Articolo metodologico

Trasformazione e rigenerazione delle radici pelose in Arabidopsis thaliana e Brassica napus

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DOI:

10.3791/66223

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22 dicembre 2023

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1Hormonal Crosstalk in Plant Development, Mendel Center for Plant Genomics and Proteomics, CEITEC MU-Central European Institute of Technology, Masaryk University, 2PSI - Photon Systems Instruments

In questo articolo

Sommario

Il protocollo descrive l'induzione della radice pelosa utilizzando steli di infiorescenza primaria di Arabidopsis e ipocotili di Brassica napus . Le radici pelose possono essere coltivate e utilizzate come espianti per rigenerare piante transgeniche.

Abstract

La trasformazione delle radici pelose rappresenta uno strumento versatile per le biotecnologie vegetali in varie specie. L'infezione da parte di un ceppo di Agrobacterium che trasporta un plasmide che induce le radici (Ri) induce la formazione di radici pelose nel sito di ferita dopo il trasferimento del T-DNA dal plasmide Ri nel genoma della pianta. Il protocollo descrive in dettaglio la procedura di induzione della radice pelosa basata su iniezione in Brassica napus DH12075 e Arabidopsis thaliana Col-0. Le radici pelose possono essere utilizzate per analizzare un transgene di interesse o elaborate per la generazione di piante transgeniche. Il terreno di rigenerazione contenente citochinina 6-benzilaminopurina (5 mg/L) e acido auxina-1-naftaleneacetico (8 mg/L) provoca con successo la formazione di germogli in entrambe le specie. Il protocollo riguarda la genotipizzazione e la selezione di rigeneranti e piante T1 per ottenere piante portatrici di un transgene di interesse e prive di T-DNA dal plasmide Ri . Viene anche illustrato un processo alternativo che porta alla formazione di una pianta composita. In questo caso, le radici pelose vengono mantenute sul germoglio (invece delle radici naturali), il che consente lo studio di un transgene nelle colture radicali pelose nel contesto dell'intera pianta.

Introduzione

La trasformazione delle piante è il collo di bottiglia di qualsiasi studio genetico in biologia vegetale. Un batterio del suolo, l'Agrobacterium tumefaciens, è ampiamente utilizzato come mezzo per la somministrazione genica mediante immersione floreale o coltura tissutale per generare trasformanti. A. tumefaciens infetta le piante in un sito di ferita e provoca tumori a causa del trasferimento e dell'integrazione del T-DNA da un plasmide che induce il tumore (Ti) nel genoma della pianta ospite. I ceppi ingegnerizzati di A. tumefaciens con plasmide di Ti modificato senza il T-DNA wild-type e un vettore binario con T-DNA artificiale e siti di clonaggio per l'inserimento di un gene di interesse sono comunemente usati come un efficiente sistema di trasformazione delle piante1. Tuttavia, molte specie e colture modello sono recalcitranti all'immersione floreale o alla rigenerazione delle piante in vitro o hanno lunghi cicli di crescita, con un impatto sull'efficienza di questo sistema di trasformazione.

L'Agrobacterium rhizogenes induce la formazione di radici avventizie, o radici pelose, nel sito di ferita dopo aver infettato una pianta ospite. Simile ad A. tumefaciens, A. rhizogenes trasferisce un T-DNA da un plasmide che induce le radici (Ri) al genoma della pianta ospite, causando lo sviluppo di radici pelose transgeniche. Questo processo è controllato principalmente dai geni 2,3 dei loci oncogenici della radice (rol). Utilizzando ceppi agrobatterici che trasportano sia il plasmide Ri che un vettore binario artificiale che codifica per un gene di interesse, sono state utilizzate colture radicali pelose per produrre proteine ricombinanti, analizzare la funzione di promotori o geni o modificare i genomi utilizzando Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)4,5,6.

Il nostro protocollo utilizza il ceppo transconiugante Ti-less A. tumefaciens C58C1 che trasporta il plasmide Ri pRiA4b7. Il T-DNA del plasmide Ri è costituito da due regioni, T-DNA destro e sinistro (TR-DNA e TL-DNA, rispettivamente), che possono integrarsi indipendentemente nel genoma della pianta8. Sfruttando questo sistema, è stato ottimizzato il lungo processo di trasformazione dell'espianto nella cultivar Brassica napus DH120759. Il protocollo descritto di seguito consente la rigenerazione di linee radicali pelose selezionate e l'ottenimento di piante T1 portatrici del transgene di interesse e prive di geni rol in circa 1 anno. La trasformazione della radice pelosa basata sull'iniezione può essere utilizzata in altre specie di Brassicaceae, come dimostrato dalla trasformazione di Arabidopsis thaliana Col-0. Mentre l'ipocotile viene utilizzato per trasformare B. napus, A. thaliana viene iniettato nello stelo dell'infiorescenza primaria.

