoleico, luteolina, kaempferolo e naringenina, mentre i primi cinque bersagli erano PTGS2, PTGS1, NCoA2, AR e ESR1.

Successivamente, è stata sviluppata una rete PPI per obiettivi di intersezione JWSJS e DN (196 nodi e 1714 bordi con un valore medio di grado di 17,4). Inoltre, dopo tre screening sono stati ottenuti sette bersagli chiave che potrebbero essere i bersagli chiave della JWSJS per il trattamento della DN: MAPK14, TP53, MAPK3, MYC, HIF1A, ESR1 e MAPK1 (vedi Figura 1C).

Quindi, è stata eseguita l'analisi dell'arricchimento di OB per speculare sulle caratteristiche biologiche del bersaglio di JWSJS nel trattamento della DN. Tra BP, CC e MF, le prime dieci voci arricchite sono tracciate nella Figura 1D. I risultati mostrano che JWSJS potrebbe regolare la proliferazione, la differenziazione e l'apoptosi cellulare legandosi con fattori di trascrizione e protein chinasi in zattere di membrana e microdomini di membrana, determinando così un effetto terapeutico sulla DN. L'analisi dell'arricchimento della via KEGG è stata eseguita sui bersagli partecipanti per esplorare le potenziali vie d'azione di JWSJS nella DN. I primi trenta percorsi arricchiti sono tracciati nella Figura 1E. I risultati mostrano che il trattamento JWSJS della DN potrebbe agire su 181 vie di segnalazione, che coinvolgono principalmente lipidi e aterosclerosi, la via di segnalazione PI3K-Akt, la carcinogenesi chimica, l'epatite, il cancro alla prostata, l'apoptosi, la via di segnalazione HIF-1 e la via di segnalazione TNF.

Per esplorare ulteriormente i bersagli dei primi 30 percorsi arricchiti con KEGG, abbiamo utilizzato il software Cytoscape 3.8.0 per costruire una mappa della rete di relazioni tra le vie di segnalazione KEGG per i DN trattati con JWSJS. MAPK1, MAPK3, EGFR e AKT1 sono risultati essere bersagli di più percorsi che agiscono insieme (vedi Figura 1F), suggerendo che queste proteine possono svolgere un ruolo centrale nel mediare gli effetti di JWSJS sul DN.

Per convalidare ulteriormente i potenziali bersagli di JWSJS nel trattamento della DN, abbiamo successivamente esaminato tre bersagli chiave, MAPK1, MAPK3 ed EGFR, con valori di grado elevati nella rete PPI e nella rete della via di segnalazione KEGG. Questi sono stati agganciati molecolarmente con quercetina, acido palmitoleico e luteolina, i primi tre componenti principali di JWSJS per il trattamento DN. Le condizioni per lo screening dell'ID PDB sono le seguenti: (1) Essere derivato dall'uomo; (2) La risoluzione conformazionale ≤ 2,5 Å, cioè la più piccola possibile; (3) La sequenza conformazionale deve essere il più completa possibile, cioè il complesso strutturale deve avere informazioni sul ligando di piccole molecole; e (4) Il valore del pH cristallino dovrebbe essere il più vicino possibile al normale intervallo fisiologico del corpo umano35. Infine, gli ID PDB di MAPK1, MAPK3 ed EGFR erano 4QTA, 4QTB e 7JXQ.

Per verificare l'affidabilità del software AutoDock rispetto al sistema di docking in questo studio36, abbiamo prima riagganciato le tre proteine di MAPK1, Mapk3 ed EGFR. La conformazione del ligando nella struttura cristallina originale delle tre proteine bersaglio è stata sovrapposta ai ligandi dopo l'aggancio (Figura 2A). Sono stati quindi calcolati i valori di deviazione quadratica media (RMSD) tra la conformazione del ligando post-docking e la struttura cristallina originale. I valori RMSD erano rispettivamente 1,129, 1,201 e 1,877 Å, tutti ≤ 2Å. Ciò ha dimostrato che il metodo di docking era affidabile e poteva essere utilizzato per la successiva verifica del docking molecolare. Per confrontare e dichiarare il potenziale inibitorio dei componenti principali, sono stati quindi utilizzati come controlli i ligandi originali di MAPK1, MAPK3 ed EGFR. L'analisi di docking ha predetto con successo l'energia di legame tra luteolina, acido palmitoleico e quercetina e i tre bersagli principali. Questi erano tutti negativi e inferiori a -637; vedi Tabella 2. Da notare che l'aggancio molecolare tra luteolina e MAPK1 ha la più alta dimensione della cavità e la più bassa energia di legame. Nel complesso, i risultati del docking molecolare hanno mostrato che la luteolina, l'acido palmitoleico e la quercetina avevano una buona attività di legame con tre bersagli principali (Figura 2B, C).

