L'obiettivo di questo documento è quello di descrivere in dettaglio le migliori pratiche per la produzione di terreni per microrganismi anaerobici fastidiosi acquisiti da un ambiente. Questi metodi aiutano a gestire le colture anaerobiche e possono essere applicati per supportare la crescita di microrganismi non coltivati elusivi, la "materia oscura microbica".
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Un insieme di mezzi di comunicazione simulati informati in situ per la coltura di microrganismi anaerobici acquisiti nell'ambiente
In questo articolo
Sommario
Abstract
La ricerca sui microrganismi anaerobi dipendente dalla coltura si basa sulla competenza metodologica. Questi metodi devono creare e mantenere condizioni di crescita adeguate (ad esempio, pH e fonti di carbonio) per i microrganismi anaerobici, consentendo al contempo l'estrazione di campioni senza compromettere l'ambiente artificiale. A tal fine, i metodi che si basano e simulano un ambiente in situ possono essere di grande aiuto nella coltura di microrganismi provenienti da quell'ambiente. Qui, descriviamo un metodo anaerobico in situ informato e simulato per la coltura di microrganismi terrestri superficiali e sotterranei, enfatizzando la raccolta di campioni anaerobici con perturbazioni minime. Questo protocollo descrive in dettaglio la produzione di un mezzo liquido anaerobico personalizzabile e l'acquisizione ambientale e la crescita in vitro di microrganismi anaerobici. Il protocollo copre anche i componenti critici di un bioreattore anaerobico utilizzato per simulazioni ambientali di sedimenti e mezzi liquidi anaerobici per colture acquisite in ambiente. Abbiamo incluso i dati preliminari di sequenziamento di nuova generazione da un microbioma mantenuto per tutta la durata di vita di un bioreattore in cui la coltura attiva si è regolata dinamicamente in risposta a una fonte sperimentale di carbonio.
Introduzione
La maggior parte dei microrganismi rimane non coltivata; Ciò è supportato dalla grande disparità tra le cellule osservata attraverso la microscopia, contrastata dai pochi microrganismi coltivati con successo utilizzando piastre di agar. Staley e Konopka chiamarono questa disparità "Anomalia del Conteggio delle Grandi Placche"1. La diversità stimata non contabilizzata è supportata da dati metagenomici e metatrascrittomici che mostrano molti nuovi generi distribuiti in curve di abbondanza di rango provenienti da diversi ambienti2. I microrganismi che sono stati osservati (generalmente mediante sequenziamento casuale di una comunità microbica) ma che non sono stati coltivati sono stati definiti "materia oscura microbica"3,4.
Nell'era della -omica, la coltura di microrganismi rimane fondamentale per valutare appieno i dati genomici e verificare la funzione/fenotipo dei geni presenti. Il sequenziamento di microrganismi in coltura è ancora l'unico modo per ottenere con sicurezza genomi completi fino a quando tecnologie come la metagenomica shotgun e i genomi assemblati con metagenoma dall'ambiente non diventeranno infallibili5. Le valutazioni genomiche accoppiate con microrganismi in coltura forniscono forti inferenze per la comprensione della "materia oscura microbica". Molti membri della "materia oscura microbica" svolgono funzioni cruciali che hanno un impatto sul ciclo dei nutrienti e di altri elementi e sulla produzione di preziosi prodotti naturali, supportano i sistemi ecologici e svolgono servizi ecologici. Dal punto di vista medico, circa la metà di tutti i prodotti farmaceutici attualmente commercializzati sono prodotti e derivati di prodotti batterici, e si sospetta che la profilazione di specie non coltivate riveli gli antibiotici del futuro. Per ottenere l'accesso a questa maggioranza incolta, è necessario aumentare una varietà di metodologie di coltivazione6. Tra i membri della "materia oscura microbica", i microrganismi oligotrofi anaerobici sono in gran parte sottostimati e probabilmente detengono percorsi biochimici ecologicamente e industrialmentepreziosi, rendendoli importanti bersagli della coltura. Tuttavia, i microrganismi oligotrofi anaerobici sono più difficili da coltivare rispetto alle loro controparti aerobiche e copiotrofiche a causa dei tempi di incubazione più lunghi spesso richiesti, delle condizioni esigenti (ad esempio, particolari temperature in vitro non standard) e dell'uso di ricette di terreni specializzati.
Le attuali tecniche di sviluppo per coltivare membri della "materia oscura microbica", compresi i nuovi microrganismi oligotrofi anaerobici, hanno notevolmente migliorato la nostra comprensione e aumentato la rappresentazione di questi microrganismi all'interno dell'albero filogenetico. Le attuali tecniche che utilizzano terreni informati per la coltura di nuovi microrganismi (cioè terreni derivati dalla conoscenza del/i microrganismo/i di interesse) possono essere suddivise in tre metodi distinti. Il primo dei metodi prevede la rimozione diretta di una sezione discreta dell'ambiente per il trasferimento in una camera di crescita in vitro che contiene già i microrganismi di interesse all'interno di una membrana. La sezione discreta (ad esempio, l'acqua di mare) agisce per fornire ai microrganismi di interesse l'habitat geochimico che utilizzano in situ, mentre la membrana arresta il movimento delle cellule attraverso (le cellule di interesse rimarranno all'interno; le cellule estranee che sono arrivate con la sezione discreta rimarranno all'esterno). Includendo composti naturalmente disponibili per i microrganismi bersaglio nel loro habitat naturale, tali microrganismi possono essere coltivati8. Il secondo metodo utilizza la metatrascrittomica o la genomica per chiarire le capacità metaboliche, fornendo indizi su parametri di coltura ristretti per un disegno mirato del terreno. Questo approccio fornisce un profilo eco-fisiologico che può essere utilizzato per indirizzare l'arricchimento di specifici tipi di microrganismi da un ambiente. Le disposizioni del terreno sono adattate ai geni identificati presenti che si presume supportino i microrganismi bersaglio per ridurre la diversità di arricchimento,9,10. Un avvertimento è che le informazioni genomiche non deducono direttamente l'espressione dei geni, mentre le informazioni trascrittomiche sì.