Protocollo

1. Preparazione dei terreni e delle soluzioni

  1. Preparare le soluzioni madre ormonali.
    1. Per la preparazione di 50 mL di soluzione madre di acido 1-naftaleneacetico (NAA), 6-benzilamminopurina (BAP) e acido indolo-3-butirrico (IBA) con una concentrazione di 5 mg/mL, sciogliere 250 mg dell'ormone in polvere in 2 mL di idrossido di sodio 1 M (NaOH) e regolare il volume a 50 mL con acqua ultrapura.
    2. Per preparare 50 mL di acido gibberellico (GA3) con una concentrazione di 1 mg/mL, sciogliere 50 mg dell'ormone in polvere in 2 mL di etanolo e regolare il volume a 50 mL di acqua ultrapura.
    3. Filtrare la soluzione utilizzando un filtro per siringa sterile con una dimensione dei pori di 0,22 μm e distribuirla in provette sterili da 2 mL per la conservazione. Conservare la soluzione a -20 °C o 4 °C, a seconda delle raccomandazioni del produttore.
  2. Preparare le soluzioni madre di antibiotici. Per 50 mL di soluzione madre disodica di cefotaxima e ticarcillina con una concentrazione di 100 mg/mL, sciogliere 0,5 g dell'antibiotico in polvere in 40 mL di acqua ultrapura e portare a un volume finale di 50 mL. Filtrare la soluzione utilizzando un filtro per siringa sterile con una dimensione dei pori di 0,22 μm e distribuirla in provette sterili da 2 mL per la conservazione. Conservare la soluzione a -20 °C.
    NOTA: Antibiotici e ormoni vengono sempre aggiunti al mezzo raffreddato.
  3. Preparare 1 L di terreno di Luria Broth (LB) aggiungendo 10 g di bacto-triptone, 5 g di estratto di lievito e 5 g di cloruro di sodio (NaCl) in un cilindro graduato da 1 L e regolare il volume a 1 L con acqua bidistillata. Regolare il pH a 7.0 con KOH con un pHmetro (seguendo le istruzioni del produttore). Trasferire la soluzione in un flacone da 1 L e aggiungere 15 g di agar batteriologico (1,5%), se si prepara un terreno solido e sterilizzare in autoclave il terreno. Se necessario, aggiungere gli antibiotici appropriati (la resistenza batterica è trasportata sul vettore binario) al mezzo raffreddato.
    NOTA: Utilizzare un'autoclave per sterilizzare la soluzione. Mettere il flacone nel cestello, chiudere il coperchio e sterilizzarlo per 20 minuti a 121 °C e 98,9 kPa. Questo protocollo viene sempre utilizzato per le soluzioni in autoclave nelle fasi successive.
  4. Preparare 1 L di Yeast Extract Beef (YEB) medium mescolando 5 g di estratto di manzo, 1 g di estratto di lievito, 5 g di peptone, 5 g di saccarosio e 0,5 g di cloruro di magnesio (MgCl2 ) in acqua bidistillata. Regolare il volume a 1 L. Trasferire la soluzione in un flacone da 1 L. Autoclavare il mezzo.
  5. Preparare 1 L di terreno per la germinazione dei semi mescolando 2,2 g di polvere di Murashige e Skoog (MS), 10 g di saccarosio (1%) e 0,5 g di sali di sodio dell'acido 2-(N-morfolino)etanasolfonico (MES) in acqua bidistillata. Regolare il volume a 1 L, mescolare e regolare il pH a 5,8 con KOH. Trasferire la soluzione in un flacone da 1 L e aggiungere 8 g di agar vegetale (0,8%). Autoclavare il mezzo.
  6. Preparare 1 L di terreno di coltura mescolando 2,2 g di polvere di MS, 5 g di saccarosio (0,5%) e 0,5 g di sali MES in acqua bidistillata. Regolare il volume a 1 L, mescolare e regolare il pH a 5,8 con KOH. Trasferire la soluzione in un flacone da 1 L e aggiungere 8 g di agar vegetale (0,8%). Autoclavare il mezzo.
  7. Preparare 1 L di terreno di coltura delle radici pelose mescolando 4,4 g di vitamine MS + B5 in polvere, 30 g di saccarosio (3%) e 0,5 g di sali MES in acqua bidistillata. Regolare il volume a 1 L, mescolare e regolare il pH a 5,8 con KOH e trasferire la soluzione in una bottiglia da 1 L. Aggiungere 3 g di gelificante (0,3%) e sterilizzare in autoclave il terreno. Aggiungere cefotaxima e ticarcillina disodica a una concentrazione finale di 100 - 200 mg/L e 100 - 500 mg/L, rispettivamente. Se necessario, aggiungere gli antibiotici appropriati (la resistenza è dovuta al T-DNA di un vettore binario).
  8. Preparare 1 L di terreno di coltura composito mescolando 2,2 g di vitamine MS + B5 in polvere, 10 g di saccarosio (1%) e 0,5 g di sali MES in acqua bidistillata. Regolare il volume a 1 L, mescolare e regolare il pH a 5,8 con KOH e trasferire la soluzione in un flacone da 1 L. Aggiungere 6 g di gelificante (0,6%) e sterilizzare in autoclave il terreno. Aggiungere cefotaxima e ticarcillina disodica a una concentrazione finale di 200 mg/L e 500 mg/L, rispettivamente. Se necessario, aggiungere gli antibiotici appropriati (la resistenza è dovuta al T-DNA di un vettore binario).
  9. Preparare 1 L di terreno di rigenerazione mescolando 4,4 g di vitamine MS + B5 in polvere, 30 g di saccarosio (3%) e 0,5 g di sali MES in acqua bidistillata. Regolare il volume a 1 L, mescolare e regolare il pH a 5,8 con KOH. Trasferire la soluzione in un flacone da 1 L e aggiungere 3 g di gelificante (0,3%). Autoclavare il mezzo. Aggiungere NAA e BAP a una concentrazione finale di 8 mg/L e 5 mg/L, rispettivamente, e ticarcillina disodica a una concentrazione finale di 100 mg/L.
  10. Preparare 1 L di terreno di allungamento dei germogli mescolando 4,4 g di vitamine MS + B5 in polvere, 20 g di saccarosio (2%) e 0,5 g di sali MES in acqua bidistillata. Regolare il volume a 1 L, mescolare e regolare il pH a 5,8 con KOH. Trasferire la soluzione in un flacone da 1 L e aggiungere 3 g di agar vegetale (0,3%). Autoclavare il mezzo. Aggiungere BAP e GA3 a una concentrazione finale di 0,5 mg/L e 0,03 mg/L, rispettivamente, e cefotaxima a una concentrazione finale di 100 mg/L.
  11. Preparare 1 litro di terreno di induzione radicolare mescolando 2,2 g di vitamine MS + B5 in polvere, 10 g di saccarosio (1%) e 0,5 g di sali MES in acqua bidistillata. Regolare il volume a 1 L, mescolare e regolare il pH a 5,8 con KOH. Trasferire la soluzione in un flacone da 1 L e aggiungere 3 g di gelificante (0,3%). Autoclavare il mezzo. Aggiungere IBA e cefotaxima a una concentrazione finale di 0,5 mg/L e 100 mg/L, rispettivamente.
  12. Preparare 1 L di tampone al bromuro di cetiltrimetilammonio (CTAB) aggiungendo 20 g di CTAB (2% p/v finale), 100 mL di 1M Tris-HCl, pH 8,0 (100 mM finale), 40 mL di EDTA 0,5 M, pH 8,0 (20 mM finale), 81,8 g di NaCl (1,4% p/v finale) e 5 g di PVP40 (0,5% p/v finale). Regolare a 1 L con acqua bidistillata. Autoclavare la soluzione. Conservare la soluzione per un massimo di 1 anno a temperatura ambiente.

