Articolo metodologico

Monitoraggio della glicemia nella prole di topo dopo l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi

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DOI:

10.3791/66212

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17 maggio 2024

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1Shanghai-MOST Key Laboratory of Health and Disease Genomics, 2NHC Key Lab of Reproduction Regulation, 3Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies, 4International Peace Maternity and Child Health Hospital, 5School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 6Shanghai Key Laboratory of Embryo Original Diseases

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per stabilire un modello murino di iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI)-trasferimento di embrioni (ET), che ci consente di osservare i cambiamenti legati all'età nel metabolismo del glucosio che possono essere attribuiti all'ICSI, fornendo informazioni sui suoi potenziali impatti a lungo termine sullo sviluppo umano.

Abstract

La durata della vita umana è considerevolmente lunga, mentre i modelli murini possono simulare l'intera durata della vita umana in un periodo relativamente breve, con un anno di vita del topo equivalente all'incirca a 40 anni umani. L'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI) è una tecnologia di riproduzione assistita comunemente utilizzata nella pratica clinica. Tuttavia, data la sua comparsa relativamente recente circa 30 anni fa, gli effetti a lungo termine di questa tecnica sullo sviluppo umano rimangono poco chiari. In questo studio, abbiamo stabilito il metodo ICSI combinato con il trasferimento di embrioni (ET) utilizzando un modello murino. I risultati hanno dimostrato che gli spermatozoi di topo normali, dopo essere stati sottoposti a coltura in vitro e successiva ICSI, hanno mostrato un tasso di fecondazione dell'89,57% e un tasso di due cellule dell'87,38%. Dopo l'ET, il tasso di natalità della prole era di circa il 42,50%. Inoltre, con l'avanzare dell'età dei topi, sono state osservate fluttuazioni nei livelli di metabolismo del glucosio, che possono essere associate all'applicazione della tecnica ICSI. Questi risultati indicano che la tecnica ICSI-ET del topo fornisce una piattaforma preziosa per valutare l'impatto delle anomalie spermatiche sullo sviluppo embrionale e i loro effetti a lungo termine sulla salute della prole, in particolare per quanto riguarda il metabolismo del glucosio. Questo studio fornisce importanti spunti per ulteriori ricerche sui potenziali effetti della tecnica ICSI sullo sviluppo umano, sottolineando la necessità di un'indagine approfondita sulle implicazioni a lungo termine di questa tecnologia.

Introduzione

I problemi di fertilità sono emersi come uno dei principali punti di interesse medico e sociologico, soprattutto nella società moderna, dove il calo dei tassi di fertilità e la crescente gravità della prevalenza e della gravità dell'infertilità sono saliti alla ribalta. La tecnologia di riproduzione assistita (ART) offre un'ampia gamma di possibilità per affrontare queste sfide, con l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI) comunemente utilizzata come intervento terapeutico.

Da quando Palermo ha riportato la prima gravidanza riuscita ottenuta attraverso l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI) nel 1992, l'ICSI è diventata una tecnica cardine nelle tecnologie di riproduzione assistita (ART)1. Tuttavia, considerando che l'ICSI è stata utilizzata in ambito clinico per soli 30 anni, un periodo relativamente breve rispetto alla durata della vita umana, gli effetti a lungo termine dell'ICSI, in particolare sullo sviluppo della prole, non sono stati ampiamente studiati e chiariti. Attualmente, i topi, caratterizzati da un background genetico uniforme e da una durata di vita più breve, sono emersi come un modello alternativo ampiamente utilizzato nella ricerca medica. Inoltre, il modello murino può ricapitolare l'intera durata della vita umana all'interno di un lasso di tempo compresso, dove un anno nei topi corrisponde all'incirca a 40 anni negli esseri umani2.

Nell'ultimo decennio, diversi studi su piccola scala hanno riportato che gli individui concepiti attraverso l'ICSI possono essere a maggior rischio di sviluppare sindromi metaboliche, come livelli anormali di zucchero nel sangue, più avanti nella vita 3,4. Sebbene le prove non siano definitive, questa scoperta ha comunque sollevato serie preoccupazioni all'interno della comunità scientifica riguardo alle implicazioni a lungo termine dell'ICSI sulla salute. Questa situazione sottolinea l'urgente necessità di valutazioni più rigorose della ART e delle sue conseguenze a lungo termine sulla salute. In particolare alla luce dei limiti e delle considerazioni etiche degli studi sull'uomo, lo sviluppo di modelli animali in grado di ricapitolare con precisione lo sviluppo della prole umana dopo l'ICSI è diventato sempre più cruciale. In questo contesto, il modello murino ICSI-ET (Intracytoplasmic Sperm Injection-Embryo Transfer), grazie alla sua capacità di imitare l'ICSI umana e facilitare il monitoraggio a lungo termine degli esiti di salute della prole, è diventato uno strumento efficace per valutare i potenziali rischi per la salute della tecnologia ICSI per la prole5.

Questo studio mira a indagare l'impatto della tecnologia ICSI-ET su un fenotipo metabolico prevalente, vale a dire la salute metabolica del glucosio della prole, impiegando il monitoraggio casuale della glicemia, il test della glicemia a digiuno e i test di tolleranza al glucosio per valutare lo stato metabolico del glucosio dei topi. Il monitoraggio casuale della glicemia viene utilizzato per catturare le fluttuazioni naturali del metabolismo del glucosio durante le normali attività fisiologiche, mentre i test di glicemia a digiuno e di tolleranza al glucosio vengono impiegati per valutare potenziali stati prediabetici.