Il terzo metodo comprende i media informati e simulati dal punto di vista ambientale, distinti dal primo metodo, che non simula i media, ma utilizza l'ambiente direttamente come fonte di media. Questo terzo metodo richiede la ricognizione ambientale della geochimica di un sito di campo contenente microrganismi di interesse. Con questa conoscenza, i componenti primari e i parametri fisici vengono identificati per produrre un mezzo simulato informato sull'ambiente. Il terreno riceve quindi un'infusione diretta di sedimenti o liquidi contenenti microrganismi dall'ambiente nel terreno. Questo metodo è particolarmente utile nei casi in cui il microbiologo colturatore non ha accesso a quantità sufficienti di ambiente sorgente (come necessario per il primo metodo) né a dati metatrascrittomici o genomici appropriati (come necessario per il secondo).
Il seguente protocollo è un esempio del terzo metodo; Si basa e mira a simulare gli ambienti di interesse. All'interno del protocollo vengono presentate in parallelo tre ricette di terreni naïve mirate a diverse colture di microrganismi anaerobi acquisite sul campo. Le tre colture rappresentate sono colture miste originate dal suolo (di seguito, coltura mista del suolo), colture miste originate dall'interno di un pozzo trivellato (di seguito, coltura mista da pozzo) e un metanogeno isolato proveniente dall'interno di un pozzo trivellato (di seguito, metanogeno isolato da pozzo). Le identità composte e le quantità nelle ricette multimediali qui condivise sono intese come una guida iniziale; Sono in grado e incoraggiati ad essere personalizzati in base all'ambiente del lettore e ai microrganismi di interesse.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Produzione di mezzo liquido anaerobico personalizzabile
- Terreno per flaconi di coltura (produzione di 500 ml)
- Misurare e aggiungere composti in un flacone da 1 L e regolare il pH utilizzando la colonna nella Tabella 1 corrispondente alla cultura di interesse del lettore (le quantità nella Tabella 1 sono registrate per una produzione di 1.000 mL, regolare di conseguenza). Mescolare i composti fino a ottenere omogeneità facendo roteare la bottiglia.
- Riscaldare il liquido fino all'ebollizione cuocendo la bottiglia nel microonde per 5-6 minuti. Aprire spesso il microonde e far roteare delicatamente il liquido utilizzando un guanto resistente al calore. Aprire rapidamente il microonde se il liquido si ferma dopo aver fatto gorgoglie; in caso contrario, il liquido potrebbe espandersi rapidamente e traboccare dalla bottiglia.
- Collegare una pipetta sterile in vetro da 10 mL a una configurazione del collettore del gas N2 (in base al progetto di Balch et al.11, sebbene non richieda una colonna di rame riscaldata per il gas N2 di purezza; vedere il file supplementare 1 per ulteriori informazioni sul collettore del gas). Aprire il collettore per sfiatare O2 e far defluire il gas N2 .
- Posizionare il puntale della pipetta nel liquido e regolare il flusso di gas in modo che le bolle siano moderatamente vigorose. Sciacquare il liquido con N2 fino a quando il flacone non è più troppo caldo per essere toccato.
NOTA: Questa operazione dipende dal contenuto del supporto, ma in genere richiede ~20 minuti. - In attesa che il flacone si raffreddi, disporre 10 flaconi sterili da 100 ml; oppure, se si preparano terreni per la raccolta di colture miste in terra, disporre due flaconi sterili da 500 ml.
- Una volta che il flacone del terreno è freddo al tatto, tirare la punta della pipetta verso l'alto nello spazio di testa del flacone. Aggiungere 0,125 g di NaHCO3 e 0,300 g di Na2S∙9 H2O e attendere che resazurina diventi incolore.
ATTENZIONE: Na2S∙9 H2O è corrosivo, tossico e irritante. Utilizzare dispositivi di protezione individuale durante la manipolazione e sciacquare accuratamente gli utensili metallici dopo il contatto. - In attesa che resazurina cambi colore, collegare le cannule metalliche alla configurazione del collettore del gas e posizionare le punte delle cannule nei flaconi di coltura. Regolare il flusso di N2 nelle bottiglie a una velocità moderata, in modo che il liquido aggiunto nella fase successiva non scivoli a causa del flusso di gas.
- Una volta che la resazurina è incolore, somministrare 50 mL di liquido in ciascun flacone di coltura o 250 mL di liquido in ciascun flacone da 500 mL.
- Tappate ogni flacone con un tappo di gomma della stessa misura subito dopo aver rimosso le cannule. Fissare il tappo con un sigillo in alluminio (per flaconi di coltura) o un tappo a vite aperto GL45 (per flaconi da 500 ml).
- Metti le bottiglie in un contenitore autoclavabile e riempi il contenitore con acqua del rubinetto fino a quando i livelli dell'acqua non corrispondono a quelli delle bottiglie.
NOTA: Ciò garantirà che le bottiglie non si rompano a causa dello stress causato dalle differenze di temperatura sul vetro durante la sterilizzazione in autoclave. - Autoclavare le bottiglie a 121 °C per 30 min.