2. Trasformazione di Agrobacterium con un vettore binario

  1. Preparare il DNA di un plasmide binario verificato contenente la cassetta T-DNA da integrare nel genoma della pianta. Assicurarsi che il DNA plasmidico contenga pochi sali per evitare scintille elettriche durante l'uso dell'elettroporazione. Si consiglia di utilizzare un kit di estrazione del DNA plasmidico a scelta.
  2. Preparare cellule elettrocompetenti di Agrobacterium tumefaciens C58C1 contenenti il plasmide pRiA4b che induce la radice pelosa inoculando 200 mL di YEB liquido preriscaldato (28 °C) con 8 mL di una coltura fresca durante la notte. Incubare la coltura a 28 °C agitando fino a quando la densità ottica a 600 nm (OD600) è di circa 0,5, corrispondente alla fase logaritmica intermedia. Ci vogliono circa 4 - 5 ore.
  3. Dividere la coltura di Agrobacterium in quattro provette da centrifuga sterili da 50 mL pre-raffreddate. Centrifugare per 15 minuti a 4 °C a 3.200 x g.
    NOTA: Le celle devono essere mantenute fredde da questa fase in poi.
  4. Rimuovere il surnatante e risospendere delicatamente il pellet in (4x) 2,5 mL di glicerolo freddo (4 °C) al 10%. Aggiungere altri 47,5 ml di glicerolo freddo al 10% e mescolare delicatamente.
  5. Celle a pellet a 3.200 x g per 15 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in (4x) 10 mL di glicerolo freddo al 10%.
  6. Pellettare nuovamente le cellule e risospenderle in (4x) 0,75 mL di glicerolo freddo al 10%. Raggruppare il contenuto di tutte e quattro le provette in una (volume totale = 3 ml).
  7. Dividere la soluzione agrobatterica in aliquote da 50 μL in microprovette sterili da 1,5 mL pre-raffreddate. Congelare le aliquote su ghiaccio secco o azoto liquido. Conservare le provette a -80 °C per un uso futuro.
  8. Mettere una provetta di cellule competenti (50 μL) sul ghiaccio, mescolare con 5 μL di DNA plasmidico (1 μg in totale, dal punto 2.1), trasferire la miscela in una cuvetta per elettroporazione (0,2 cm di spazio) e incubare per 5 minuti su ghiaccio.
  9. Posizionare la cuvetta nell'elettroporatore ed elettroporare le celle con le seguenti impostazioni: capacità 25 μFD, resistenza 400 Ω, tensione elettrica 2,5 kV, durata dell'impulso 9,7 ms.
  10. Aggiungere 950 μL di terreno liquido LB alle cellule, che vengono poi coltivate a 28 °C per 2 ore a 300 giri/min in un termomiscelatore. Placcare 50 μL della coltura cellulare su un terreno solido LB con l'antibiotico selettivo appropriato. Lasciare in coltura le piastre per 2 giorni a 28 °C.
    NOTA: Si consiglia di calibrare una serie di colture cellulari (10 μL - 100 μL) per piastra per determinare un volume di coltura adeguato ed evitare la crescita eccessiva di batteri.
  11. Preparare colture liquide da alcune colonie selezionate in 5 mL di terreno liquido LB con antibiotici. Far crescere i batteri durante la notte a 28 °C con agitazione. Utilizzare queste colture per le scorte di glicerolo mescolando 0,5 mL di coltura batterica liquida e 0,5 mL di glicerolo al 40%.
    NOTA: La presenza del transgene in queste colonie viene verificata mediante PCR delle colonie. A tale scopo, aggiungere una piccola quantità di una colonia da una piastra alla miscela master PCR contenente tampone, dNTP e Taq polimerasi a scelta, insieme a primer che amplificano una parte del T-DNA da un vettore binario. L'inoculo proveniente dalle scorte di glicerolo viene utilizzato per la trasformazione delle piante.

