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Articolo metodologico

Tre strategie per indurre cheratite neurotrofica e rigenerazione nervosa nella cornea murina

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DOI:

10.3791/66182

⸱

8 dicembre 2023

 ,  ,  , 
1Institute for Neurosciences of Montpellier, University of Montpellier, INSERM, 2Department of Ophthalmology, Gui de Chauliac Hospital

In questo articolo

Sommario

Qui proponiamo tre diversi metodi per danneggiare le fibre sensoriali che innervano la cornea. Questi metodi facilitano lo studio della rigenerazione degli assoni nei topi. Questi tre metodi, adattabili ad altri modelli animali, sono ideali per lo studio della fisiologia e della rigenerazione dell'innervazione corneale.

Abstract

La cornea è un tessuto trasparente che copre l'occhio ed è fondamentale per una visione chiara. È il tessuto più innervato del corpo. Questa innervazione fornisce sensibilità e funzione trofica all'occhio e contribuisce a preservare l'integrità corneale. L'interruzione patologica di questa innervazione è definita cheratite neurotrofica. Questo può essere innescato da lesioni all'occhio, interventi chirurgici o malattie. In questo studio, proponiamo tre diversi protocolli per infliggere danni all'innervazione in modi che ricapitolano i tre tipi di casi generalmente riscontrati in clinica.

Il primo metodo consiste nell'effettuare un'abrasione dell'epitelio con una fresa oftalmica. Ciò comporta la rimozione dello strato epiteliale, delle terminazioni nervose libere e del plesso sottobasale in modo simile all'intervento di cheratectomia fotorefrattiva eseguito in clinica. Il secondo metodo mira solo all'innervazione sezionandola alla periferia con un punzone da biopsia, mantenendo l'integrità dell'epitelio. Questo metodo è simile alle prime fasi della cheratoplastica lamellare e porta a una degenerazione dell'innervazione seguita dalla ricrescita degli assoni nella cornea centrale. L'ultimo metodo danneggia l'innervazione di un modello murino transgenico utilizzando un microscopio multifotone, che localizza in modo specifico il sito di cauterizzazione delle fibre nervose fluorescenti. Questo metodo infligge gli stessi danni della fotocheratite, una sovraesposizione alla luce UV.

Questo studio descrive diverse opzioni per studiare la fisiopatologia dell'innervazione corneale, in particolare la degenerazione e la rigenerazione degli assoni. Promuovere la rigenerazione è fondamentale per evitare complicazioni come difetti dell'epitelio o persino la perforazione della cornea. I modelli proposti possono aiutare a testare nuove molecole farmacologiche o terapie geniche che migliorano la rigenerazione nervosa e limitano la progressione della malattia.

Introduzione

La cornea, che è la superficie trasparente dell'occhio, è composta da tre strati distinti: l'epitelio, lo stroma e l'endotelio. Questo organo ha la più alta densità di innervazione nel corpo ed è composto principalmente da fibre sensoriali (tipi Aδ e C) che originano dal ramo oftalmico del ganglio trigemino. Le fibre sensoriali penetrano nella periferia della cornea nello stroma medio sotto forma di grandi fasci che si ramificano per coprire la superficie. Quindi si biforcano per perforare la membrana di Bowmann e formare il plesso sottobasale, che è facilmente riconoscibile per la formazione di un vortice al centro della cornea. Queste fibre terminano come terminazioni nervose libere sulla superficie esterna dell'epitelio. Sono in grado di trasdurre stimoli termici, meccanici e chimici e di rilasciare fattori trofici essenziali per l'omeostasi dell'epitelio 1,2. La cheratite neurotrofica (NK) è una malattia degenerativa che colpisce l'innervazione sensoriale corneale. Questa malattia rara deriva da una diminuzione o da una perdita della sensibilità corneale che si traduce in una minore produzione di lacrime e scarse proprietà curative della cornea3. La NK progredisce attraverso tre fasi ben descritte, dalla fase 1 in cui i pazienti soffrono di difetti epiteliali, alla fase 3 in cui si verificano la fusione stromale e/o la perforazione corneale4.