Protocollo

Il protocollo dell'ICSI-ET descritto di seguito segue le linee guida ed è stato approvato dall'Animal Ethical Review dello Shanghai Institute of Planned Parenthood research. Procedure di sicurezza: Indossare sempre dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati quando si maneggiano prodotti chimici o materiali biologici. Uso delle cappe: Eseguire tutte le procedure che coinvolgono sostanze chimiche volatili o la generazione di aerosol all'interno di una cappa aspirante certificata o di una cappa di biosicurezza. Utilizzare topi femmina (ceppo B6D2F1 di 6-8 settimane) per la procedura di superovulazione.

1. ICSI nei topi

  1. Superovulazione dei topi
    1. Somministrare un'iniezione intraperitoneale di gonadotropina sierica di cavalla gravida (PMSG) alla dose di 7,5 UI per topo intorno alle 20:00 del primo giorno.
    2. Somministrare un'iniezione intraperitoneale di gonadotropina corionica umana (HCG) alla dose di 7,5 UI per topo intorno alle 20:00 (48 ore dopo l'iniezione di PMSG) del terzo giorno.
  2. Preparare il terreno HTF in aliquote da 1 mL e lasciarle scoperte per l'equilibratura notturna a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 lo stesso giorno dell'iniezione di HCG in topi femmina.
  3. Preparazione delle goccioline di fertilizzazione ICSI
    1. Lo stesso giorno dell'iniezione di HCG nei topi femmina, dividere il coperchio di una piastra per colture cellulari di 50 x 9 mm nelle metà superiore e inferiore. Utilizzare la metà superiore per creare 4-6 goccioline da 5 μL ciascuna, utilizzando il 10% di polivinilpirrolidone (PVP) per il posizionamento degli spermatozoi. Utilizzare la metà inferiore per creare 8-10 goccioline da 5 μl ciascuna, utilizzando il terreno M2 per la procedura ICSI.
    2. Coprire le goccioline di PVP e M2 con circa 3 mL di olio minerale (Figura 1).
  4. Preparazione di piatti di cultura
    1. Lo stesso giorno dell'iniezione di HCG in topi femmina, erogare 12 gocce di terreno KSOM (MR-020P-D) da 20 μL in modo uniforme in una piastra di coltura cellulare di 35 x 10 mm. Coprire le gocce con circa 3 ml di olio minerale.
  5. Raccolta dello sperma:
    1. Eutanasia di topi maschi mediante lussazione cervicale alle 9:00 circa del quarto giorno (13 ore dopo l'iniezione di HCG).
    2. Isolare la cauda epididimale e pulirla accuratamente per eliminare il tessuto adiposo e i residui di sangue tamponando delicatamente con una garza sterile e risciacquando in un terreno HTF preriscaldato.
    3. Tagliare la cauda epididimo per consentire agli spermatozoi di nuotare liberamente nel terreno HTF. Schiacciare delicatamente la cauda con una pinza per rilasciare gli spermatozoi, raccoglierli in tubi HTF prebilanciati e tenerli scoperti in un'incubatrice a 37 °C, 5% CO2 per la capacitazione degli spermatozoi per un ulteriore utilizzo.
  6. Prelievo di ovociti
    1. Eutanasia di topi femmina stimolati per il recupero degli ovociti mediante lussazione cervicale intorno alle 9:30 del quarto giorno. Praticare con cura un'incisione lungo la linea mediana della pelle addominale e dello strato muscolare per esporre la cavità addominale.
    2. Utilizzare una pinza fine per isolare delicatamente il tessuto da entrambi i lati degli ovidotti, in particolare le regioni dell'ampolla gonfia, e trasferirlo in un terreno M2 in un piatto di coltura sterilizzato. Ripetere questa procedura fino a quando non vengono raccolti gli ovidotti di tutti i topi designati.
    3. Al microscopio da dissezione, utilizzare un ago da siringa da 1 ml per perforare delicatamente la sezione trasparente dell'ampolla gonfia dell'ovidotto, facilitando il rilascio di complessi cumulo-ovociti (COC) nel terreno.
    4. Utilizzando la stessa siringa, prelevare e trasferire con cura i COC in una nuova piastra contenente 100 μl di terreno M2 fresco. Ripetere questo passaggio fino a quando tutti i COC non sono stati trasferiti correttamente dai segmenti originali dell'ovidotto.
    5. Asciugare il sangue e i fluidi tissutali e, al microscopio da dissezione, aprire l'ampolla dell'ovidotto utilizzando un ago da 25 G, con conseguente rilascio di numerosi COC.
    6. Rimuovere l'ovidotto e i frammenti di tessuto, trasferire i COC in goccioline di terreno M2 contenenti ialuronidasi (HY) e preriscaldarli a 37 °C.