3. Trasformazione della radice pelosa di Brassica napus DH12075

  1. Mettere i semi di Brassica napus DH12075 in microprovette e sterilizzarli in una flow box. Per prima cosa, sgrassare i semi con acqua e detersivo allo 0,1% agitando per 60 s. Quindi, sciacquare i semi con acqua seguita da etanolo al 70%, entrambi per 60 s.
  2. Sterilizzare i semi utilizzando una soluzione al 10% di candeggina commerciale contenente ipoclorito di sodio. Agitare i semi in questa soluzione per 20 min.
  3. Lavare i semi 4 volte con acqua sterile per 60 secondi ciascuno. Mettili su piastre di Petri contenenti il terreno di germinazione del seme. Stratificare a freddo i semi a 4 °C per una notte e spostare le piastre in una stanza di coltivazione (21 °C, 16 h luce / 8 h buio).
  4. Trasferisci le piantine di 5 giorni in scatole di coltura contenenti un terreno di coltura per piante .
    NOTA: La migliore efficienza di trasformazione in DH12075 è stata identificata per le piantine di 18 giorni. L'età della piantina può essere ottimizzata per le condizioni di crescita locali o per altre cultivar.
  5. Inoculare una coltura liquida di Agrobacterium tumefaciens C58C1 contenente un plasmide peloso che induce le radici pRiA4b e il vettore binario per la trasformazione (dal punto 2.11) con un'ansa di inoculazione. Utilizzare 5 mL di terreno LB. Coltivare questa coltura per una notte a 28 °C fino a raggiungere OD600 = 0,9 - 1.
    NOTA: L'Agrobacterium contenente solo il plasmide Ri viene utilizzato se vengono prodotte radici pelose di tipo selvatico.
  6. Iniettare una piccola quantità di coltura (circa 50 μL) con una siringa da insulina nell'ipocotile di una piantina di 18 giorni (dal punto 3.4.). Perforare l'ipocotile con un ago da 26G montato sulla siringa a circa 1 cm sopra la superficie del mezzo. Iniettare il liquido nella ferita. Anche il tessuto sulla superficie dell'ipocotile può essere graffiato dalla siringa.
    NOTA: Il numero di piantine inoculate deve essere adattato alle esigenze dello sperimentatore.
  7. Rimettere le piante nella stanza di coltivazione a 21 °C per 2-4 settimane fino a quando non si formano un callo e radici pelose nel sito di ferita.
  8. Tagliare il callo con le radici pelose emerse dall'ipocotile e posizionarlo su una capsula di Petri con il terreno di crescita della radice pelosa contenente antibiotici selettivi (trasportati dal T-DNA) e cefotaxima (200 mg/L) e ticarcillina (500 mg/L) per sopprimere la crescita agrobatterica. Sigillare le piastre di Petri con nastro adesivo permeabile ai gas. Coltiva le radici pelose a 24 °C al buio.
    NOTA: La corretta concentrazione di antibiotici specifici utilizzati per la selezione funzionale deve essere testata con radici pelose di tipo selvatico. Per B. napus DH12075 radici pelose resistenti alla kanamicina, viene utilizzata una concentrazione di 25 mg/L di kanamicina.
    NOTA: In questa fase, è possibile generare una pianta composita costituita dal germoglio selvatico e dalle radici pelose transgeniche che supportano la crescita di tale pianta. Invece di tagliare le radici pelose da uno stelo, le radici native della pianta vengono rimosse. La pianta con radici pelose emergenti viene trasferita in una scatola di coltura vegetale con un terreno di coltura composito contenente cefotaxima (200 mg/L) e ticarcillina (500 mg/L) per sopprimere la crescita agrobatterica e l'antibiotico selettivo (trasportato dal T-DNA).
  9. Dopo 1-2 settimane, isolare le radici pelose sulla piastra di Petri dal callo e individualizzarle su piastre con lo stesso terreno di coltura. Trasferisci la coltura in un piatto fresco ogni 4 o 5 settimane. Aggiungere 0,25 mg/L di IBA per aumentare la ramificazione delle radici.
  10. Ridurre gradualmente le concentrazioni di cefotaxima e ticarcillina ad ogni trasferimento di 100 mg/L (cioè, il terreno per il primo trasferimento contiene 100 mg/L di cefotaxima e 400 mg/L di ticarcillina; per il secondo trasferimento, 300 mg/L di ticarcillina, ecc.). Dopo 3-4 mesi, coltivare le radici pelose su un terreno di coltura delle radici pelose con 100 mg/L di ticarcillina e l'antibiotico selettivo.