Dal punto di vista clinico, le origini di questa malattia possono essere diverse. I pazienti possono perdere l'innervazione corneale dopo lesioni fisiche all'occhio, interventi chirurgici o malattie croniche, come il diabete 5,6. Ad oggi, il processo di patogenesi delle NK rimane poco compreso e le opzioni terapeutiche per questa condizione pericolosa per la vista sono molto limitate. Pertanto, è necessaria una migliore comprensione delle caratteristiche dei difetti epiteliali per comprendere meglio i meccanismi alla base della rigenerazione di tali fibre e potenzialmente promuoverle. Qui, proponiamo diversi modelli di lesioni corneali che inducono NK nei topi.

Il primo modello è l'abrasione dello strato epiteliale della cornea con una bava oculare. Questo modello è stato studiato principalmente nel contesto della rigenerazione dell'epitelio in diversi animali, come roditori e pesci 7,8,9, e per testare molecole che promuovono la guarigione corneale10,11. Fisiologicamente, ci vogliono 2-3 giorni perché le cellule epiteliali chiudano la ferita. Il modello fisiologico dell'innervazione, tuttavia, impiega più di quattro settimane per riprendersi dall'abrasione12,13. Durante l'intervento chirurgico, la bava oculare rimuove lo strato epiteliale della cornea che contiene il plesso sottobasale e le terminazioni nervose libere delle fibre. Questa procedura può essere clinicamente paragonata a quella dei pazienti con cheratectomia fotorefrattiva (PRK) per correggere i difetti refrattivi oculari. La procedura consiste nell'asportazione dell'epitelio della cornea e nel rimodellamento dello stroma con un laser14. I pazienti possono manifestare diversi effetti collaterali a seguito di tale intervento chirurgico, come una diminuzione della densità del nervo corneale per 2 anni e una riduzione della sensibilità per una durata da 3 mesi a un anno dopo l'intervento chirurgico15. Dato che l'intervento chirurgico induce una fragilità del microambiente corneale, questo modello potrebbe aiutare a studiare questi effetti collaterali e sviluppare approcci terapeutici che promuoverebbero una reinnervazione più rapida, riducendo così gli effetti collaterali in questione.

Il secondo modello consiste nel sezionare gli assoni alla periferia della cornea con un punzone bioptico, inducendo una degenerazione walleriana dell'innervazione centrale 16. Dal punto di vista clinico, questo metodo potrebbe essere paragonato alla cheratoplastica lamellare anteriore, in cui il chirurgo realizza una trapanazione parziale della cornea per rimuovere una parte dello spessore anteriore della cornea e sostituirla con un trapianto da donatore 17. Dopo la cheratoplastica lamellare, i pazienti possono soffrire di una serie di sintomi tra cui secchezza oculare, perdita di innervazione corneale e rigetto del trapianto18. Questo modello di assotomia eseguito sui nervi corneali potrebbe fornire informazioni sui meccanismi della degenerazione delle fibre, che si verifica dopo un innesto, seguita dalla rigenerazione degli assoni.

Il terzo metodo danneggia i nervi corneali con un laser. Utilizzando un microscopio multifotone sulla cornea di animali anestetizzati viene indotta la degenerazione dei nervi localizzati nel campo ottico a seguito della formazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), che porta al danno del DNA e alla cavitazione cellulare19. Questo metodo ricapitola il fotodanno corneale indotto dalla sovraesposizione ai raggi UV naturali (scottature solari), che innesca anche la formazione di ROS, portando al danno al DNA20. I pazienti che soffrono di scottature solari corneali provano un grande dolore, poiché il deterioramento delle cellule epiteliali priva le estremità delle fibre corneali di tutto.

I tre metodi qui descritti sono progettati per consentire lo studio del processo di patogenesi NK e della rigenerazione degli assoni. Sono facilmente riproducibili e precisi. Inoltre, consentono un rapido recupero e un facile monitoraggio degli animali.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal National Animal Experiment Board.