L'RMSD viene utilizzato per quantificare le variazioni medie di spostamento di un gruppo selezionato di atomi in relazione a un sistema di riferimento. Nel frattempo, l'RMSF caratterizza efficacemente le alterazioni localizzate lungo la catena proteica. Il grafico RMSD (Figura 2D) mostra che i valori RMSD del complesso composto luteolina-MAPK1 e del complesso quercetina-MAPK3 si sono stabilizzati entro 5 ns. Il complesso luteolina-EGFR ha mostrato un RMSD fluttuante che varia da 0 a 35 ns; questo valore si è stabilizzato a 35 ns fino alla fine della simulazione MD a 100 ns. Tutti i complessi hanno interagito stabilmente alla fine della simulazione MD a 100 ns. Il valore RMSF è stato valutato dalla traiettoria di simulazione MD: gli atomi nel sito attivo e nella catena principale che fluttuavano implicavano minimamente un cambiamento conformazionale minimo, suggerendo che il composto guida menzionato è saldamente ancorato all'interno della cavità della tasca di legame della proteina bersaglio. I risultati del RMSF hanno mostrato fluttuazioni limitate nelle strutture complesse.

Infine, verifichiamo i risultati di cui sopra in vivo. Per prima cosa abbiamo osservato che il peso dei ratti nel gruppo modello diminuiva significativamente e GSP, LDL-C, UTP e FBG aumentavano significativamente (P < 0,05). Il peso corporeo dei ratti è aumentato significativamente nel gruppo irbesartan e in ciascun gruppo JWSJS rispetto al gruppo modello. GSP, LDL-C, UTP e FBG sono diminuiti in misura diversa (P < 0,05; vedi Tabella 3).

Quindi, la colorazione HE ha mostrato che i glomeruli nel gruppo normale avevano una dimensione normale. Avevano una struttura regolare e chiara e una membrana basale liscia, tubuli renali ben disposti e nessuna infiltrazione di cellule infiammatorie. Nel gruppo modello, i glomeruli erano ipertrofici, la membrana basale era ispessita e la matrice mesangiale era aumentata. L'interstizio è stato infiltrato da cellule infiammatorie. Le manifestazioni patologiche di ciascun gruppo di somministrazione sono state alleviate in misura diversa rispetto al gruppo modello (vedi Figura 3A).

La colorazione PAS ha mostrato che il gruppo modello aveva un aumento dei volumi glomerulari, una membrana basale ispessita e una matrice mesangiale aumentata rispetto al gruppo normale. Queste manifestazioni patologiche sono state significativamente alleviate da ciascun gruppo di somministrazione (vedi Figura 3B). Utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione, abbiamo scoperto che la membrana basale glomerulare nel gruppo modello era ispessita rispetto al gruppo normale. La matrice mesangiale è cresciuta e i processi del piede dei podociti sono stati ampiamente fusi. Le manifestazioni microscopiche dei ratti in ciascun gruppo di somministrazione sono state alleviate in misura variabile rispetto al gruppo modello (vedi Figura 3C).