- Mezzo per bioreattore (produzione di 8 L)
- Preparazione della damigiana
- Aprire la valvola di una valvola a sfera portagomma da 1/4" (6.4 mm). Collegare due tubi in silicone di 6 cm di diametro interno (ID) da 1/4" (6.4 mm) e diametro esterno (OD) da 1/2" (12.7 mm) su entrambe le estremità della valvola a sfera portagomma.
- Fissare a un'estremità del gruppo un raccordo adattatore portagomma da 5/16"-1/4" (7.9 mm-6.4 mm). Fissare l'altra estremità del gruppo al portagomma di una damigiana da 8 litri.
- Utilizzare una fascetta per fissare il collegamento tra il portagomma della damigiana e il tubo e il collegamento tra il raccordo dell'adattatore del portagomma e il tubo.
- Autoclavare la damigiana con montaggio a 121 °C per 30 min.
- Produzione media
- Chiudere la valvola della valvola a sfera portagomma sul gruppo damigiana da 8 L.
- Misurare e aggiungere composti alla damigiana da 8 L e regolare il pH utilizzando la colonna nella Tabella 1 corrispondente alla cultura di interesse del lettore (le quantità nella Tabella 1 sono registrate per una produzione di 1.000 mL, regolare di conseguenza). Aggiungere una barra per mescolare e utilizzare una piastra calda per mescolare i composti fino a ottenere omogeneità.
- Scaldare il liquido fino all'ebollizione con la piastra riscaldante. Lasciare bollire il liquido per 30 min.
NOTA: Il riscaldamento del liquido fino all'ebollizione dipende dal contenuto del fluido, ma può richiedere 2-3 ore. - Collegare una pipetta sterile in vetro da 10 mL a una configurazione del collettore del gas N2 (in base al progetto di Balch et al.11, sebbene non richieda una colonna di rame riscaldata per il gas N2 di purezza; vedere il file supplementare 1 per ulteriori informazioni sul collettore del gas). Aprire il collettore per sfiatare O2 e far defluire il gas N2 .
- Spegnere il fuoco, quindi inserire il puntale della pipetta nel liquido e regolare il flusso di gas in modo che le bolle siano moderatamente vigorose ma non traboccanti. Sciacquare il liquido con N2 per 30 min.
- Tirare il puntale della pipetta verso l'alto nello spazio di testa della damigiana. Aggiungere 2,0 g di NaHCO3 e 4,8 g di Na2S∙9 H2O e attendere che la resazurina diventi incolore.
ATTENZIONE: Na2S∙9 H2O è corrosivo, tossico e irritante. Utilizzare dispositivi di protezione individuale durante la manipolazione e sciacquare accuratamente gli utensili metallici dopo il contatto. - Una volta che la resazurina è incolore, rimuovere la pipetta di vetro e tappare immediatamente la damigiana con un tappo #10. Attorcigliare un filo sopra il tappo e intorno al bordo della damigiana per fissare il tappo.
- Preparazione della damigiana
2. Acquisizione in situ di microrganismi anaerobici ambientali
- Acquisizione di campioni anaerobici superficiali (coltura mista del suolo)
- Portare sul campo le bottiglie di terreno misto di terreno coltivato come sopra e un carotatore.
NOTA: Gli autori utilizzano una punta per terreno conica standard Giddings da 2 5/8" (Tabella dei materiali). Tuttavia, è possibile utilizzare qualsiasi carotatrice o cazzuola in grado di campionare alla profondità desiderata. - Spingere (azionamento palo/picchetto) il carotatore nel sedimento fino a quando la parte superiore del cilindro di raccolta del campione non è a filo con la superficie del sedimento.
- Ruotare il carotiere di 90° per liberare il nucleo e tirare verso l'alto fino a quando il campione non viene estratto dall'ambiente.
- Nei sedimenti sciolti (come quelli che si possono incontrare durante il campionamento delle zone umide), coprire la base del nucleo con una nuova mano guantata di nitrile durante l'estrazione per evitare che il campione cada o si disperda nell'acqua durante l'estrazione.
- Approssimare rapidamente a occhio 6-7 cm dalla base del nocciolo. Usa una nuova mano guantata di nitrile per tagliare il nucleo e separare il fondo di 6-7 cm.
- Trasferire immediatamente il fondo del nucleo sul flacone di coltura. Se il terreno/sedimento è troppo grande, formarlo rapidamente per inserirlo più facilmente nella bottiglia, riducendo al minimo l'esposizione all'atmosfera aerobica.
- Una volta trasferito il campione, riposizionare immediatamente il tappo e tenerlo in posizione con un tappo a vite.
- Mantenere il campione al fresco. Conservare in frigorifero il flacone di raccolta a 4 °C al momento del ritorno in laboratorio.
- Portare sul campo le bottiglie di terreno misto di terreno coltivato come sopra e un carotatore.
- Acquisizione di campioni anaerobici sotterranei (coltura mista in pozzo)
- Disporre una bombola sterile da 1 L vicino al collettore del gas. Tappare la bottiglia con un tappo di gomma. Far gocciolare il 100% di etanolo sul tappo e dargli fuoco usando un accendino.
- Collegare un ago sterile da 23 G alla configurazione del collettore del gas N2 . Aprire il collettore per sfiatare O2 e lasciare defluire il gas N2 (o Ar) a velocità moderata.
- Una volta che il tappo non è più in fiamme, inserisci l'ago nel flacone. Inserire un secondo ago sterile da 23 G non attaccato al collettore del gas nel flacone. Sciacquare il flacone per 1-2 min.