4. Rigenerazione di Brassica napus DH12075 radici pelose

  1. Trasferire le linee radicali pelose indipendenti su piastre con terreno di rigenerazione in condizioni sterili utilizzando una pinzetta, fiammata prima dell'uso. Trasferire 5 - 10 radici per capsula di Petri e coltivarle a 21 °C in un fotoperiodo di lunga durata (16 h di luce / 8 h di buio). Sigillare le piastre di Petri con nastro adesivo permeabile ai gas.
  2. Ogni 3 o 4 settimane, trasferisci le radici pelose su piastre con terreno di rigenerazione fresco. Si noti che le calli si formano dopo circa 2 settimane. Il callo inizia a sparare dopo altre 2 settimane fino a 8-9 settimane dopo la formazione del callo.
  3. Individualizza i germogli e trasferiscili in scatole di coltura per piante con terreno di allungamento dei germogli per 2 o 3 settimane per favorire l'allungamento dei germogli.
  4. Trasferisci i germogli allungati in scatole di coltura per piante con un terreno di induzione radicale. Aggiorna la coltura ogni 3-4 settimane. L'efficienza di radicazione in DH12075 è dell'87% a 30 giorni e fino al 100% dopo 60 giorni.
  5. Trasferisci le piante radicate nel terreno dopo aver rimosso eventuali tracce di gelificante per prevenire l'infezione fungina. Assicurarsi che le piante siano prima acclimatate nei fitotroni (21 °C, fotoperiodo a giorno lungo, 150 μE) e poi trasferirle in una serra per la fioritura (21 °C / 18 °C, fotoperiodo a giorno lungo, 150 μE).

5. Selezione del rigenerante e della pianta T1

NOTA: Le linee radicali pelose possono essere selezionate prima di entrare nel processo di rigenerazione. Il tipo di selezione dipende dal contenuto trasportato dal transgene. Le radici pelose possono essere campionate per l'estrazione del DNA e la genotipizzazione o il rilevamento di mutazioni, l'estrazione dell'RNA con successiva sintesi di cDNA e la RT-qPCR per l'analisi del livello di espressione del gene scelto, la microscopia per il rilevamento della fluorescenza o il trattamento per la colorazione GUS.

  1. Dopo il trasferimento in terra, genotipizzare nuovamente le piante rigeneranti T0 (e le piantine T1) per evitare fughe dalle procedure di selezione. Le piante T0 presentano un fenotipo alterato chiamato fenotipo Ri: crescita estesa delle radici, foglie arricciate e germogli nani causati dalla presenza del TL e/o del TR-DNA del plasmide Ri inserito nel genoma della pianta.
  2. Per accelerare la selezione T1, utilizzare i semi contenenti embrioni verdi maturi (circa 21 - 28 giorni dopo l'impollinazione per DH12075 per un embrione siluro o più vecchio) da piante rigeneranti T0 per il salvataggio degli embrioni.
    1. Lavorare nella scatola di flusso sterile. Raccogliere le silique e sterilizzarle in superficie con etanolo al 70%.
    2. Posizionali su un nastro biadesivo fissato con nastro adesivo su un coperchio di piatto o su un vetrino.
    3. Utilizzando uno stereo-binocolo, tagliare la silique lungo i margini della valvola utilizzando un ago da 26G. Assicurati che il taglio non danneggi i semi. Per una facile presa, montare l'ago su una siringa da 1 ml.
    4. Aprite i carpelli e incollateli al nastro. Raccogli i semi immaturi e trasferiscili in piastre con terreno per la germinazione dei semi. Sigillare le piastre con nastro adesivo permeabile ai gas.
    5. Posizionare le piastre in una stanza di coltivazione (21 °C, 16 h di luce / 8 h di buio) fino alla germinazione.
  3. Genotipizzare le piantine T1 per la presenza del transgene di interesse e l'assenza del Ri TR/TL (Figura 1). Raccogli il materiale fogliare ed estrai il loro DNA utilizzando il metodo scelto. Il metodo CTAB è descritto di seguito:
    1. Raccogliere il materiale fogliare in una microprovetta da 2 mL contenente due perle di ceramica. Congelare il tubo in azoto liquido.
    2. Macinare il materiale utilizzando un mulino a sfere. In alternativa, si possono usare pestello e mortaio.
    3. Dopo una rapida centrifugazione, aggiungere 400 μL di tampone CTAB alla polvere. Vorticare brevemente, centrifugare e incubare a 60 °C per almeno 50 minuti.
    4. Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente per 15 min. Aggiungere un volume di cloroformio e mescolare delicatamente.
      ATTENZIONE: Quando si utilizza il cloroformio, lavorare sotto il flusso chimico e utilizzare guanti per proteggersi. Qualsiasi soluzione contenente cloroformio deve essere gettata nell'apposito cestino.
    5. Centrifugare per 5 minuti a 18.400 x g utilizzando una centrifuga da tavolo. Trasferire 250 - 350 μL della fase acquosa superiore in una nuova microprovetta. Omettete l'interfase.
    6. Aggiungere un volume di isopropanolo, mescolare bene e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare per 40 minuti a 18.400 x g.
    7. Scartare il liquido e aggiungere 200 μL di etanolo al 70%. Lavare il pellet e centrifugare per 15 minuti a 18.400 x g.
    8. Scartare il liquido. Asciugare il pellet all'aria e aggiungere 50 - 100 μL di acqua ultrapura. Lasciare sciogliere il DNA per 1 ora o tutta la notte in frigorifero.
  4. Eseguire una genotipizzazione mediante PCR per il gene rolA (TL), il gene aux1 (TR) e il locus virC (Agrobacterium). Preparare la reazione PCR utilizzando il DNA preparato (dal passaggio 5.3.), primer, tampone, dNTP e Taq polimerasi secondo il protocollo del produttore. I frammenti amplificati sono lunghi 200 - 500 bp.
    Primer specifici per rolA:
    Attaccante: GTTAGGCGTGCAAAGGCCAAG
    Retromarcia: TGCGTATTAATCCCGTAGGTC
    Primer specifici per aux1:
    Attaccante: CATAGGATCGCCTCACAGGT
    Rovescio: CGTTGCTTGATGTCAGGAGA
    Primer specifici per virC:
    Avanti: AATGCGTCTCTCTCTCGTGCAT
    Rovescio: AAACCGACCACTAACGCGAT
    NOTA: Il trasferimento e l'integrazione del T-DNA potrebbero essere parziali e solo parti di TL e/o TR potrebbero integrarsi nel genoma. Pertanto, si raccomanda di analizzare la presenza di altri ORF di TL (ad esempio, rolB e rolC) e TR (aux2, mas1, ags1) nelle piantine T1. Le sequenze di primer specifiche per questi loci sono elencate in Jedličková et al.9.
  5. Valutare le reazioni di PCR mediante elettroforesi su gel.
    NOTA: Si raccomanda di includere un controllo positivo in questa analisi per garantire la presenza di DNA di grado PCR.
  6. Selezionare la presenza (o l'assenza) del transgene secondo i protocolli in base al contenuto di questo transgene.
  7. Trasferisci le piantine selezionate sul terreno.