Infine, sono state rilevate le espressioni di EGFR totale, p-EGFR, MAPK3/1 e p-MAPK3/1 per vedere se cambiavano nei ratti DN trattati con JWSJS. Non c'è stato alcun cambiamento significativo nell'espressione totale di EGFR e MAPK3/1 nei gruppi modello rispetto al gruppo normale. L'espressione di p-EGFR, p-MAPK3/1 e BAX è aumentata significativamente e l'espressione di BCL-2 è diminuita in modo significativo. Rispetto al gruppo modello, l'espressione di p-EGFR, p-MAPK3/1 e BAX era significativamente ridotta e l'espressione di BCL-2 era significativamente sovraregolata a vari livelli nei tessuti renali di ratto in ciascun gruppo di dosaggio (Figura 3D, E). Questo risultato è stato confermato dall'immunoistochimica (Figura 3F, G). Questo studio ha dimostrato che JWSJS potrebbe proteggere i reni nei ratti DN regolando l'espressione delle proteine p-EGFR, p-MAPK3/1, BAX e BCL-2 e riducendo l'apoptosi cellulare. Inoltre, la qPCR è stata utilizzata per valutare i livelli di espressione dell'mRNA di MAPK3, MAPK1 ed EGFR in vari gruppi. I risultati hanno rivelato che l'espressione relativa nel gruppo DN era significativamente più alta rispetto al gruppo di controllo, così come nei gruppi Irbesartan, JWSJS-L, JWSJS-M e JWSJS-H. Questo risultato corrobora ulteriormente i risultati iniziali (Figura 3H).

figure-results-1
Figura 1: La farmacologia di rete ha chiarito i potenziali bersagli e le vie di segnalazione della JWSJS nella nefropatia diabetica. (A) Diagramma di Venn dei bersagli intersecanti della JWSJS e della nefropatia diabetica. Il verde rappresenta il numero di bersagli terapeutici dei componenti JWSJS e il viola rappresenta il numero di bersagli rilevanti di DN. La parte intersecante rappresenta il numero di bersagli intersecanti (cioè il numero di bersagli di JWSJS per DN). (B) Diagramma di rete "Drug-ingredient-target" di JWSJS nel trattamento della DN. L'azzurro rappresenta gli obiettivi rilevanti della JWSJS per il trattamento della DN. Il fucsia rappresenta il principio attivo del Bombyx Batryticatus. Il verde rappresenta i principi attivi di Hedysarum Multijugum Maxim. Il blu scuro rappresenta i principi attivi di Radix Rhei et Rizoma. Il rosso rappresenta i principi attivi di Cicadae Periostracum. Il viola rappresenta i principi attivi di Epimrdii Herba. Il giallo rappresenta i principi attivi di Smilacis Glabrae Rhixoma. L'azzurro cielo rappresenta i principi attivi della Curcumaelongae Rhizoma. (C) Rete PPI di obiettivi di intersezione JWSJS e DN. (D) I 10 geni più significativi identificati tramite l'analisi ontologica dei geni bersaglio della terapia implicati nel trattamento della DN da parte della JWSJS. (E) I 30 geni più significativi identificati tramite l'analisi del percorso dei geni bersaglio della terapia implicati nel trattamento della DN da parte della JWSJS. (F) La rete di relazioni della via di segnalazione KEGG nel trattamento della DN da parte della JWSJS. Le icone gialle rappresentano le vie di segnalazione. Le icone blu rappresentano gli obiettivi dell'azione. Un grafo più grande implica che ad esso sono collegati più percorsi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Docking molecolare e visualizzazione delle traiettorie di dinamica molecolare di JWSJS nel trattamento della nefropatia diabetica. (A) Le conformazioni del ligando nella struttura cristallina originale dei tre complessi proteici bersaglio 7JXQ (a), 4QTA (b) e 4QTB (c) sono confrontate con le conformazioni del ligando dopo il docking. Verde, arancione e rosa sono rispettivamente le proteine bersaglio di EGFR, MAPK1 e MAPK3. L'oro è la molecola originale del ligando e il blu è la molecola del ligando dopo l'attracco. (B) Visualizzazione 3D del docking molecolare di JWSJS nel trattamento della nefropatia diabetica. Verde, arancione e rosa sono le proteine bersaglio 7JXQ, 4QTA e 4QTB, rispettivamente. 