1. Preparativi

  1. Preparare una soluzione anestetica di ketamina-xilazina per l'anestesia. Iniettare ketamina a 80 mg/kg e xilazina a 10 mg/kg diluendo 200 μL di ketamina (100 mg/mL) e 125 μL di xilazina (20 mg/mL) in 2.175 mL di NaCl sterile allo 0,9%.
  2. Preparare una soluzione 0,02 mg/mL di buprenorfina come soluzione analgesica aggiungendo 100 μL di buprenorfina 0,3 mg/mL a 1.400 mL di NaCl sterile allo 0,9%.
  3. Preparare la soluzione colorante fluorescente.
    1. Utilizzare una bilancia fine per pesare 10 mg di sale di fluoresceina e diluirlo in 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per ottenere una soluzione di fluoresceina allo 0,1%.
    2. Proteggere la soluzione dalla luce e agitarla per 5 min. Utilizzare una siringa da 10 mL e un filtro per siringa da 0,2 μm per filtrare la soluzione.
      NOTA: La soluzione fluorescente deve essere protetta dalla luce e può essere conservata a +4 °C per 5 giorni.
  4. Preparazione del mouse
    1. Pesare il topo e indurre l'anestesia eseguendo un'iniezione intraperitoneale di 10 μL/g di peso del topo (MW) della soluzione anestetica. Quando il mouse smette di muoversi, posizionarlo su una piastra riscaldata (37 °C) e verificare che sia completamente anestetizzato pizzicando le dita dei piedi.
    2. Applicare una goccia di lacrima artificiale sull'occhio sottoposto all'intervento chirurgico e una goccia di gel oculare sull'occhio controlaterale.
    3. Una volta che il topo non risponde al pizzicamento, iniettare l'analgesia (0,02 mg/mL di buprenorfina) a 5 μL/g di MW per fornire 0,1 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea nel collo.

2. Abrasione della cornea

  1. Seguire il passaggio 1.3 per preparare la soluzione colorante fluorescente.
  2. Seguire il passaggio 1.4 per preparare il mouse.
  3. Prima di eseguire l'abrasione, immergere la bava oculare in EtOH al 70% e poi in PBS per pulirla.
  4. Posizionare il mouse su una piastra riscaldata (37 °C) sul lato per accedere facilmente all'occhio sottoposto all'intervento.
    1. Usa un batuffolo di cotone per assorbire la lacrima artificiale e spazzola via le ciglia senza toccare l'occhio.
    2. Accendi la bava oculare, apri la palpebra del mouse con due dita e contemporaneamente blocca le vibrisse per evitare che rimangano incastrate nella bava.
  5. Localizzare la pupilla o il centro dell'occhio e applicare la bava oculare sulla superficie dell'occhio e fare movimenti circolari. Osservando da vicino, è possibile osservare la superficie dell'epitelio rimosso. Altrimenti, fai circa 20 movimenti circolari sulla cornea.
  6. Rimetti il topo sulla pancia e controlla se il gel oculare è ancora presente nell'occhio controlaterale.
  7. Applicare una goccia di soluzione colorante fluorescente sull'occhio abraso e attendere 20 s. Assorbire la goccia con un fazzoletto senza toccare l'occhio e risciacquare con una goccia di lacrima artificiale. Assorbire la goccia della lacrima artificiale con un fazzoletto e illuminare l'occhio con la lampada al cobalto blu.
    NOTA: L'abrasione deve avere una forma circolare. Ci vuole un po' di allenamento per ottenerlo.
  8. Applicare una goccia di gel oculare sull'occhio abraso e lasciare che il mouse si svegli sul pad riscaldato. Quando il topo si muove da solo, rimettilo nella sua gabbia.
  9. Verificare il benessere dell'animale durante i 2 giorni successivi.
  10. Dopo l'uso della fresa oculare, utilizzare un tessuto molle per rimuovere le cellule epiteliali bloccate nella testa della fresa e immergerlo in EtOH al 70% e poi PBS.
    NOTA: Una volta rimosse le cellule epiteliali con il tessuto molle, assicurarsi che nessun pezzo di tessuto sia bloccato nella testa della fresa.