- Estrarre l'ago non collegato al collettore del gas. Pressurizzare il flacone per 1 min. Estrarre l'ago rimanente.
- Portare il flacone pressurizzato e un ago sterilizzato da 23 G nel sito del pozzo. Prelevare il liquido dal foro di trivellazione seguendo i metodi di Merino et al.12.
NOTA: A seconda del metodo, della connessione e della portata del pozzo, questo cambia la strategia di acquisizione di un campione d'acqua. Se c'è un flusso d'acqua continuo, raccogliere l'acqua come descritto al punto 2.2.6. sarà sufficiente. Se il flusso d'acqua viene raccolto in batch o a bassa portata, è possibile utilizzare un metodo di ingresso/uscita alternativo. In tutte le situazioni, ridurre al minimo la contaminazione e cercare di garantire che il campione raccolto sia rappresentativo dell'ambiente che si desidera campionare. Questa è un'affermazione ampiamente generalizzata perché è stata l'esperienza degli autori che ogni evento di raccolta di campioni da siti governativi o privati doveva essere altamente adattabile all'accessibilità disponibile. - Aprire rapidamente il flacone, pompare il liquido per riempire completamente il flacone e chiudere il flacone.
- Inserire l'ago da 23 G che è stato portato nel sito nel tappo di gomma del flacone per alleviare la pressione nel flacone. Estrarre l'ago.
- Mantenere il campione al fresco. Conservare in frigorifero il flacone di raccolta a 4 °C al momento del ritorno in laboratorio.
3. Crescita in vitro di microrganismi anaerobi acquisiti in campo
- Crescita per bottiglia di coltura
- Disporre un flacone sterile di N2 con tappo e i flaconi di coltura e il flacone di raccolta preparati come sopra. Far gocciolare il 100% di etanolo sui tappi e dar loro fuoco usando un accendino.
- Montare un ago da 23 G su una siringa da 1 ml. Una volta che i tappi non sono più in fiamme, inserire l'ago nel flacone di N2 e prelevare ~ 1 ml di N2. Estrarre l'ago.
- Premere lentamente lo stantuffo per rilasciare l'N2. Non appena la siringa è vuota, inserire l'ago nel flacone di raccolta e prelevare 0,5 mL del campione ambientale. Estrarre l'ago.
- Inserire l'ago nel flacone di coltura e iniettare il campione. Estrarre l'ago.
- Agitare il flacone e metterlo in un'incubatrice a temperatura, come indicato dalla Tabella 1 o dall'ambiente di interesse del lettore.
NOTA: L'avanzamento della coltura (bottiglia o bioreattore) viene monitorato utilizzando un emocitometro Petroff-Hauser profondo 0,02 mm. Gli arricchimenti di microrganismi anaerobici o fastidiosi in genere non raggiungono densità cellulari in cui OD600 è utilizzabile e altri metodi di rilevamento sono impraticabili per il monitoraggio di routine e ripetitivo. I limiti di rilevamento, il controllo della qualità e i calcoli statistici dipendono dal tipo di camera di conteggio delle cellule e dalle esigenze dell'utente.
- Crescita per bioreattore
- Preparazione di un palloncino con una siringa modificata
- Rimuovere lo stantuffo da tre siringhe luer lock da 10 mL (una per ogni gruppo finale). Tagliare la flangia da ciascuna siringa e limare l'estremità recisa in modo che non perfori i palloncini. Pulire tutti i trucioli limati dalla siringa modificata.
- Prepara un palloncino raddoppiato posizionando un palloncino all'interno di un altro.
- Allungare l'estremità del palloncino raddoppiato sulla siringa da 10 ml modificata.
- Separare leggermente l'estremità del palloncino esterno da quello interno. Spremi tutta l'aria intrappolata tra i palloncini.
- Stringere una fascetta attorno alla base dei palloncini per fissarli alla siringa.
- Preparazione di un tappo modificato
- Rimuovere gli stantuffi da dieci siringhe luer lock da 1 mL (due per ogni tappo da modificare). Tagliare la flangia dalle siringhe.
- Disporre due tappi di gomma misura #10 (per damigiane da 8 L) e tre dimensioni per bottiglie con finitura filettata GL45 (per bottiglie di raccolta). Utilizzando una punta da trapano da 1/4" (6.4 mm), praticare due fori attraverso la parte superiore di ciascun tappo di gomma abbastanza larghi da consentire l'inserimento delle siringhe modificate e abbastanza stretti da consentire l'adattamento ermetico.
- Inserire le siringhe modificate attraverso i fori del tappo di gomma.
- Pulire e sterilizzare in autoclave il tappo modificato a 121 °C per 30 min.
- Preparazione del gruppo bioreattore
- Disinfettare con etanolo al 70% tutti i rubinetti, i connettori dell'adattatore luer lock femmina e altri materiali per bioreattori non autoclavabili e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 30 minuti tutti i tubi (dopo aver tagliato a misura), i tappi, la lana di vetro e altri materiali del bioreattore autoclavabili.
- Posizionare un bioreattore sterile (Figura 1 e Figura 2) su un supporto ad anello e fissarlo con una cinghia a catena. Disporre anche un bagnomaria, una pompa peristaltica, la damigiana da 8 L con tappo contenente terreno (dal punto 1.2 del protocollo), un flacone da 3,5 L (flacone di raccolta non di campionamento) e un flacone da 500 ml (flacone di raccolta di campionamento).
- Tappo della damigiana
- Prepara un palloncino con una siringa modificata. Collegare un rubinetto a tre vie alla punta luer lock della siringa.