1a-3a rappresenta il diagramma di interazione di 7JXQ, 4QTA e 4QTB con l'inibitore originale (blu). 1b-3b rappresenta il diagramma di interazione di 7JXQ, 4QTA, 4QTB e luteolina (giallo). 1c-3c rappresenta il diagramma di interazione di 7JXQ, 4QTA, 4QTB e acido palmitoleico (fucsia). 1d-3d rappresenta il diagramma di interazione di 7JXQ, 4QTA, 4QTB e quercetina (viola). (C) Visualizzazione 2D del docking molecolare di JWSJS nel trattamento della nefropatia diabetica. 1a-3a rappresenta il diagramma di interazione di 7JXQ, 4QTA e 4QTB con l'inibitore originale. 1b-3b rappresenta il diagramma di interazione di 7JXQ, 4QTA, 4QTB e luteolina. 1c-3c rappresenta il diagramma di interazione di 7JXQ, 4QTA, 4QTB e acido palmitoleico. 1d-3d rappresenta il diagramma di interazione di 7JXQ, 4QTA, 4QTB e quercetina. (D) Analisi RMSD e RMSF delle traiettorie di dinamica molecolare di (a) luteolina e proteina bersaglio 7JXQ, (b) luteolina e proteina bersaglio 4QTA, e (c) quercetina e complessi 4QTB della proteina bersaglio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: JWSJS allevia il danno renale e sopprime l'attivazione della via di segnalazione EGFR/MAPK3/1 in esperimenti in vivo . (A) colorazione HE e (B) colorazione periodica acido-Schiff (PAS) di tessuti renali di ratto in diversi gruppi (ingrandimento, 200x; n = 10). (C) Microscopia elettronica a trasmissione di tessuto renale in diversi gruppi di ratti (Ingrandimento, 5000x; n = 3). (D) EGFR, p-EGFR, MAPK3/1, p-MAPK3/1, BAX e BCL-2 nel tessuto renale di ratto diabetico attraverso western blotting (n = 3). (E) Analisi statistica dell'espressione di p-EGFR, p-MAPK3/1, BAX e BCL-2. (F) Analisi immunoistochimica dell'espressione di p-EGFR E p-MAPK3/1 nei sei gruppi (n = 6). (G) Analisi statistica dell'espressione di p-EGFR E p-MAPK3/1. (H) analisi qPCR dell'espressione dell'mRNA di MAPK3, MAPK1 e EGFR in sei gruppi. *P < 0,05 rispetto al controllo. **P < 0,01 rispetto al controllo. ▲P < 0,05 rispetto a DN. ▲▲P < 0,01 rispetto a DN. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Informazioni su alcuni principi attivi di JWSJS. Fornisce dettagli su ciascun componente e sulle sue caratteristiche o proprietà. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Tabella dei risultati dell'aggancio dei bersagli principali e dei principali principi attivi di JWSJS. La tabella presenta i risultati degli studi di docking dei principali bersagli e dei principali componenti attivi di JWSJS. Questa tabella mostra come questi costituenti interagiscono con i rispettivi bersagli, il che può fornire informazioni sul meccanismo d'azione dei JWSJ. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Effetto del JWSJS sul peso corporeo e sugli indici biochimici nei ratti con nefropatia diabetica (espresso come media ± deviazione standard, n = 10). Rispetto al gruppo normale: * P < 0,05. Rispetto al gruppo di modelli: # P < 0,05. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