3. Assotomia dei nervi corneali

  1. Seguire il passaggio 1.4 per preparare il mouse.
  2. Posizionare il mouse sotto una lente binoculare sul lato per accedere all'occhio sottoposto all'intervento chirurgico. Metti il fondo di una capsula di Petri sotto la testa del topo in modo che l'occhio sia orizzontale.
    NOTA: I seguenti passaggi verranno eseguiti guardando attraverso la lente binoculare.
  3. Rimuovere la lacrima artificiale con un batuffolo di cotone e rimuovere le ciglia senza toccare l'occhio.
  4. Posiziona delle pinze lisce e curve sotto l'occhio dell'animale in modo da farlo uscire dall'orbita. Assicurati di chiudere la pinza abbastanza in modo che l'occhio non sia in grado di tornare nell'orbita una volta applicata la pressione, ma non eccessivamente per evitare danni al nervo ottico.
  5. Applicare il punzone bioptico di 2,5 mm verticalmente sull'occhio senza pressione per garantire il contatto totale del punzone con la superficie della cornea.
    NOTA: Una volta applicato il punzone contro la cornea, la mano dello sperimentatore potrebbe interferire con il campo visivo.
  6. Quindi, inizia ad applicare pressione e ruota il punzone più volte.
    NOTA: A seconda della pressione, il numero di torsioni può variare, ma generalmente è di circa 5. Richiede allenamento per sentire la giusta pressione e movimento. Se viene applicata troppa pressione, l'occhio si rompe. In questo caso, si può osservare il liquido che esce dalla lesione e l'occhio si ammorbidisce. L'animale deve essere sacrificato.
  7. Rimuovere il punzone per biopsia. Deve essere visibile un cerchio sulla cornea in cui è stato applicato il punzone bioptico.
    NOTA: I passaggi successivi non richiedono la lente binoculare.
  8. Controllare se l'occhio controlaterale ha ancora il gel oculare e applicarne un po' sull'occhio assotomizzato.
  9. Lascia che il mouse si svegli su un tappetino riscaldato (37 °C) e rimettilo nella sua gabbia quando si muove da solo.
  10. Verificare il benessere dell'animale durante i 2 giorni successivi.

4. Elaborazione dell'intero monte corneale

  1. Raccolta e fissazione del campione.
    1. Pesare il topo e indurre l'anestesia eseguendo un'iniezione intraperitoneale di 10 μL/g di peso del topo (MW) della soluzione anestetica.
    2. Quando il mouse smette di muoversi e non ha riflessi pizzicando le dita dei piedi, eseguire una lussazione cervicale.
    3. Estrarre l'occhio dall'orbita usando due dita ed enucleare l'occhio tagliando il nervo ottico con forbici curve.
    4. Mettere l'occhio in una provetta di plastica da 2 ml contenente PBS.
    5. Fissare l'occhio sostituendo il PBS con il 4% di paraformaldeide e ponendolo su uno shaker (30 giri/min) a temperatura ambiente (RT) per 20 min.
    6. Risciacquare 3 volte per 10 minuti con PBS a RT su uno shaker (30 giri/min).
  2. Dissezione della cornea
    1. Metti una goccia di PBS su un pezzo di parafilm all'interno di una capsula di Petri.
    2. Metti l'occhio in questa goccia di PBS.
    3. Posizionare la capsula di Petri sotto la lente binoculare.
    4. Sezionare la cornea utilizzando forbici e pinze per microdissezione. Taglia sopra il corpo ciliare per mantenere il limbus.
    5. Rimuovere il cristallino, il corpo ciliare e l'iride con una pinza fine.
    6. Rimetti la cornea in una provetta di plastica da 2 ml.
  3. Protocollo di immunofluorescenza
    1. Incubare la cornea in 2 ml di gelatina di pelle di pesce al 2,5%, siero di capra al 5% e detergente allo 0,5% in PBS per 1 ora a RT su uno shaker (30 giri/min).
    2. Incubare la cornea in 150 μL di una soluzione di gelatina di pelle di pesce al 2,5%, siero di capra al 5% e detergente allo 0,1% in PBS contenente l'anticorpo primario diluito a 1/1000 (anticorpo antitubulina βIII) per una notte a 4 °C su uno shaker (30 rpm).
    3. Risciacquare 3 volte per 1 ora con detersivo allo 0,1% in PBS a RT su uno shaker (30 giri/min).
    4. Incubare la cornea nella stessa soluzione del passaggio 4.3.2, contenente l'anticorpo secondario diluito a 1/500 per una notte a 4 °C su uno shaker (30 giri/min).
    5. Risciacquare 3 volte per 1 h con PBS a RT su uno shaker (30 giri/min).
    6. Incubare la cornea per 10 minuti con 150 μL di DNA intercalator diluito a 1/5000 a RT su uno shaker (30 rpm).
    7. Risciacquare 2 volte per 5 minuti con PBS.
  4. Montaggio della cornea
    1. Posiziona la cornea su un vetrino, con l'epitelio rivolto verso il vetrino, e usa un bisturi per creare quattro sezioni senza raggiungere il centro.
      NOTA: Eseguire le sezioni opposte l'una all'altra per formare una forma a fiore.
    2. Posizionare l'endotelio corneale rivolto verso il vetrino e rimuovere il PBS intorno alla cornea utilizzando un fazzoletto.
      NOTA: Non rimuovere il PBS sotto la cornea; in caso contrario, potrebbero comparire bolle d'aria. In tal caso, aggiungere PBS alla cornea e rimuovere la bolla d'aria. Quindi riavviare dal passaggio 4.3.2.
    3. Aggiungere la pasta per modelli sui quattro angoli di un vetrino coprioggetto rettangolare.
      NOTA: La pasta modella eleva il vetrino coprioggetto poiché la cornea è un tessuto spesso.
    4. Far cadere 50 μL di un mezzo di montaggio sulla cornea e posare con cura il vetrino coprioggetti sopra per evitare la formazione di bolle.
    5. Sigillare il vetrino coprioggetto con lo smalto.
  5. Imaging
    1. Posizionare il vetrino sotto un microscopio a epifluorescenza.
    2. Definisci la dimensione del mosaico e la profondità dell'immagine e avvia l'acquisizione.
    3. Applicare un programma di sfocatura e deconvoluzione sull'immagine acquisita.
      NOTA: Il passaggio 4.6.3 è un'opzione selezionata sul software di acquisizione (Large Volume Computational Clearing [LVCC])