6. Trasformazione e rigenerazione delle radici pelose in Arabidopsis thaliana Col-0

  1. Sterilizzare in superficie i semi di A. thaliana con un metodo a scelta (candeggina, etanolo o cloro gassoso).
  2. Piastra i semi sterili su un terreno per la germinazione dei semi. Dopo 2 giorni di stratificazione a freddo, spostare le piastre in una stanza di coltivazione (21 °C con fotoperiodo a giorno lungo e 50% di umidità).
  3. Trasferisci le piantine di 1 settimana in una scatola di coltura vegetale con terreno di coltura per piante.
  4. Preparare le colture di Agrobacterium come indicato al punto 3.5.
  5. Iniettare una piccola quantità di coltura (circa 50 μL) con un ago montato su una siringa da insulina alla base del gambo dell'infiorescenza primaria (circa 1-2 cm sopra la rosetta) di piantine di Arabidopsis di 1 mese. Anche il tessuto sulla superficie dello stelo primario può essere graffiato dalla siringa.
  6. A 2-4 settimane dall'iniezione, asportare le radici pelose emergenti e coltivarle su piastre di Petri con il terreno di crescita delle radici pelose integrato con l'antibiotico selettivo (trasportato dal T-DNA) e cefotaxima (200 mg/L) e ticarcillina (500 mg/L) per sopprimere la crescita agrobatterica. Incubare le piastre a 24 °C al buio.
  7. Dopo 1-2 settimane, individuare le radici pelose su piastre con lo stesso terreno di coltura. Trasferire le linee radicali pelose selezionate su un terreno fresco ogni 4-5 settimane.
    NOTA: Le radici pelose di A. thaliana sono più sottili di quelle di B. napus e bisogna prestare attenzione quando si trasferiscono su terreni freschi.
  8. Trasferire le radici pelose in piastre con terreno di rigenerazione per indurre la formazione di calli. Coltivare le piastre a 21 °C in un fotoperiodo a giorno lungo (16 ore di luce / 8 ore di buio).
  9. I germogli emergono dal callo dopo 18-21 giorni di coltivazione. Tagliare i germogli e trasferirli in un terreno di allungamento dei germogli per 2-3 settimane per favorire la crescita e l'allungamento.
  10. Trasferisci i germogli allungati nel mezzo di induzione della radice.
  11. Trasferisci le piante radicate nel terreno. Le piante T0 presentano anche un fenotipo Ri. Eseguire la selezione transgenica, come descritto per B. napus DH12075 (fase 5).

Risultati

In precedenza abbiamo ottimizzato un protocollo per l'induzione di radici pelose basate su iniezione in tre cultivar di Brassica napus, vale a dire DH12075, Topas DH4079 e Westar9. Per applicare questo protocollo di trasformazione alla specie modello A. thaliana, gli steli primari dell'infiorescenza di piantine di 1 mese sono stati iniettati con un inoculo agrobatterico. Le radici pelose sono emerse nel sito di iniezione dopo 2-4 settimane. Le radici pelose sono state asportate e coltivate sul terreno solido. Il confronto del metodo in queste due specie è illustrato nella Figura 1.

Le linee radicali pelose selezionate sono state trasferite al mezzo di rigenerazione per indurre la formazione dei germogli. In A. thaliana, i calli gialli sono stati indotti entro 14 giorni in tutte e 10 le linee radicali pelose testate. I primi primi germogli sono emersi come macchie verde scuro entro 3 settimane dal trasferimento nel mezzo di rigenerazione (Figura 2). Dopo 4 settimane di coltura, i germogli coprivano le radici pelose in 9 delle 10 linee di radici pelose (efficienza di rigenerazione del 90%). In alcuni casi, le radici avventizie sono state ricavate dal callo (Figura 2H). Una linea non si è rigenerata nemmeno dopo 3 mesi sul terreno di rigenerazione (ogni 4 settimane, le radici pelose sono state trasferite in un terreno fresco). Pertanto, l'efficienza di rigenerazione delle radici pelose di A. thaliana assomiglia all'efficienza di B. napus DH120759.