Il nostro studio ha impiegato una combinazione di farmacologia di rete, docking molecolare e modelli animali in vivo . Un passo fondamentale è stata la creazione della rete "drug-component-target", che è stata cruciale per identificare i potenziali meccanismi di JWSJS nel trattamento della DN, concentrandosi in particolare sulla sua interazione con la via di segnalazione EGFR/MAPK3/1.

Durante questo studio, abbiamo apportato diverse modifiche, in particolare nel processo di docking molecolare, per migliorare l'accuratezza delle nostre previsioni. La risoluzione dei problemi si è concentrata principalmente sull'ottimizzazione delle condizioni per il modello animale in vivo per garantirne la rilevanza per la DN umana. Identificando i componenti attivi chiave e i bersagli di JWSJS, questo studio fornisce una base teorica per ulteriori ricerche e sviluppo di JWSJS come potenziale candidato farmacologico per il trattamento DN.

Lo studio ha indagato il potenziale meccanismo d'azione di JWSJS nel ridurre l'apoptosi renale nella DN. I risultati del docking molecolare hanno mostrato che la quercetina, l'acido palmitoleico e la luteolina hanno attività di legame regolari con bersagli chiave, tra cui MAPK1, MAPK3 ed EGFR. Abbiamo selezionato questi obiettivi per ulteriori studi a causa della loro azione comune in molteplici percorsi. Nei ratti DN, il trattamento con JWSJS ha determinato una significativa diminuzione dei livelli di FBG e GSP, un miglioramento di UTP e LDL-C, un aumento di peso e un miglioramento delle manifestazioni microscopiche del tessuto renale, indicando la potenziale efficacia di JWSJS nel trattamento della DN.

L'apoptosi è una modalità critica di morte cellulare e la disregolazione può aumentare il rischio di varie malattie38. Studi precedenti hanno dimostrato che i ratti DN avevano un aumento dell'espressione delle proteine correlate all'apoptosi BAX e caspasi-3 e un aumento significativo del numero di cellule apoptotiche nel tessuto renale39,40. I risultati hanno mostrato che il trattamento JWSJS ha invertito questi cambiamenti, suggerendo che può attenuare l'apoptosi dei podociti in condizioni diabetiche.

Ulteriori indagini sul potenziale meccanismo d'azione di JWSJS hanno dimostrato che ha un effetto multi-target e multi-pathway sulla DN. Ci siamo concentrati sullo studio di MAPK1, MAPK3 ed EGFR, poiché avevano il maggior numero di percorsi di arricchimento. La via ERK, che è coinvolta in vari processi fisiologici e patologici come la crescita cellulare, la proliferazione, la differenziazione, l'apoptosi e la secrezione anomala di steroidi, è una via essenziale nella via di trasduzione del segnale MAPK 13,41,42,43. Ha dedotto che JWSJS ha salvato l'apoptosi dei podociti inibendo la via di segnalazione EGFR/MAPK3/1.

Abbiamo anche scoperto che JWSJS potrebbe regolare l'espressione di p-EGFR e p-MAPK3/1, con conseguente aumento marcato dei livelli di Bcl-2 ma una notevole sottoregolazione di Bax. Questo, a sua volta, ha portato a una riduzione dell'apoptosi delle cellule renali. Risultati simili sono stati trovati in studi precedenti. Ad esempio, Chen ha riferito che la delezione dell'EGFR nei podociti attenua la nefropatia diabetica44. Alcuni ricercatori hanno scoperto che la via EGFR/ERK promuove la proliferazione e la differenziazione delle cellule epiteliali intestinali suine9. L'inibizione dell'EGFR può ridurre l'espressione di TGF-β e BAX, migliorando così la fibrosi renale e l'apoptosi45. Questi risultati suggeriscono che la JWSJS è una prescrizione della medicina tradizionale cinese con un ruolo significativo nella terapia adiuvante della DN inibendo la via del segnale EGFR/MAPK3/1. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per comprendere appieno il potenziale meccanismo d'azione della JWSJS nel trattamento della DN.

C'erano diverse limitazioni a questo studio. In primo luogo, la dipendenza da modelli animali potrebbe non replicare completamente la risposta umana alla JWSJS. Inoltre, le previsioni farmacologiche di rete, sebbene approfondite, richiedono un'ulteriore convalida attraverso dati sperimentali. Sono necessari ulteriori studi clinici su soggetti umani per convalidare i risultati. In secondo luogo, sebbene la farmacologia di rete sia uno strumento utile per analizzare le relazioni farmaco-malattia, i risultati dovrebbero essere interpretati con cautela in quanto si basano su previsioni piuttosto che su dati sperimentali. In terzo luogo, il meccanismo d'azione del JWSJS per il trattamento della DN rimane poco chiaro e lo studio si è concentrato solo sui potenziali bersagli di MAPK1, MAPK3 ed EGFR.

I metodi utilizzati in questo studio possono essere applicati ad altre formulazioni della medicina tradizionale cinese, portando potenzialmente alla scoperta di nuove opzioni terapeutiche per la DN e altre malattie complesse. Inoltre, questo approccio pone le basi per l'integrazione della medicina tradizionale e moderna nella futura ricerca farmacologica. Sono necessari ulteriori studi per chiarire completamente i meccanismi molecolari alla base degli effetti terapeutici della JWSJS. Infine, lo studio non ha indagato i potenziali effetti collaterali o la tossicità dei JWSJS, che sono considerazioni importanti nello sviluppo di qualsiasi nuovo farmaco. Sono necessarie ulteriori ricerche per valutare la sicurezza della JWSJS e garantirne l'applicazione clinica.