5. Ablazione laser localizzata dei nervi corneali

  1. Accendere il microscopio multifotone verticale e il laser combinato con un oscillatore ottico parametrico. Attivare il tavolino riscaldato del microscopio (37 °C) e impostare i laser a 850 nm e 1100 nm, corrispondenti alle lunghezze d'onda richieste per il modello murino.
  2. Utilizzare un misuratore di potenza per impostare contemporaneamente la potenza dei laser a circa 20 mW.
  3. Seguire il passaggio 1.4 per preparare il mouse e applicare il gel oculare su entrambi gli occhi.
    NOTA: L'animale utilizzato per questo protocollo deve provenire da una linea murina transgenica (topo transgenicoMAGIC-Marker 21) che esprime un fluoroforo endogeno nelle fibre nervose corneali.
  4. Installa l'animale in un supporto per la testa. Ruota l'animale di 90° in modo che l'occhio di interesse sia rivolto verso il soffitto.
  5. Lega le vibrisse dell'animale per liberare la zona degli occhi. Lega il corpo dell'animale per ridurre il movimento della testa indotto dalla respirazione.
  6. Posizionare un vetrino coprioggetto circolare sull'occhio sopra il gel oculare. Il vetrino coprioggetto deve essere orizzontale. Non esitate a muovere la testa dell'animale per posizionare correttamente il vetrino coprioggetti.
  7. Aggiungi una goccia di PBS sopra il vetrino coprioggetti. Posizionare con cura l'animale sul tavolino del microscopio e posizionare la torretta dell'obiettivo alla giusta distanza.
  8. Utilizzare l'obiettivo acquoso 20x e l'epifluorescenza per localizzare l'occhio e l'innervazione attraverso l'oculare.
  9. Attivare i laser e definire la profondità da illuminare.
  10. Acquisizione di immagini 1024 x 1024 (pixel) a una velocità di acquisizione del 70%-85% della velocità di scansione massima.
  11. Una volta acquisita l'immagine, togliere l'animale dal microscopio e rimuovere il vetrino coprioggetto e le cinghie. Rimuovere l'animale dal supporto per la testa, aggiungere altro gel oculare se necessario e lasciarlo svegliare in una gabbia su una piastra riscaldata.
    NOTA: La distruzione dell'innervazione può essere osservata 1 settimana dopo l'imaging. Questo protocollo può essere ripetuto una volta alla settimana per diverse settimane per aumentare i danni causati dai laser.
  12. Quando l'animale si muove da solo, rimetti la gabbia nella stalla e controlla il suo benessere per i 2 giorni successivi.