    7. Dopo un'incubazione di circa 5 minuti, eseguire un pipettaggio delicato per facilitare la separazione delle cellule del cumulo e degli ovociti. Trasferire gli ovociti della metafase II (MII) dalla soluzione contenente HY al terreno M2 fresco; quindi, eseguire il trasferimento sequenziale in più goccioline di mezzo M2.
    8. Dopo 2-3 cicli di lavaggio, trasferire gli ovociti in goccioline di terreno di coltura KSOM e conservarli in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 per un ulteriore utilizzo.
  7. Intorno alle 10:00 del quarto giorno, sonicare 100 μL di spermatozoi capacitati (vedi passaggio 1.5.2.) per 5 s per separare le teste dalle code a una frequenza di 46 kHz, con un'impostazione di potenza di 50 watt.
    NOTA: Quando si sonica lo sperma per troncare la coda, fare attenzione a controllare il tempo, che non deve superare i 5 s. Pochi secondi dopo la sonicazione, gli spermatozoi possono essere osservati al microscopio invertito; Interrompere la sonicazione quando circa la metà degli spermatozoi mostra code tronche.
  8. Procedura ICSI
    1. Per l'iniezione utilizzare un ago per micromanipolazione disponibile in commercio con una punta piatta e un diametro interno di 6 μm, impostato a un angolo di 25°. Riempire l'ago con il fluido operativo con la parte riempita che misura una lunghezza di 0,5 cm all'interno dell'ago. Assicurarsi che il livello del fluido raggiunga ~0,5 cm.
      NOTA: Mantenere la temperatura ambiente a 19 °C durante l'iniezione per evitare temperature elevate che potrebbero ridurre il tasso di sopravvivenza degli ovociti fecondati. La precisione nell'assicurare che il livello del fluido raggiunga 0,5 cm è fondamentale per mantenere l'integrità del processo di iniezione e garantire la vitalità degli ovociti.
    2. Installare l'ago per iniezione sul braccio destro del micromanipolatore, fissato saldamente serrando il cappuccio di fissaggio. Installare una pipetta di tenuta per micromanipolazione a punta piatta disponibile in commercio progettata per ovociti di topo sul braccio sinistro del micromanipolatore e posizionare l'ago per iniezione e la pipetta di tenuta nel campo visivo del microscopio.
    3. Aggiungere 1 μL di spermatozoi sonicati a una gocciolina di soluzione PVP utilizzando una pipetta.
    4. Metti 20 ovociti MII in una gocciolina di terreno M2.
    5. Utilizzare l'ago per iniezione per aspirare 10-20 teste di spermatozoi in soluzione PVP. Quindi, spostare l'ago per iniezione nella gocciolina contenente gli ovociti.
    6. Determinare direttamente la posizione del fuso di metafase all'interno dell'ovocita con un microscopio a polarizzazione per assicurarsi che l'apparato del fuso non si trovi sul lato dell'iniezione, con il corpo polare tipicamente situato a ore 12 o 6 rispetto all'orientamento dell'ovocita.
    7. Tenere l'ovocita a contatto con il fondo della piastra di coltura. Regolare il piano focale in modo che la zona pellucida dell'ovocita e l'ago per iniezione siano sullo stesso piano.
    8. Al contatto dell'ago per iniezione con la zona pellucida, applicare una leggera pressione negativa sull'ago per iniezione, aspirando una parte della zona pellucida.
    9. Attivare contemporaneamente gli impulsi piezoelettrici con un'impostazione di intensità di 5 e una frequenza di 1, creando efficacemente una perforazione nella zona pellucida e consentendo il passaggio dell'ago per iniezione.
    10. Far avanzare l'ago per iniezione nello spazio perivitellino, spingendo la testa dello spermatozoo fino alla punta dell'ago. Inserire l'ago per iniezione nell'ovocita fino a raggiungere il lato opposto della zona pellucida.
    11. Utilizzare impulsi piezoelettrici impostati su un'intensità di 1 e una frequenza di 1 per creare un piccolo poro nella membrana plasmatica, assicurando che la testa dello spermatozoo venga iniettata nell'ooplasma con un ingresso minimo di PVP e una conservazione ottimale dell'integrità dell'ovocita.
    12. Ripetere il passaggio 1.8.11 fino a quando tutti i 20 ovociti sono stati iniettati, seguito da un'incubazione di 15 minuti a 19 °C.
    13. Trasferire gli ovociti sopravvissuti nel terreno KSOM e metterli nell'incubatrice. Osservare i tassi di formazione di 2 cellule, 4 cellule, morule e blastocisti.
      NOTA: I tempi per l'iniezione intracitoplasmatica di un singolo spermatozoo (ICSI) nell'ovocita devono essere controllati, con l'obiettivo di completare la procedura entro 14-18 ore dall'iniezione di HCG.