In sintesi, questo studio indaga principalmente il potenziale terapeutico di Jiawei Shengjiang San per la nefropatia diabetica utilizzando la farmacologia di rete, il docking molecolare e la convalida animale in vivo . Enfatizza gli aspetti procedurali, concentrandosi sulla metodologia impiegata per comprendere le interazioni tra JWSJS e la via di segnalazione EGFR/MAPK3/1 e su come queste interazioni possano potenzialmente ridurre l'apoptosi delle cellule renali nella DN.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto dal progetto generale della Fondazione di Scienze Naturali della Provincia di Hebei, Cina (n. H2019423037).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2&volte; SYBR Miscela Master qPCR verde Servicebio, Wuhan, CinaG3320-05
Quantificazione delle proteine urinarie 24 ore su 24 (UTP)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
3,3'-DiaminobenzidinaShanghai Huzheng Biotech, Cina91-95-2
Strumento automatico di analisi biochimicaHitachi, Giappone7170A
Etanolo anidroBiosharp, Tianjin, CinaN/A
BAX Anticorpi primari Affinity, USAAF0120Rat
BCL-2 Anticorpi primari Affinity, USAAF6139Rat
BX53 microscopioOlimpo, GiapponeBX53
cloroformio sostitutoECOTOP, Guangzhou, CinaES-8522
Desmond software New York, NY, USARilascio 2019-1
Bagno d'acqua a temperatura costanteChangzhou Jintan Liangyou Instrument, CinaDK-8D
EGFR Anticorpi primari.Affinity, USAAF6043Rat
Embed-812 RESINShell Chemical, USA14900
Glicemia a digiuno (FBG)Nanjing Jiancheng Institute of BiologicalEngineering N/A
Analizzatore di etichette enzimatiche a lunghezza d'onda intera di tipo FCMultiskan; Thermo, USAN/A
GAPDH  Anticorpi primari Affinity, USAAF7021Proteina
sierica glicata di ratto (GSP)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
Microscopio elettronico a trasmissioneHitachi, GiapponeH-7650
Soluzione colorante per ematossilina/eosina (HE)Servicebio, USAG1003
Image-Pro PlusMEDIA CYBERNETICS, USAN/A
Strumento di amplificazione PCR in tempo realeApplied Biosystems, USAiQ5 
Compresse di IrbesartanHangzhou Sanofi PharmaceuticalsN/A
IsopropanoloBiosharp, Tianjin, CinaN/A
  Granuli JWSJSGuangdong Yifang PharmaceuticalN/A
Kodak Image Station 2000 MM sistema di imagingKodak, USAIS2000
Colesterolo a bassa densità (LDL-C)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
MAPK3/1Anticorpi primari Affinity, USAAF0155Rat
Medical CentrifugeHunan Xiangyi Laboratorio Strumento di Sviluppo, Cina TGL-16K
Mini sistema di trasferimento trans-blotBio-Rad, USAN/A
Sistema di elettroforesi Mini-PROTEANBio-Rad, USAN/A
Spettrofotometro NanoVue Plus HealthcareBio-Sciences AB, Svezia111765
p-EGFR Anticorpi primari Affinity, USAAF3044Rat
Soluzione di colorazione periodica acido-Schiff (PAS)Servicebio, USAG1008
p-MAPK3/1 Anticorpi primari Affinity, USAAF1015Anticorpi secondari per ratto
  Santa Cruz, USAsc-2357Coniglio
StreptozotocinaSigma, USAS0130
SureScript Kit di sintesi del cDNA del primo filamentoGeneCopeia, USAQP056T
Reagente TriQuickSolarbio, Pechino, CinaR1100
Banco di lavoro ultra-pulitoSuzhou Apparecchiature di purificazione, CinaSW-CJ-1F 
Digitale

Riferimenti

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