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Risultati

Questo studio propone diversi protocolli per infliggere danni all'innervazione corneale nei topi. Mentre protocolli simili sono stati utilizzati per studiare la fisiopatologia della guarigione dell'epitelio, abbiamo scelto di adattare e sviluppare nuovi metodi per studiare la rigenerazione dell'innervazione corneale. Per osservare l'innervazione, abbiamo usato due tecniche. In primo luogo, abbiamo impiegato una tecnica di immunofluorescenza per colorare le fibre nervose utilizzando un anticorpo pan-neuronale (tubulina BI...

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Discussione

La cheratite neurotrofica è considerata una malattia rara, che colpisce 5 individui su 10.000. Tuttavia, le persone che soffrono di NK a causa di una lesione fisica come ustioni chimiche o sindromi come il diabete o la sclerosi multipla non sono incluse in tali statistiche3. Inoltre, questa condizione rimane significativamente sottodiagnosticata22 e la prevalenza della malattia è sottostimata. C'è un forte bisogno di nuovi trattamenti e terapie che promuovano la rigenerazio...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano la dottoressa Karine Loulier per l'accesso alla linea di topi transgenici MAGIC-Markers. Gli autori ringraziano anche la struttura RAM-Neuro e la struttura di imaging MRI, un membro dell'infrastruttura nazionale France-BioImaging supportata dall'Agenzia Nazionale Francese per la Ricerca (ANR-10-INBS-04, "Investimenti per il futuro"). Questa ricerca è stata sostenuta dal programma ATIP-Avenir, dall'Inserm, dalla Région Occitanie, dall'Università di Montpellier, dall'Agenzia Nazionale Francese per la Ricerca (ANR-21-CE17-0061), dalla Fondation pour la Recherche Médicale (FRM Regenerative Medicine, REP202110014140) e dalla Fondazione Groupama.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,2 µ m seringe filtroCLEARLINE51733
0,5 mm antiruggineAlger Equipment CompanyBU-5S
2 mL tubi di plasticaEppendrof 
Algerbrush burr, strumento completoAlger Equipment CompanyBR2-5
Anticorpo anti-beta III TubulinaAbcamab18207
AntigenfixDiapathP0016
Lacrima artificialeLarmes artificielles MartinetN/A
BuprecareAnimalcareN/A
Batuffolo di cotoneQualsiasi fornitoreN/A
Strumenti di dissezione Strumenti perle scienze finiN/A
FluoresceinaMerck103887
Gelatina da pelle di pesce d'acqua freddaSigmaG7765
Siero di capraMerckS26
Supporto per la testaNarishigeSGM 4
PiastrariscaldataStrumenti BIOSEB LABBIO-HE002
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
Imalgene 1000BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH FranceN/A Numeroautorizzazione all'immissione in commercio francese: FR/V/0167433 4/1992
Software LAS XLeicaN/AProcesso di compensazione computazionale per grandi volumi (LVCC)
Laser Chameleon Ultra IICoherentN/A Misuratore
potenza laserCoerenteN/A
Leica Thunder Imager Microscopio tissutaleLeicaN/A
Microscopio verticale Zeiss LSM 7MP multi-fotoneZeissN/A
Ocry-gelTVM labN/A Oscillatore
parametricoCoerenteN/A
Penne con blu filtro in cobaltotappoBernellALPEN
Piastra di PetriThermo Scientific150318Protocollo di assotomia
PetridishThermo Scientific150288Cornea elaborazione a montaggio intero
Rompun 2%ElancoN/A Numeroautorizzazione all'immissione in commercio francese: FR/V/8146715 2/1980
Punzone per biopsia sterile 2,5 mmLCH medicoLCH-PUK-25
Triton X-100VWR0694
VectashieldEuroBioSciencesH-1000Supporto di montaggio
anello 30120094 di di di

Riferimenti

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