2. Trapianto uterino di blastocisti di topo

  1. Preparazione di topi maschi vasectomizzati
    NOTA: Utilizzare topi maschi ICR di età compresa tra 6 e 8 settimane per lo studio.
    1. Indurre l'anestesia mediante iniezione intraperitoneale di 2,2,2-tribromoetanolo all'1,25% alla dose di 0,2 ml/10 g di peso corporeo. L'assenza di qualsiasi risposta al dolore indica il successo dell'anestesia.
      NOTA: Sebbene il protocollo attuale non includa l'applicazione di unguento veterinario sugli occhi degli animali anestetizzati, si raccomanda come migliore pratica per prevenire la secchezza oculare e garantire la salute e il comfort degli animali durante le procedure. Durante tutto il processo chirurgico e di recupero, tutti gli strumenti chirurgici sono stati sterilizzati prima dell'uso e l'area chirurgica è stata preparata utilizzando soluzioni antisettiche per garantire un ambiente operativo pulito.
    2. Per proteggersi da potenziali stress o lesioni, ospita i topi che hanno subito un intervento chirurgico individualmente durante la fase iniziale di recupero.
    3. Somministrare buprenorfina alla dose di 0,05 mg/kg di peso corporeo per garantire un sollievo ottimale dal dolore.
      NOTA: Per garantire il benessere dei topi, monitorare attentamente i topi durante il periodo di recupero e non lasciarli incustoditi fino a quando non riacquistano sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale.
    4. Preparare il sito chirurgico nella regione addominale inferiore, superiore ai testicoli. Rimuovere il pelo e disinfettare con iodio povidone. Con le forbici sterili praticare un'incisione longitudinale di 1 cm lungo la linea alba. Rimuovere delicatamente il sangue con carta sterile e priva di polvere e procedere a sezionare senza mezzi termini i muscoli addominali lungo la linea alba e accedere alla cavità addominale.
    5. Usando una pinza curva, afferra ed esponi delicatamente il testicolo sinistro e il cuscinetto adiposo associato. Identificare il dotto deferente e isolarlo con una pinza appuntita, creando un segmento di 10 mm per la manipolazione.
    6. Sterilizzare le pinze curve tenendole nella fiamma esterna di una lampada ad alcool per alcuni secondi. Afferrare delicatamente il dotto deferente, facendolo appiattire e sbiancare a causa della cauterizzazione. Creare un secondo punto di cauterizzazione a 3-5 mm distale rispetto al primo. Utilizzando forbici chirurgiche sterili, asportare il segmento del dotto deferente tra i due punti di cauterizzazione.
    7. Ispezionare attentamente le estremità cauterizzate del dotto deferente, assicurandosi che rimanga un segmento corto, appiattito e sbiancato. Usando una pinza curva, riporta delicatamente il testicolo e il cuscinetto adiposo associato nella cavità addominale.
    8. Ripetere la procedura descritta al punto 2.1.6 sul lato controlaterale (destro).
    9. Chiudere il sito chirurgico utilizzando punti di sutura, in genere posizionando un punto nello strato muscolare e tre punti nella pelle. Garantire il corretto allineamento dell'incisione chirurgica e disinfettare con iodio povidone. Trasferire l'animale su un termoforo per l'osservazione, monitorando per 10-15 minuti fino a quando l'animale non riprende conoscenza. Una volta recuperato, rimetti l'animale nella sua gabbia di alloggiamento.
      NOTA: Dopo l'intervento di vasectomia, i topi richiedono un periodo di recupero di 14 giorni, seguito da un esperimento di accoppiamento di prova di 1 settimana.
    10. Durante questa settimana, accoppiare continuamente i maschi vasectomizzati con le femmine e osservare lo stato di gravidanza di tutte le femmine che presentano tappi copulatori. Il successo dell'accoppiamento è indicato dalla presenza di un tappo vaginale bianco-giallastro e a blocchi all'orifizio vaginale della femmina di topo.
      1. Accoppia i topi tra le 16:00 e le 18:00 del primo giorno e controlla i tappi vaginali tra le 7:00 e le 9:00 del secondo giorno. Considera le femmine con tappi vaginali in uno stato di pseudo-gravidanza a 0,5 giorni e usali per successivi esperimenti di trasferimento di embrioni. Restituisci le femmine senza tappi vaginali al gruppo ricevente.
        NOTA: Queste femmine senza tappi vaginali possono continuare ad essere utilizzate per l'accoppiamento per preparare femmine pseudogravide. Assicurarsi che tutte le femmine tappate non rimangano incinte; Solo allora i maschi vasectomizzati possono essere utilizzati per esperimenti formali.
      2. Mentre i maschi vasectomizzati possono accoppiarsi quotidianamente, concedi 1 giorno di riposo tra le sessioni di accoppiamento.
        NOTA: Sulla base della nostra esperienza, i maschi vasectomizzati possono mantenere un alto tasso di plug copulatori per oltre un anno. Tuttavia, i maschi vasectomizzati che non riescono a produrre tappi copulatori nelle femmine in accoppiamento per 4-6 tentativi consecutivi dovrebbero essere rimossi dallo studio.
  2. Preparazione di femmine pseudogravide
    1. Genera topi femmina pseudogravidi accoppiando topi femmina ICR (di età compresa tra 7 e 10 settimane, di peso superiore a 25 g) con topi maschi vasectomizzati (di 3-6 mesi) in un rapporto 1:1.
      NOTA: I maschi vasectomizzati sono stati utilizzati per stimolare la cervice uterina delle femmine di topo, con conseguente attivazione dei corpi lutei.
  3. Preparazione della pipetta per il trasferimento delle blastocisti
    1. Estrarre gli embrioni da trapiantare dall'incubatrice e trasferirli in una gocciolina di terreno M2 a una temperatura di 37 °C.
    2. Utilizzare una pipetta di trasferimento per aspirare un piccolo volume di liquido, aspirare una piccola quantità di aria e aspirare 6-10 embrioni. Infine, aspirare un altro piccolo volume d'aria per sigillare la pipetta.
      NOTA: La lunghezza del fluido nella pipetta di trasferimento non deve superare 0,5 cm.
  4. Trapianto uterino (blastocisti)
    1. Pesare le tope femmine pseudogravide (2,5 giorni dopo l'accoppiamento) e anestetizzarle mediante iniezione intraperitoneale di 2,2,2,2-tribromoetanolo all'1,25% alla dose di 0,2 ml/10 g di peso corporeo. Premere delicatamente l'orecchio con una pinza.
    2. Dopo aver somministrato l'anestesia ai topi e aver assicurato l'asepsi attraverso la disinfezione con alcol, praticare un'incisione longitudinale sulla linea mediana sull'addome ventrale. Sfruttando il tessuto sottocutaneo lasso, spostare l'incisione sul lato sinistro o destro come richiesto per il trapianto. Utilizzare piccole forbici per eseguire la dissezione smussata dello strato muscolare della parete addominale a ~0,5 cm lateralmente alla colonna lombare per accedere alla cavità peritoneale.
    3. Usando una pinza atraumatica, esteriorizza attentamente le ovaie, gli ovidotti e l'utero.
    4. Usando la punta di un ago da siringa, praticare una piccola incisione angolata verso l'alto sulla parete uterina sotto la giunzione utero-tubarica, evitando i vasi sanguigni. Questa incisione fornisce l'accesso alla cavità uterina; Inserire delicatamente l'ovidotto 2-3 mm attraverso il piccolo foro.
    5. Espellere con cautela la piccola bolla d'aria all'estremità della pipetta di trasferimento osservando attentamente la pipetta di trasferimento durante l'iniezione lenta degli embrioni. Una volta confermata l'espulsione della parte centrale del terreno di coltura, interrompere la procedura e rimuovere delicatamente la pipetta di trasferimento.
    6. Riposizionare le ovaie, gli ovidotti e l'utero nella cavità addominale. Sutura separatamente lo strato muscolare e la pelle. Posiziona i topi su un termoforo fino a quando non si riprendono dall'anestesia. Per garantire il benessere dei topi, monitorare attentamente i topi durante il periodo di recupero e non lasciarli incustoditi fino a quando non riacquistano una coscienza sufficiente per mantenere la decubito sternale.
  5. Osservazione della gravidanza
    1. Dopo l'intervento chirurgico, osservare i topi per 18-21 giorni per monitorare il numero di figli nati. In caso di distocia (parto difficile), eseguire un taglio cesareo. Consentire ai topi appena nati di essere allevati da madri in allattamento della stessa fascia di età.