I rigeneranti radicali pelosi di B. napus e A. thaliana mostrano un fenotipo nano (Figura 3), una caratteristica tipica delle piante pelose derivate da radici2. Abbiamo anche osservato un apparato radicale denso, foglie rugose e cambiamenti nel tempo di fioritura. Questo cosiddetto fenotipo della radice pelosa (o Ri) è causato dai geni rol del plasmide Ri inseriti nel genoma della pianta. L'inserzione del Ri T-DNA e del transgene codificato su un vettore binario può essere indipendente o collegata. Pertanto, un'analisi di segregazione della progenie T1 creata dall'autoimpollinazione aiuta a identificare le piante prive di rol che esprimono il transgene di interesse. La genotipizzazione delle piante T1 viene eseguita mediante primer PCR specifici per le ORF di TL e TR e per il transgene di interesse. L'assenza di contaminazione agrobatterica è verificata dall'assenza di prodotti PCR di primer virC (Figura 1).

Diagramma di trasformazione, PCR, induzione delle radici pelose, genotipizzazione delle piante T1, analisi funzionale dei transgeni.
Figura 1: Riassunto della procedura in A. thaliana e B. napus. L'iniezione dell'Agrobacterium inoculum nel fusto dell'infiorescenza ipocotile o primaria induce lo sviluppo di radici pelose. Le radici pelose possono sostituire le radici autoctone per generare una pianta composita che verrà genotipizzata e analizzata (frecce blu). Le radici pelose coltivate possono essere rigenerate in piante T0, propagate in piante T1 e genotipizzate (frecce verdi). Le radici pelose possono anche essere sottocoltivate per l'analisi funzionale (freccia nera). Vengono presentati esempi di risultati di genotipizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Fasi di crescita della coltura di tessuti vegetali; Immagini al microscopio nell'arco di quattro settimane che mostrano cambiamenti morfologici.
Figura 2: Rigenerazione delle radici pelose in A. thaliana. (A) Coltura radicale pelosa 1 giorno dopo il suo trasferimento in piastre. (B, C) Calli si è sviluppato entro 2 settimane dalla coltura su terreno di rigenerazione. (D, E) I primi germogli sono emersi dopo 3 settimane di coltura. (G, H) I germogli si formano dopo 4 settimane. (H) Le radici avventizie si sono sviluppate dal callo. (C, F, I) Linea radicale pelosa non rigenerante. Le barre della scala rappresentano 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Confronto tra la rigenerazione di Arabidopsis e Brassica napus; piante di tipo selvatico vs piante derivate da radici pelose.
Figura 3: Foto rappresentative di piante wild-type di B. napus e A. thaliana e rigeneranti derivati da radici pelose (piante T0). Si noti il fenotipo Ri dei rigeneranti. Le barre della scala rappresentano 2 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Abbiamo sviluppato un semplice protocollo per la trasformazione delle radici pelose e la successiva rigenerazione in B. napus e A. thaliana. Questo processo include l'induzione della radice pelosa basata su iniezione nell'ipocotile (B. napus) o nel fusto dell'infiorescenza primaria (A. thaliana). Il metodo di iniettare l'ipocotile con il ceppo agrobatterico C58C1 che trasporta un plasmide Ri è stato efficace anche nella famiglia delle Fabaceae10,11, oltre ai membri delle Brassicaceae presentati in questo studio.

Un'alternativa al metodo basato sull'iniezione è la trasformazione per immersione che consiste nell'immersione dell'espianto in una sospensione batterica, seguita dalla co-coltivazione dell'espianto con agrobatteri. Il vantaggio del metodo a iniezione rispetto al metodo a immersione è il tempo risparmiato dall'assenza di alcune fasi del protocollo: preparazione dell'espianto, test del tempo di co-coltivazione e coltura su un terreno contenente ormone per l'induzione delle radici pelose. Sebbene entrambi gli approcci siano efficaci per l'induzione delle radici pelose, in alcune specie è stata osservata una maggiore efficienza di trasformazione con il metodo basato sull'iniezione rispetto a quello basato sull'espianto12,13. Inoltre, la trasformazione per iniezione è utile anche per generare piante composite (radici pelose transgeniche e germogli wild-type). Dopo aver tagliato le radici originali della pianta trasformata, le radici pelose supportano la crescita della pianta e il transgene può essere studiato nel contesto dell'intera pianta.

La fase critica dell'induzione della radice pelosa è l'iniezione dell'inoculo nell'ipocotile, o stelo dell'infiorescenza primaria. Gli ipocotili di B. napus sono fragili e il taglio dell'intero ipocotile può avvenire facilmente. Lo stesso può essere osservato con A. thaliana a causa della sottigliezza del fusto dell'infiorescenza. Se è necessario un confronto dell'efficienza di trasformazione di diverse specie/cultivar, si consiglia che una persona esegua tutti gli esperimenti per evitare l'errore causato dalla manipolazione e dall'abilità nell'iniezione delle piante.

Abbiamo sviluppato un protocollo efficace per la rigenerazione delle radici pelose in B. napus DH12075 e A. thaliana Col-0. Poiché la rigenerazione è un processo altamente variabile, alcune modifiche del protocollo possono essere applicate a una specie o a una cultivar di scelta. Ad esempio, i germogli pelosi derivati dalle radici possono essere elicitati da un diverso rapporto auxina/citochinina (1:1) in B. oleracea14. In alternativa, la citochinina thidiazuron può essere utilizzata al posto del BAP, come nel caso delle radici pelose di B. campestris 15.