- Prendere il gruppo palloncino e collegare il rubinetto a tre vie al tubo di un serbatoio di N2. Ruotare il rubinetto a tre vie per bloccare l'estremità aperta all'atmosfera.
- Aprire il serbatoio del gas e riempire il palloncino con N2. Una volta pieno, ruotare il rubinetto a tre vie per bloccare l'estremità del palloncino. Chiudere il serbatoio del gas e scollegare il tubo del serbatoio dal rubinetto a tre vie.
- Collegare quanto segue in sequenza: un rubinetto a tre vie (del palloncino con la siringa modificata), un rubinetto a due vie, un accoppiatore adattatore luer lock femmina e la punta luer lock di una delle siringhe del tappo modificato.
- Alla punta luer lock dell'altra siringa, collegare un rubinetto a due vie. Chiudere entrambe le valvole dei rubinetti a due vie sul gruppo tappo modificato.
- Srotolare il filo che tiene il tappo della misura #10 non modificata della damigiana. Sostituire rapidamente il fermo non modificato con il gruppo tappo modificato e attorcigliare il filo come prima per fissare il gruppo tappo modificato alla damigiana.
NOTA: Se fiducioso e preparato, il gruppo tappo modificato può essere utilizzato per tappare la damigiana nella fase finale della preparazione del mezzo (passaggio 1.2.2.7). - Ruotare il rubinetto a tre vie per bloccare l'estremità aperta all'atmosfera. Aprire il rubinetto a due vie in sequenza. Il gas del pallone e lo spazio di testa della damigiana da 8 L sono ora collegati.
- Tappatura delle bottiglie di raccolta non campionate e campionate
- Tappare il flacone da 3,5 L senza campionamento con un tappo modificato per bottiglie con finitura filettata GL45, applicando etanolo al 70% alla base del tappo per facilitarne l'inserimento nel flacone. Tappate la bottiglia con un tappo a vite aperto GL45.
- Collegare quanto segue in sequenza: un palloncino con la punta luer lock della siringa modificata, un rubinetto di arresto a tre vie, un accoppiatore adattatore luer lock femmina e la punta luer lock di una delle siringhe del tappo modificato. Ruotare il rubinetto a tre vie per bloccare l'estremità aperta direttamente all'atmosfera.
- Alla punta luer lock dell'altra siringa, collegare un accoppiatore adattatore luer lock femmina.
- Ripetere i tre passaggi precedenti per il flacone di campionamento da 500 ml.
- Installazione dei tubi
- Misurare la distanza tra le porte della camicia d'acqua del bioreattore e le alette del tubo flessibile del bagno d'acqua. Tagliare due lunghezze di tubi in silicone da 3/16" (4,8 mm) di diametro interno e 3/8" (9,5 mm) di diametro esterno per coprire questa distanza.
- Assemblare due connettori per tubi flessibili diritti con tappi a vite aperti GL14. Fissare ciascuno a un'estremità dei due pezzi di tubo.
- Ruotare i tappi a vite sulle porte della camicia d'acqua del bioreattore. Collegare le altre estremità del tubo alle spine del tubo del bagnomaria in modo che l'acqua fuoriesca dal bagnomaria, entri nella parte inferiore della camicia d'acqua del bioreattore, esca nella parte superiore della camicia d'acqua e torni al bagnomaria. Stringere le fascette attorno alle estremità del tubo per fissare il tubo alle alette del tubo del bagnomaria.
- Per le pompe simili alla minipompa a portata variabile a bassissima portata VWR, infilare il gruppo di tubi scanalati con diametro esterno da 3/16" (4,8 mm) in dotazione attraverso la pompa.
- Misurare la distanza tra il gruppo del tubo della damigiana e il gruppo del tubo della pompa peristaltica. Tagliare una lunghezza di 3/16" (4.8 mm) di diametro interno, 3/8" (9.5 mm) di diametro esterno tubo in silicone per coprire questa distanza.
- Collegare un'estremità del tubo al portatubo del gruppo tubo della damigiana e l'altra al portatubo del gruppo tubo della pompa peristaltica, orientato in modo che il fluido fluisca dalla damigiana e attraverso la pompa peristaltica.
- Misurare la distanza tra il gruppo tubi della pompa peristaltica e la porta inferiore del bioreattore. Tagliare una lunghezza di 3/16" (4.8 mm) di diametro interno, 3/8" (9.5 mm) di diametro esterno tubo in silicone per coprire questa distanza.
- Collegare un'estremità di questo tubo al portatubo del gruppo tubo della pompa peristaltica e fissare con cautela l'altra alla porta inferiore del bioreattore. Facendo attenzione a non rompere il vetro ma anche a fissare la connessione, stringere una fascetta attorno all'estremità del tubo per fissare il tubo alla porta inferiore del bioreattore.
- Misura e taglia una lunghezza di circa 5" (127 mm) di tubi in silicone da 3/16" (4.8 mm) di diametro interno, 3/8" (9.5 mm) di diametro esterno.
- Collegare un connettore adattatore luer lock femmina a un rubinetto a tre vie. Collegare qualsiasi estremità del rubinetto a tre vie al tubo.
- Assemblare un connettore per tubo flessibile angolato con tappo a vite aperto GL14. Attaccalo all'altra estremità del tubo.
- Ruotare il tappo a vite sulla porta verticale più in alto del bioreattore. Ruotare il rubinetto a tre vie per bloccare l'estremità rivolta verso il bioreattore.