3. Test casuale di glicemia nel sangue, glicemia a digiuno e tolleranza al glucosio

  1. Monitoraggio dei livelli casuali di glucosio nel sangue durante la crescita del topo
    1. Dalla nascita dei topi, monitora il livello casuale di glucosio nel sangue ogni 4 settimane alle 9 del mattino dopo una buona notte di alimentazione e divertimento.
      1. Perforare la punta della coda del topo per ottenere il sangue della vena caudale.
      2. La prima goccia di sangue ha un valore di misurazione dello zucchero più elevato a causa della presenza del fluido tissutale mescolato ad essa. Pertanto, pulire delicatamente la prima goccia di sangue con carta assorbente pulita.
      3. Misurare la glicemia dalla seconda goccia (~4 μL) dalla vena caudale con un glucometro portatile.
  2. Monitoraggio dei cambiamenti nella glicemia a digiuno e nella tolleranza al glucosio durante lo sviluppo dei topi
    NOTA: Considerando che il primo punto temporale del prelievo di sangue è di 15 minuti, tutti i topi devono essere iniettati entro 15 minuti. Poiché ogni iniezione di topo ha richiesto 20-30 secondi, per garantire che le iniezioni siano completate entro questo lasso di tempo, il numero massimo di topi che possono essere utilizzati in ogni test non può superare i 30.
    1. Eseguire i test di glicemia a digiuno e di tolleranza al glucosio ogni 4 settimane dopo la nascita nei topi a digiuno notturno.
      1. Il primo giorno, prepara la lettiera per trucioli freschi irradiati, gabbie pulite, coperchi e bottiglie d'acqua. Trasferisci i topi in una gabbia fresca senza cibo. Aggiungere etichette di non alimentazione alle gabbie.
      2. Preparare una quantità sufficiente di iniezione di glucosio al 10% (sterile e apirogena) e siringhe da 1 mL.
      3. Assicurati che i topi di ogni gruppo digiunino per 16 ore, dalle 17:00 del giorno 1 alle 9:00 del giorno 2, ma lascia libero accesso all'acqua. Misurare i livelli di glucosio nel sangue a digiuno come descritto nei passaggi 3.1.1.1-3.1.1.3 utilizzando un glucometro.
    2. Pesa i topi e segna le loro code per facilitare una rapida identificazione. Preparare siringhe di glucosio con 10 μL/g di peso del topo.
    3. A intervalli di 30 s, iniettare 10 μL/g di glucosio nella cavità intraperitoneale del topo.
      NOTA: Particolare attenzione deve essere prestata alle tecniche di iniezione per evitare un volume di iniezione del liquido impreciso. I punti chiave dell'operazione sono i seguenti:
      1. Immobilizza il mouse e trattieni la coda con una mano. Tenere la testa leggermente più in basso dei glutei in modo che gli organi della cavità addominale si spostino verso la testa, lasciando sufficiente spazio per l'iniezione.
      2. Posizionare l'ago tra la linea mediana e l'osso dell'anca, inserirlo attraverso la pelle con un angolo di 45 gradi, quindi guidare delicatamente l'ago più in profondità nella cavità addominale mantenendolo allineato parallelamente alla superficie della pelle per ~0,5 cm.
        NOTA: Prestare attenzione a qualsiasi resistenza durante l'iniezione per determinare se gli organi interni sono stati perforati accidentalmente.
      3. Espellere la siringa nella cavità addominale.
      4. Registrare l'ora in cui è iniziata l'iniezione e utilizzare un timer per controllare la velocità di iniezione. Impostare il timer su 90 s per tre mouse per evitare di perdere tempo nella gestione del timer.
    4. Effettuare la misurazione della glicemia dalla vena caudale agli intervalli desiderati (0 prima della somministrazione del glucosio, 15, 30, 60, 90 e 120 minuti dopo il carico di glucosio).
      NOTA: Anche il successivo test della glicemia dovrebbe richiedere 20-30 secondi per ogni topo.
    5. Riporta i topi nelle loro gabbie domestiche dotati di cibo e acqua dopo l'esperimento.

Risultati

Nel nostro laboratorio, abbiamo raggiunto un tasso di fecondazione dell'89,57% e un tasso di 2 cellule dell'87,38% utilizzando l'ICSI con spermatozoi caudali dell'epididimo nei topi. Il tasso di natalità della prole dopo ET è di circa il 42,50%. Sorprendentemente, tutti i tassi di fecondazione, i tassi di 2 cellule e i tassi di natalità della prole sono paragonabili ai livelli raggiunti nella ART umana, consentendo una simulazione completa delle diverse fasi delle tecniche di ART umane nei topi. Ulteriori dettagli sono forniti nella Tabella 1 e nella Tabella 2. Non c'è stata alcuna fluttuazione significativa nei livelli casuali di glucosio nel sangue tra i topi nati naturalmente e i topi ICSI durante il processo di crescita e sviluppo (Figura 2). Tuttavia, i topi maschi ICSI hanno mostrato livelli costantemente elevati di glucosio nel sangue a digiuno durante l'esperimento (Figura 3), indicando una compromissione dell'omeostasi della glicemia a digiuno. È interessante notare che le femmine di topi ICSI non hanno mostrato cambiamenti rispetto al gruppo di controllo. Nella GTT, il livello di glucosio nel sangue ha mostrato un cambiamento significativo tra i topi maschi ICSI e il gruppo di controllo (Figura 4) e non c'era tale differenza nei topi femmine. Questi risultati hanno suggerito che la prole ottenuta utilizzando la tecnologia ICSI potrebbe soffrire di diabete e l'esito era correlato al sesso. Sebbene i topi femmina non mostrassero il fenotipo del diabete, il fenotipo in sovrappeso dei topi ICSI maschi e femmine era coerente (Figura 5).