Inserzioni multiple del T-DNA del plasmide Ri nel genoma della pianta rappresentano una potenziale limitazione del sistema di trasformazione e rigenerazione delle radici pelose. In questi casi, nessuna pianta priva di TL/TR dal plasmide Ri viene scoperta dopo un'analisi di segregazione delle piantine T1. Pertanto, si consiglia di generare diverse linee di radici pelose indipendenti per ogni transgene.

Le colture di radici pelose sono uno strumento estremamente potente per gli studi funzionali dei geni, principalmente a causa del loro rapido insediamento e della manutenzione economica (non sono necessari ormoni nei terreni di coltivazione). Questo protocollo copre i metodi per l'induzione e la rigenerazione delle radici pelose in B. napus e A. thaliana, che possono essere utilizzati per studiare il transgene di interesse direttamente nelle colture di radici pelose, nel contesto dell'intera pianta utilizzando piante composite, o dopo la rigenerazione delle piante transgeniche.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta senza alcuna relazione commerciale o finanziaria che possa essere interpretata come un potenziale conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Ringraziamo Jiří Macas (Centro di biologia CAS, České Budějovice, Repubblica Ceca) per aver fornito il ceppo agrobatterico. Il Core Facility Plants Sciences di CEITEC MU è riconosciuto per il suo supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero dell'Istruzione, della Gioventù e dello Sport della Repubblica Ceca con il Fondo Europeo di Sviluppo Regionale-Progetto "SINGING PLANT" (n. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446) e il progetto INTER-COST LTC20004.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette da 1,50 mLEppendorf125.215
Soluzione al 10% di candeggina commerciale Acido SAVO
1-naftaleneacetico (NAA) DuchefaN0903Terreno di rigenerazione del callo
2,0 mL provetteEppendorf108.132/108.078
Nastro microporoso 3MMicropore
6-Benzylaminopurin (BAP) DuchefaB0904Medium di rigenerazione del callo, medio di allungamento del germoglio 
70% etanolo
batteriologico agarHiMediaRM201LB medium
Peptone batteriologicoOxoidLP0037LB e YEB media
Estratto di manzoRothX975.1YEB medium
BottiglieDURANL300025
Cefotaxime sodicoDuchefaC0111Substrato di crescita delle radici pelose, mezzo di rigenerazione del callo, mezzo di allungamento dei germogli, mezzo di induzione delle radici
cloroformioServa3955301
CTAB Bromuro di esadeciltrimetilammonioSigma52365
dNTP mixThermo Fisher ScientificR0193
EDTA - Titriplex III, acido (etilenendinitrilo)tetraacetico, sale disodico, diidratoSigmaES134-250G
elettrofesi per cuvette
elettroporatorie agar, peqGOLD camera perVWR732-2789
Lettore di gel per elettroforesiBIO-RAD Elettroporatore BIO-RAD
GenePulser XcellBIO-RAD
bromurodi etidioCuvette per elettroporazione AppliChem
Gene Pulser/MicroPulser, spazio di 0,2 cmBIO-RAD1652082
Gene Ruler Mix di scale per DNAThermo Fisher ScientificSM0331
Acido gibberellico (GA3)DuchefaG0907Mezzo di allungamento dei germogli 
gliceroloSigmaG5516-1L
HEPES (2-(4-(2-idrossietil)-1-pirerazinil)-etansulfonicoMerck1101100250
acido indolo-3-butirrico (IBA)DuchefaI0902Mezzo di induzione della radice
kanamicina monosolfatoDuchefaK0126
Magenta GA-7 Scatola di coltura vegetale con coperchioPlant MediaV8505-100
graduato
MES monoidratoDuchefaM1503Substrato per la crescita delle radici pelose, Terreno per la rigenerazione dei calli, Terreno per l'allungamento dei germogli, Mezzo per l'induzione delle radici, Terreno per la germinazione, Terreno per la crescita delle piante
Murashige e Skoog medium (MS)DuchefaM0237Medium per la germinazione, Terreno per la crescita delle piante
Murashige e Skoog medium (MS) + vitamine B5;DuchefaM0231Substrato di crescita delle radici pelose, Terreno di rigenerazione del callo, Mezzo di allungamento del germoglio, Ago medio di induzione della radice
Agani 26G x 1/2 - 0,45 x 13 mmMisuratore
PhytagelSigmaP8169Mezzo di rigenerazione del callo, Mezzo di induzione della radice, Terreno per la germinazione
9003-39-8
Redtaq DNA polimerasi, Taq per PCR di routine con colorante inerte, tampone 10X inclusoSigmaD4309-250UN
Mulino RetshQiagen
cloruro di sodioLachner30093-APOLB
quadrato medio Piastre di PetriCorningGOSSBP124-05
saccarosioPenta24970-31000Substrato di crescita delle radici pelose, Mezzo di rigenerazione del callo, Mezzo di allungamento dei germogli, Mezzo di induzione delle radici, Mezzo per la germinazione, Terreno di coltura delle piante
Filtro per siringaCarl RothP666.1Filtri per siringa Rotylabo 0,22 e micro; m dimensione dei pori
termomiscelatoreEppendorf
Ticarcillina dissodicoDuchefaT0180Terreno di coltura della radice pelosa
Tris(idrossimetil)aminomethanServa3719003
acqua ultrapuraMillipore Milli-Q acqua purificata 
Estratto di lievitoDuchefaY1333LB medium
elettroforesi universale Cilindro di pH Terumo PVP 40 (polivinilpirolidone Mr 40000)Sigma

Riferimenti

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