- Misurare la distanza tra il gruppo della porta verticale più in alto e il gruppo della bottiglia di raccolta non campionata. Tagliare una lunghezza di 3/16" (4.8 mm) di diametro interno, 3/8" (9.5 mm) di diametro esterno tubo in silicone per coprire questa distanza. Tagliare le flange di due siringhe luer lock da 1 mL e inserirle nelle estremità del tubo.
- Collegare un'estremità di questo gruppo di tubi al rubinetto di arresto a tre vie del gruppo della porta verticale più in alto e collegare l'altra estremità al connettore dell'adattatore luer lock femmina sul gruppo del flacone di raccolta non di campionamento.
- Misurare la distanza tra il gruppo della porta verticale più in alto e il gruppo della bottiglia di raccolta del campionamento. Tagliare una lunghezza di 3/16" (4.8 mm) di diametro interno, 3/8" (9.5 mm) di diametro esterno tubo in silicone per coprire questa distanza. Tagliare le flange di due siringhe luer lock da 1 mL e inserirle nelle estremità del tubo.
- Collegare un'estremità di questo gruppo di tubi al rubinetto di arresto a tre vie del gruppo della porta verticale più in alto e collegare l'altra al connettore dell'adattatore luer lock femmina sul gruppo del flacone di campionamento del prelievo.
- Riempimento del bioreattore
- Tappare una delle porte GL18 del bioreattore con un setto di gomma bianca. Tappare l'altra porta GL18 e le restanti porte GL14 esposte verticalmente con setti in silicone rivestiti in PTFE di dimensioni GL18/GL14 (PTFE rivolti verso il vetro) e tappi a vite aperti.
- Con un'asta lunga 50 cm, inserire 0,9 g di lana di vetro nella base del bioreattore.
- Autoclavare 1,3 L di sabbia a 121 °C per 30 min. Riempi il bioreattore con la sabbia usando un imbuto.
NOTA: Altri tipi di sedimenti informati dall'ambiente del lettore e dai microrganismi di interesse possono essere sostituiti qui. - Posizionare il tubo in un serbatoio di N2 nella parte superiore del bioreattore e sciacquare lo spazio di testa del bioreattore con N2 per 2 minuti. Tappare immediatamente il bioreattore con un tappo di dimensioni #7 e un tappo a vite aperto GL45.
- Dal flacone di raccolta non campionato, scollegare il tubo e ruotare il rubinetto a tre vie per bloccare l'estremità rivolta verso il palloncino. Collegare il tubo a un serbatoio di N2 al connettore dell'adattatore luer lock femmina e sciacquare lo spazio di testa del bioreattore con N2 per 2 minuti. Ricollegare immediatamente il tubo e restituire il rubinetto a tre vie per bloccare l'estremità aperta all'atmosfera.
- Ripetere il passaggio precedente per il flacone di raccolta del campionamento.
- Ruotare il rubinetto di arresto a tre vie della porta verticale più alta del bioreattore per bloccare l'estremità rivolta verso il flacone di raccolta del campionamento. Pompare il liquido dalla damigiana nel bioreattore. Mettere in pausa la pompa e sfiatare il palloncino del flacone di campionamento e riempire il palloncino della damigiana con N2 secondo necessità.
- Una volta che il bioreattore è stato riempito con il fluido, impostare la portata della pompa a 0,6 mL/min (valore digitale di 40 sulla Mini-Pump).
NOTA: Altre portate desiderate dal lettore possono essere sostituite qui. - Impostare la temperatura del bagnomaria, come indicato dalla Tabella 1 o dall'ambiente di interesse del lettore.
NOTA: L'inoculo può essere aggiunto a questo punto o in un secondo momento, a seconda delle specifiche dello studio. Se si effettua l'inoculazione a questo punto, procedere al punto 3.2.4.10. Se si effettua l'inoculazione in un secondo momento, procedere al punto 3.2.5. - Disporre un flacone di raccolta o un flacone di coltura inoculata e un flacone sterile di N2 con tappo. Far gocciolare il 100% di etanolo sui tappi e dar loro fuoco usando un accendino.
- Montare un ago da 23 G su una siringa da 60 ml. Una volta che i tappi non sono più in fiamme, inserire l'ago nel flacone di N2 e prelevare ~50 ml di N2. Estrarre l'ago.
- Premere lentamente lo stantuffo per rilasciare l'N2. Non appena la siringa è vuota, inserire l'ago nel flacone di raccolta e prelevare 50 mL del campione ambientale. Estrarre l'ago.
- Sostituire l'ago da 23 G con un ago sterile di metallo lungo (cannula, lunghezza 31,5 cm). Inserire il lungo ago metallico attraverso il setto di gomma bianca sulla porta GL18 del bioreattore.
- Spingere l'ago nel sedimento e iniettare l'inoculo. Estrarre l'ago.
- Manutenzione del bioreattore in esecuzione
- Ogni giorno in cui il bioreattore è in funzione, eseguire le seguenti operazioni:
- Controllare il livello del bagnomaria. Se basso, aggiungere più acqua (utilizzare acqua distillata per la longevità dell'apparecchiatura riducendo la corrosione e l'accumulo di minerali).
- Controllare il palloncino del flacone di raccolta non campionato; Un palloncino pieno inibirà il flusso del mezzo. Quando è pieno, ruotare il rubinetto a tre vie per bloccare l'estremità rivolta verso la bottiglia di raccolta. Schiaccia il palloncino per svuotarlo; quindi, restituire il rubinetto a tre vie per bloccare l'estremità aperta all'atmosfera; Ripetere l'operazione fino a quando il numero di riferimento non è vuoto.