Utilizzando il protocollo di iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI) qui descritto, abbiamo ottenuto alti tassi di fecondazione e sviluppo embrionale nei topi. In un esperimento rappresentativo, l'89,57% degli ovociti è stato fecondato dopo ICSI, come evidenziato dalla formazione di due pronuclei. A 24 ore dall'ICSI, l'87,38% degli zigoti si è sviluppato fino allo stadio embrionale a 2 cellule. Dopo il trasferimento dell'embrione alle femmine riceventi, il tasso di natalità dei cuccioli vivi è stato del 42,50% (risultati positivi). Utilizzando il protocollo di iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI) ottimizzato qui descritto, abbiamo generato in modo efficiente prole da ovociti e spermatozoi di topo. È importante sottolineare che un'accurata caratterizzazione degli animali derivati dall'ICSI ha rivelato perturbazioni metaboliche in assenza di difetti di sviluppo macroscopici.

Rispetto ai controlli allevati naturalmente, i topi ICSI maschi ma non femmine hanno mostrato un'omeostasi glicemica compromessa, evidenziata da un'elevata glicemia a digiuno (Figura 3) e da una ridotta tolleranza al glucosio nei test di tolleranza al glucosio intraperitoneale (Figura 4). Queste alterazioni possono derivare da carenze di riprogrammazione durante la fecondazione mediata da ICSI o da sottili anomalie genetiche/epigenetiche subite durante la manipolazione degli spermatozoi.

Inoltre, sia i topi maschi che le femmine ICSI hanno mostrato un aumento del peso corporeo rispetto ai controlli (Figura 5), suggerendo una propensione all'obesità. Mentre la tecnica ICSI del topo modella in modo affidabile gli esiti dell'ICSI umana, i fenotipi metabolici osservati sottolineano la necessità di interpretare con cautela i risultati dei modelli animali ICSI. Una valutazione completa della crescita, della salute e del comportamento è fondamentale per determinare l'idoneità dei topi ICSI per le applicazioni a valle.

Nel loro insieme, questi dati illustrano l'utilità del protocollo ICSI del topo per generare in modo efficiente la prole per gli studi, evidenziando anche l'importanza di valutare accuratamente i risultati fenotipici negli animali derivati dall'ICSI. Le anomalie metaboliche sesso-specifiche osservate in questo esempio sottolineano la necessità di un'attenta interpretazione dei risultati dei modelli murini ICSI.

figure-results-1
Figura 1: Diagramma della preparazione del piatto per l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi nei topi. Il coperchio della piastra per colture cellulari è stato diviso in metà superiore e inferiore. La metà superiore conteneva goccioline di soluzione di polivinilpirrolidone al 10% per il posizionamento degli spermatozoi. La metà inferiore conteneva goccioline di terreno M2 per l'esecuzione della procedura ICSI. Tutte le goccioline sono state ricoperte di olio minerale per evitare l'evaporazione. Questa configurazione della piastra ha consentito il trasferimento sequenziale di spermatozoi e ovociti tra goccioline PVP e M2 per consentire il processo ICSI. Le aree separate impedivano la miscelazione dei terreni durante la procedura. Abbreviazioni: ICSI = iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi; PVP = polivinilpirrolidone. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Livelli casuali settimanali di glucosio nel sangue in topi di controllo allevati naturalmente (n = 5) e ICSI (n = 5) durante lo sviluppo postnatale. I livelli di glucosio nel sangue sono stati misurati settimanalmente dopo il digiuno notturno dalla vena caudale dei topi di controllo e ICSI utilizzando un glucometro. I dati sono presentati come media ± SEM. La significatività statistica è stata valutata utilizzando un ANOVA a due vie, ns, P > 0,05. Abbreviazioni: SEM = Errore standard della media; ICSI = iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi; ns = non significativo; NM = accoppiamento naturale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Livelli settimanali di glucosio nel sangue a digiuno nei topi di controllo allevati naturalmente (n = 7 per i maschi, n = 7 per le femmine) e nei topi trattati con ICSI (n = 7 per i maschi, n = 7 per le femmine) durante lo sviluppo postnatale. Dopo il digiuno notturno, i livelli di glucosio nel sangue sono stati misurati settimanalmente dalla vena caudale di topi di controllo a digiuno e trattati con ICSI utilizzando un glucometro. È stato osservato che i topi maschi trattati con ICSI, ma non le femmine, mostravano livelli di glucosio nel sangue a digiuno significativamente elevati rispetto ai loro controlli di pari sesso a partire dalle 8 settimane di età. ±La significatività statistica è stata valutata utilizzando un ANOVA a due vie, ns, P > 0,05, ***P < 0,001,****P < 0,0001). Abbreviazioni: SEM = Errore standard della media; ICSI = iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi; ns = non significativo; NM = accoppiamento naturale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Test di tolleranza al glucosio intraperitoneale in topi maschi di controllo allevati naturalmente (n = 5) e trattati con ICSI (n = 5) a 16 settimane di età. Dopo un digiuno notturno, i topi hanno ricevuto un'iniezione intraperitoneale di glucosio (2 g/kg di peso corporeo). I livelli di glucosio nel sangue sono stati quindi misurati a 0, 30, 60 e 120 minuti dopo l'iniezione. I topi maschi trattati con ICSI hanno mostrato livelli di glucosio nel sangue significativamente più elevati a 30, 60 e 120 minuti durante l'IPGTT rispetto al controllo allevato naturalmente. I dati sono presentati come media ± SEM. Le analisi sono state eseguite utilizzando ANOVA a due vie. ns, P > 0,05. *P < 0,05. Abbreviazioni: IPGTT = Test intraperitoneale di tolleranza al glucosio; SEM = Errore standard della media; ICSI = iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi; ns = non significativo; NM = accoppiamento naturale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-5
Figura 5: Monitoraggio del peso corporeo di topi di controllo allevati naturalmente (n = 5 maschi, n = 5 femmine) e di topi trattati con ICSI (n = 5 maschi, n = 5 femmine) da 4 a 20 settimane di età. Le misurazioni settimanali hanno rivelato che sia i topi maschi che le femmine trattati con ICSI hanno mostrato un peso corporeo significativamente maggiore rispetto ai loro controlli di pari genere, a partire dalle 8 settimane di età. I dati sono presentati come media ± SEM. Le analisi sono state eseguite utilizzando ANOVA a due vie. P < 0,001. P < 0,0001. Abbreviazioni: SEM = Errore standard della media; ICSI = iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi; ns = non significativo; NM = accoppiamento naturale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