- Controllare il palloncino della damigiana da 8 L. Se basso, chiudere il rubinetto a due vie in sequenza e scollegare il rubinetto a tre vie dal rubinetto a due vie. Riempire e riattaccare il gruppo della bollatura seguendo i passaggi 3.2.3.3.2, 3.2.3.3.3 e 3.2.3.3.7.
- Controllare il livello del mezzo nella damigiana da 8 L. Se basso, assemblare un'altra damigiana da 8 L e preparare altro mezzo seguendo i passaggi del protocollo 1.2. e 3.2.3.3. Mettere in pausa la pompa, chiudere la valvola a sfera del portagomma, scollegare rapidamente la vecchia damigiana e collegare la nuova damigiana.
NOTA: Per una portata di 0.6 mL/min, sarà necessario un nuovo mezzo ogni 9 giorni. - Controllare il livello del mezzo nel flacone di raccolta non campionato. Se pieno, montare un altro flacone di raccolta non campionabile conformemente al punto 3.2.3.4.1. Sciacquare il nuovo flacone con N2, scollegare rapidamente il palloncino con la siringa modificata e il tubo dal vecchio flacone e collegarlo al nuovo flacone.
- Rimuovere il tappo modificato da un flacone di raccolta pieno non campionato. Autoclavare il liquido a 121 °C per 30 min; Quindi, smaltire il liquido secondo le politiche istituzionali del lettore. Pulire e sterilizzare in autoclave tutti i pezzi del gruppo flacone di raccolta non campionante per prepararli per l'uso successivo.
- Eseguire il campionamento ogni 7 giorni (o il numero di giorni desiderato dal lettore) procedendo come segue:
- Ruotare il rubinetto di arresto a tre vie della porta verticale più alta del bioreattore per bloccare l'estremità rivolta verso il flacone di raccolta non di campionamento. Raccogliere 250 ml di liquido.
NOTA: Per una portata di 0,6 mL/min, la raccolta di 250 mL richiederà ~7 ore. - Restituire il rubinetto a tre vie della porta verticale più alta del bioreattore per bloccare l'estremità rivolta verso il flacone di raccolta del campionamento. Scollegare il tubo e il flacone di campionamento dal rubinetto di arresto a tre vie della porta verticale più alta del bioreattore.
- Dopo il test, la conservazione e/o il corretto smaltimento del liquido di campionamento, pulire tutti i pezzi del gruppo del flacone di raccolta del campionamento, ad eccezione del palloncino, con la siringa modificata. Autoclavare tutti i pezzi a 121 °C per 30 minuti tranne il palloncino con la siringa modificata e i connettori dell'adattatore luer lock femmina. Rimontare per il giorno di campionamento successivo.
NOTA: Si consiglia vivamente di avere una ridondanza duplicata o triplicata di parti, tappi, tubi e setti per una rapida riparazione e sostituzione, se necessario.
- Ruotare il rubinetto di arresto a tre vie della porta verticale più alta del bioreattore per bloccare l'estremità rivolta verso il flacone di raccolta non di campionamento. Raccogliere 250 ml di liquido.
- Ogni giorno in cui il bioreattore è in funzione, eseguire le seguenti operazioni:
- Preparazione di un palloncino con una siringa modificata
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Qui mostriamo i risultati di uno studio su un bioreattore utilizzando un metodo di preparazione del terreno di coltura misto in foro e un metodo di configurazione del bioreattore come descritto di seguito. Il terreno di coltura misto del pozzo è stato modificato per contenere come fonte di carbonio un liquame di pannocchie di mais processate mediante dissoluzione idrotermale ossidativa (OHD)13,14. Il terreno di coltura misto modificato è stato pompato nel bioreat...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
La sezione di produzione media di questo protocollo (sezione 1) deve la sua struttura alla tecnica Hungate modificata di Miller e Wolin17, che è stata ampiamente utilizzata sin dalla sua pubblicazione. La praticità di questo protocollo ampliato deriva dalla sua natura descrittiva e dall'abbinamento con l'acquisizione in situ di microrganismi. I flaconi di coltura contenenti terreni informati e simulati dal punto di vista ambientale sono stati utilizzati per coltivare con successo i seguen...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Gli autori vorrebbero riconoscere il lignaggio di informazioni e tutoraggio che ha influenzato/evoluto queste tecniche nel corso degli anni. Il Dr. Hamilton-Brehm come ex studente laureato, postdoc e attuale professore ha un debito di gratitudine nei confronti di coloro che si sono presi il tempo di insegnare le tecniche anaerobiche: il Dr. Mike Adams, il Dr. Gerti Schut, il Dr. Jim Elkins, il Dr. Mircea Podar, il Dr. Duane Moser e il Dr. Brian Hedlund. The Nature Conservancy e American Rivers hanno sostenuto questo lavoro attraverso le sovvenzioni G21-026-CON-P e AR-CE21GOS373, rispettivamente. Tutte le opinioni, i risultati, le conclusioni o le raccomandazioni espresse in questo documento sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni di Nature Conservancy o American Rivers. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione dell'Istituto Avanzato per l'Energia della SIU, che riconosce con gratitudine i finanziamenti assegnati attraverso l'Advanced Energy Resource Board. NGS è stato eseguito da LC Sciences.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| General Materials | |||
| Flacone di borosillicato da 1 L | Fisher Scientific | ||
| da 1 ml con punta scorrevole | Pipetta in vetro Fisher Scientific | ||
| Flacone per coltura da 100 mL | Fisher Scientifc | ||
| Crimpatrice manuale da 20 mm | Fisher Scientifc | ||
| Ago da 23 G | Fisher Scientifc | ||