OvocitiZigotiTasso di fertilizzazione (%)a 2 celleVelocità a 2 celle (%)4-8 celleVelocità di cella 4-8 (%)MorulaTasso di MorulaBlastocistiTasso di blastocisti
Spermatozoo della cauda ICSI1908493.337690.487285.716982.146476.19
Spermatozoo della cauda ICSI28072906286.115981.945373.614663.89
Spermatozoo di cauda ICSI3605083.334284377432642856
Totale23020689.5718087.3816881.5515474.7613866.99

Tabella 1: Risultati dello sviluppo dopo ICSI del topo. Abbreviazione: ICSI = iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi.

No.No. di embrioni trasferitiNo. di nascita (%)MaschioFemminaTasso di natalità (%)
16330
26110
35202
48422
58211
67532
Totale401710742.5

Tabella 2: Esiti alla nascita dopo trapianto uterino di embrioni di topo ICSI. Abbreviazione: ICSI = iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi.

Discussione

Questo studio ha integrato tecniche di iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi di topo (ICSI) e trasferimento di embrioni (ET) per ricapitolare in modo completo la tecnologia di riproduzione assistita umana (ART) ed esaminare l'impatto dell'ICSI in combinazione con l'ET sullo sviluppo della prole. L'applicazione della tecnica ICSI con spermatozoi di topo normali ha prodotto un'elevata fecondazione (86,76%) e tassi di 2 cellule (88,48%). Dopo l'ET, il tasso di natalità dei topi prole è stato di circa il 42,50%, indicando la robustezza della piattaforma tecnica. Il risultato più degno di nota di questo studio è stata la fluttuazione correlata all'età dei livelli di metabolismo del glucosio nella prole ICSI, che può essere attribuita all'applicazione della tecnica ICSI6.

Le fluttuazioni osservate nei livelli di metabolismo del glucosio costituiscono una scoperta notevole in questo studio. Questa scoperta implica potenziali implicazioni a lungo termine della tecnica ICSI sulla salute della prole, in particolare per quanto riguarda il metabolismo del glucosio7. Per chiarire le ragioni alla base di questo fenomeno, abbiamo condotto un esame completo delle fasi tecniche fondamentali comprese nella procedura ICSI. Abbiamo scoperto che il controllo della temperatura della microiniezione (19 °C), della durata del taglio ad ultrasuoni (entro 5 s) e del volume del fluido di trasferimento (<0,5 cm) erano importanti per mantenere elevati tassi di vitalità e di impianto dell'embrione. Il controllo dell'effetto di sifonamento della pipetta di trasferimento è emerso come un passaggio fondamentale per un trasferimento preciso degli embrioni. Quando si prepara la pipetta di trasferimento, garantire l'uniformità del diametro del tubo è fondamentale per mitigare l'effetto di sifonamento e controllare meglio il movimento del liquido all'interno del tubo. Questa misura è fondamentale per migliorare il tasso di successo e l'accuratezza del trasferimento degli embrioni. Inoltre, evitare la coltura in vitro prolungata e il sovraffollamento durante il trasferimento degli embrioni ha contribuito a migliorare la competenza nello sviluppo. Utilizzando protocolli ottimizzati, abbiamo raggiunto un tasso di fecondazione dell'86,76% e un tasso di natalità del 42,50% dopo ET, suggerendo che la procedura ICSI in sé non comprometteva intrinsecamente la vitalità. Pertanto, le fluttuazioni nel metabolismo del glucosio erano più plausibilmente associate a sottili cambiamenti intracellulari indotti dal processo ART piuttosto che a danni embrionali evidenti.

Sebbene la riproduzione assistita sia ampiamente considerata sicura, prove crescenti indicano che anche una prole ART apparentemente normale può presentare vari rischi per la salute più avanti nella vita a causa delle caratteristiche riproduttive innaturali e dei periodi critici di intervento durante lo sviluppo dei gameti e degli embrioni.. I nostri risultati forniscono nuove informazioni sui potenziali effetti metabolici dell'ART ed evidenziano la necessità di ulteriori studi sugli impatti a lungo termine dell'ART sulla salute della prole14.