| Flacone in borosilicato da 500 mL | Fisher Scientific | ||
| Sigillo in alluminio | Scientifc | ||
| Cannula, lunghezza 31,5 cm | Fisher Scientific | ||
| , lunghezza 6 cm | Fisher Scientifc | ||
| Corer | Giddings Machine Company | Assemblato da parti dell'azienda | |
| Collettore del gas | Swagelok | Assemblato da molte parti diverse | |
| Accendino | Lowe's | ||
| N2 gas | Airgas | ||
| Guanti in nitrile | Fisher Scientific | ||
| Tappo in gomma (per bombole GL45) | Glasgeratebau OCHS | ||
| Tappo in gomma (per bottiglie di coltura) | Ace Glass | ||
| Piastra riscaldante per agitazione | Corning | ||
| Oligoelementi | ATCC | ||
| Vitamine | ATCC | ||
| strong>Materiali specifici per bioreattore | |||
| #10 Tappo in gomma | Ace Glass | ||
| Tappo in gomma #7 | Siringa Fisher Scientifc | ||
| da 1 ml con punta luer lock | Fisher Scientifc | ||
| Valvola a sfera con portagomma da 1/4" | Siringa Amazon | ||
| da 10 ml con punta luer lock | Fisher Scientifc | ||
| Flacone in borosilicato da 3,5 L | Scientific Adattatore | ||
| portagomma da 5/16" - 1/4" raccordo | Amazon | ||
| 60 mL siringa con punta luer lock | Fisher Scientifc | ||
| 8 L borosillicate damigiana | Allen Glass | ||
| Connettore per tubo angolato per tappo aperto GL14 | Ace Glass | 7623-20 | |
| Balloon | Party City | ||
| Borosillicate bioreattore | Allen Scientific Glass | Su misura su richiesta | |
| Drill | Lowe's | ||
| Femmina luer lock adattatore accoppiatore | Amazon | ||
| GL14 tappo superiore aperto | Ace Glass | 7621-04 | |
| GL18 tappo superiore aperto | Ace Glass | 7621-08 | |
| GL45 tappo superiore aperto | Ace Glass | ||
| PTFE affrontato setto in silicone per tappo superiore aperto GL14 | Ace Vetro | 7625-06 | |
| PTFE affrontato silicone setto per GL18 tappo superiore aperto | Ace Glass | 7625-07 | |
| Ring stand | Scientific | ||
| Ring stand morsetto catena | Amazon | ||
| Ring stand morsetto | Scientific | ||
| Tubo in silicone; 1/4 "id, 1/2" od | Grainger | 55YG13 | |
| Tubo in silicone; 3/16" id, 3/8" od | Grainger | ||
| Connettore per tubo flessibile dritto per tappo superiore aperto GL14 | Ace Glass | 7623-22 | |
| Rubinetto a tre vie | Amazon | ||
| Rubinetto a due vie | Amazon | ||
| Minipompa a flusso variabile a flusso ultra basso | VWR | ||
| Bagnomaria | Fisher Scientifc | ||
| Setto in gomma bianca per tubi diametro esterno 13-18 mm | Ace Glass | 9096-49 | |
| Wire | Lowe's | ||
| Fascetta | Lowe's |
Riferimenti
- Staley, J. T., Konopka, A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).
- Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L. Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes. MSystems. 3 (5), e00055(2018).
- Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
- Marcy, Y., et al. Dissecting biological "dark matter" with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated tm7 microbes from the human mouth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (29), 11889-11894 (2007).
- Giovannoni, S., Stingl, U. The importance of culturing bacterioplankton in the'omics' age. Nat. Rev. Microbiol. 5 (10), 820-826 (2007).
- Stewart, E. J. Growing unculturable bacteria. J. Bacteriol. 194 (16), 4151-4160 (2012).
- Dedysh, S. N. Cultivating uncultured bacteria from northern wetlands: Knowledge gained and remaining gaps. Front. Microbiol. 2, 184(2011).
- Kaeberlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. Isolating" uncultivable" microorganisms in pure culture in a simulated natural environment. Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).
- Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), e00012(2011).
- Tyson, G. W., et al. Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community. Appl. Environ. Microbiol. 71 (10), 6319-6324 (2005).
- Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43 (2), 260-296 (1979).
- Merino, N., et al. Subsurface microbial communities as a tool for characterizing regional-scale groundwater flow. Sci. Total Environ. 842, 156768(2022).
- Anderson, K. B., Creeping, J. C., Huggett, W. W. Process for the dissolution of coal, biomass and other organic solids in superheated water. U.S. patent 8,563,791. , Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf (2013).
- Anderson, K. B., Crelling, J. C., Huggett, W. W., Perry, D. M. Production of organic materials using oxidative hydrothermal dissolution. U.S. patent 10,023,512. , Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf (2018).
- Mullin, S. W., et al. Patterns of in situ mineral colonization by microorganisms in a~ 60 c deep continental subsurface aquifer. Front. Microbiol. 11, 536535(2020).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the miseq illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Miller, T. L., Wolin, M. A serum bottle modification of the hungate technique for cultivating obligate anaerobes. Appl Microbiol. 27 (5), 985-987 (1974).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermoanaerosceptrum fracticalcis gen. nov. sp. nov., a novel fumarate-fermenting microorganism from a deep fractured carbonate aquifer of the us great basin. Front. Microbiol. 10, 2224(2019).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Caldicellulosiruptor obsidiansis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1014-1020 (2010).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).
- Twigg, R. S. Oxidation-reduction aspects of resazurin. Nature. 155 (3935), 401-402 (1945).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