È essenziale riconoscere che questo studio ha impiegato un modello murino; Di conseguenza, i risultati potrebbero non essere direttamente trasferibili a soggetti umani. Tuttavia, dati i sostanziali parallelismi biologici tra topi e esseri umani, questi risultati conservano un notevole significato referenziale15. Inoltre, è importante riconoscere che i pazienti sottoposti a ICSI nella pratica clinica presentano spesso anomalie spermatiche. Al contrario, questo studio ha utilizzato topi normali per le procedure ICSI, mancando quindi di dati sulla prole ICSI da topi con anomalie spermatiche. Tuttavia, è ragionevole prevedere che le anomalie degli spermatozoi avrebbero un impatto più profondo sugli effetti a lungo termine della tecnica ICSI. Pertanto, i risultati di questo studio mantengono un notevole merito referenziale.

Un altro limite del nostro studio è la discrepanza metodologica tra il nostro modello murino e le pratiche cliniche umane nell'immobilizzazione degli spermatozoi. Nell'applicazione clinica dell'ICSI, è pratica comune immobilizzare lo sperma umano interrompendo fisicamente la coda con una micropipetta. Tuttavia, nei nostri esperimenti su modello murino, abbiamo impiegato il taglio ultrasonico della coda per preparare lo sperma, un metodo utilizzato di routine nella manipolazione embrionale del topo. Riconosciamo che questo approccio può inavvertitamente introdurre variabilità e potenziali distorsioni nel modello, soprattutto considerando il possibile danno all'integrità e alla funzione degli spermatozoi che gli ultrasuoni possono causare. Questa differenza metodologica può limitare la traducibilità diretta dei nostri risultati. Nel nostro lavoro futuro, abbiamo in programma di esplorare l'uso di micropipette per interrompere le code degli spermatozoi di topo. Questo aggiustamento mira a ridurre al minimo gli effetti indesiderati sugli spermatozoi e a replicare meglio le condizioni e gli esiti osservati nelle procedure ICSI umane. Ci impegniamo a migliorare continuamente le nostre pratiche di ricerca per aumentare la rilevanza clinica dei nostri risultati.

Sulla base della suddetta piattaforma tecnologica, nelle ricerche future, indagheremo ulteriormente l'impatto della tecnica ICSI su altri aspetti della salute della prole, come la salute cardiovascolare e il sistema immunitario. Inoltre, anche gli studi di follow-up a lungo termine sono indispensabili per comprendere in modo completo gli effetti a lungo termine dell'ICSI.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal piano di progetto principale del Fondo speciale per lo sviluppo della zona dimostrativa dell'innovazione indipendente nazionale di Shanghai Zhangjiang (ZJ2022-ZD-006), dal progetto di finanziamento mirato della Commissione municipale per la scienza e la tecnologia di Shanghai (22DX1900400), dal programma giovanile della Commissione sanitaria municipale di Shanghai (20204Y0276). la Fondazione Nazionale di Scienze Naturali della Cina (32070849).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1,25% di avertina (2,2,2-tribromoetanolo)Nanjing AibeiM2960per anestesia
Piastre di Petri batteriologiche 35 x 10 mm con coperchio ermetico, polistirene vergine di grado cristallo, steriliBD353001
Piastre di Petri batteriologiche 50 x 9 mm con coperchio ermetico, polistirene vergine di grado cristallino, sterileBD351006
Armadio di biosicurezzaESCOclass figure-materials-1 BSCOperazioni asettiche, preparazione di piastre di coltura, aliquotazione di reagenti, ecc.
Incubatore a CO2Thermo8000DHMicroscopio per dissezione per colture embrionali
OlympusSZX16Utilizzo nel trasferimento di embrioni nel topo
Fluorinert Fc-770SIGMAF3556Fluorinert FC-770 è un liquido completamente fluorurato termicamente stabile con elevata rigidità dielettrica e resistività, utilizzato come
glucometro portatileRocheAccuChekperforma Blood Misurazione del glucosio
HTFMerckMR-070-DIl liquido tubarico umano (HTF) (1x) EmbryoMax (1x), liquido progettato per l'uso con la fecondazione in vitro su topo, è disponibile in un formato da 50 ml ed è stato ottimizzato e convalidato per la coltura embrionale.
Microiniettore idraulicoEppendorfCellTram 4r Olio, 5196000030Per iniezione di spermatozoi
Microscopio invertitoNikonTI2-UHost di osservazione per micromanipolazione
KSOMMerckMR-020P-D(1x), Polvere, senza rosso fenolo, 5 x 10 mL
M2MerckMR-015-DEmbryoMax M2 Medium (1x), Liquido, con
micromanipolatoreNARISHIGENTX-N4per braccio di micromanipolazione
 L'olio minerale SIGMAM8410è adatto per l'uso come strato di copertura per controllare l'evaporazione e la contaminazione incrociata in varie applicazioni di biologia molecolare.
TagliaaghiNanjing AibeiSutter MF-800Utilizzare per la fabbricazione di aghi per micromanipolazione
Needle PullerNanjing AibeiSutter modello p-100Utilizzare per realizzare aghi per micromanipolazione
Piezo Drill Trip Mouce ICSIEppendorf5195000.087Applicazione dell'ago per iniezione ICSI.
Micromanipolatore piezoelettrico (rompimembrana)EppendorfEppendorf PiezoXpertUso di micro-impulsi per rompere la zona pellucida e l'oolemma dell'ovocita
Microiniettore pneumaticoEppendorfCellTram 4r Aria, 5196000013Per il fissaggio dell'ovocita
Gonadotropina corionica umana pronta all'uso (Hcg)Nanjing AibeiM2520Reagente di sterilizzazione, iniezione intraperitoneale. 50 UI/mL
Pronto all'uso Gonadotropina sierica di cavalla gravida (PMSG)Nanjing AibeiM2620Reagente di sterilizzazione, iniezione intraperitoneale. 50 UI/mL
StereomicroscopioOlympusSZX7Prelievo di ovociti e osservazione dello sviluppo embrionale
a fluido operativo rosso fenolo Olio minerale

Riferimenti

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