Gli organoidi rivoluzionano la modellazione tissutale personalizzata per lo sviluppo di organi, la scoperta di farmaci e la ricerca sulle malattie. L'ingegneria degli organoidi avanza nella creazione di tessuti sintetici intricati. L'obiettivo è quello di integrare la morfogenesi, la tecnologia assembloide e le biomatrici per far progredire l'ingegneria tissutale. Questo protocollo aiuta a modellare l'organogenesi epatica e a stabilire linee guida per la costruzione di tessuti sintetici.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Tecniche di coltivazione in vitro per la modellazione dell'organogenesi epatica, la costruzione di assembloidi e la progettazione di tessuti sintetici utilizzando linee cellulari umane
In questo articolo
Sommario
Abstract
La malattia epatica cronica ha raggiunto proporzioni epidemiche, colpendo oltre 800 milioni di persone in tutto il mondo. Il trattamento attuale, il trapianto ortotopico di fegato, ha diverse limitazioni. Nel campo della medicina rigenerativa del fegato sono emerse soluzioni promettenti, con l'organogenesi epatica che ha un potenziale significativo. L'organogenesi epatica precoce, che si verifica tra E8.5 e 11.5, comporta la formazione di interazioni epiteliali-mesenchimali che portano alla morfogenesi, alla formazione del cordone epatico e alla migrazione collettiva. Tuttavia, mancano metodi per la modellazione in vitro di questo processo. In questo studio, viene presentata una serie dettagliata di metodi, che consentono la modellazione di vari stadi e aspetti dell'organogenesi epatica con linee cellulari umane. In una serie di metodi, viene utilizzata la tecnologia assembloide con sferoidi epatici (HEP) e mesenchimali (MES), replicando le strutture precoci presenti nell'organogenesi epatica, modellando la morfogenesi precoce e dimostrando la migrazione cellulare interstiziale come osservato in vivo. Questi innovativi sistemi assembloidi aiutano a identificare i fattori che influenzano la formazione e la migrazione degli assembloidi. I sistemi di coltivazione di sferoidi HEP sono stati impiegati anche per modellare la migrazione collettiva e la morfogenesi ramificata. I terreni mesenchimalici condizionati (M-CM) svolgono un ruolo significativo nell'avvio della migrazione ramificata dose-dipendente. Tutti i metodi presentati hanno dimostrato di essere altamente riproducibili con un alto tasso di successo. Collegando questi eventi insieme, il nostro lavoro consentirà di ricreare eventi morfogenetici sequenziali per decodificare l'organogenesi in vitro e in vivo.
Introduzione
La migrazione delle cellule epatiche svolge un ruolo significativo nell'organogenesi epatica, nella malattia e nella terapia cellulare. Durante l'organogenesi epatica (E8.5-9.0, topo), l'epitelio pre-epatico dell'intestino anteriore ventrale inizia ad esprimere geni epatici a causa di segnali induttivi provenienti dal mesenchima circostante e dal cuore. A E9.0, l'epitelio dell'intestino anteriore si ispessisce quando le cellule passano da una morfologia cuboidale a una colonnare pseudostratificata, formando il diverticolo epatico1,2. In questa fase critica, il diverticolo epatico è composto da solo ~ 1.500 cel....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella Tabella dei Materiali. Le abbreviazioni utilizzate in questo articolo sono definite nel File supplementare 1.
1. Preparazione di una soluzione di agarosio a bassa elettroendosmosi (EEO) all'1%
- Pesare 2,5 g di polvere di agarosio a basso contenuto di EEO e trasferirla in un bicchiere.
NOTA: Assicurarsi che il becher sia almeno il doppio del volume desiderato per consentire la formazione di bolle durante la preparazione della soluzione. - Utilizzare un cilindro graduato per misu....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
L'interesse per tessuti sintetici in una vasta gamma di applicazioni biomediche, come la modellizzazione delle malattie, la scoperta di farmaci e l'ingegneria tissutale (Figura 7), è in costante aumento. All'interno di questo settore, gli organoidi, gli sferoidi e le cellule derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) stanno venendo trasformati in tessuti sintetici più complessi e di maggiori dimensioni. Questa trasformazione implica l'applicazione dei principi della morfogenesi,.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il presente protocollo comprende diversi metodi per la coltivazione di assembloidi semplici e complessi, nonché tecniche per indurre la migrazione cellulare collettiva 3D nell'organogenesi epatica precoce24,25. I protocolli delineati evidenziano diversi passaggi critici, con la formazione di sferoidi che è un aspetto centrale in tutte le metodologie. I micropozzetti (96 o 384 pozzetti) sono utilizzati con piastre non aderenti o rivestite di agarosio per ottenere .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
NP è il fondatore di Khufu Therapeutics, un'azienda di ingegneria degli organoidi che sviluppa trattamenti per le malattie epatiche acute e croniche.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano esprimere sincera gratitudine a Ogechi Ogoke e Osama Yousef per i loro inestimabili contributi ai dati utilizzati in questo articolo. NP è stato supportato dai fondi di avvio UB CBE, da una Mark Diamond Fellowship, dal New York State Stem Cell Science C024316, dal centro UB Stem Cells in Regenerative Medicine (ScIRM), dal Center for Cell, Gene, Tissue Engineering (CGTE) dell'Università di Buffalo.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 384 pozzetti Nero/Trasparente Fondo rotondo Attacco ultra-basso Micropiastra sferoidale | Corning | 3830 | |
| 96-wl Piastra per colture cellulari Piatta, TC, STRL, 1/pk, 100/CS | Prodotti da laboratorio Vendite | 701001 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A0576 | a basso EEO |
| ZEISS | versione 4 | ||
| Piatto per colture cellulari, 60mm, TC, STRL, 20/pk, 500/CS | Vendita di prodotti da laboratorio | 705001 | |
| Pallone per colture cellulari, 175 cm², Sfiato,TC,STRL,5/pk,40/CS | Vendita di prodotti da laboratorio | 709003 | |
| Pallone per colture cellulari,75 cm², Sfiato,TC,STRL,5/pk,100/CS | Vendita di prodotti | da laboratorio 708003 | |
| Provette per centrifuga, 15mL,PP,STRL,grad,50/bg,500/CS | Vendita di prodotti da laboratorio | L226010 | |
| Collagene I, coda di ratto, 100 mg | Corning | 354236 | |
| DMEM, glucosio alto, integratore GlutaMAX, piruvato | ThermoFisher Scientific | 10569010 | |
| EVOS Microscopio fluorescente, a contrasto di fase | EVOS | AMEFC4300R | 1.360 x 1.024 densità di pixel |
| Siero fetale bovino, qualificato, Stati Uniti | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fibrinogeno dal plasma umano | Sigma-Aldrich | F4883-500MG | 500 mg |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HERAcell vios 160i | ThermoFisher Scientific | 51033557 | |
| HFF-1 | ATCC | SCRC-1041 | |
| ImageJ | IJ1.46r; https://imagej.net/ij/ | ||
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Membrana basale Matrice, senza LDEV, 10 mL | Corning | 354230 | |
| MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
| MSCGMT Crescita di cellule staminali mesenchimali umane BulletKit | Lonza | PT-3001 | |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Trombina da plasma umano | Sigma-Aldrich | T6884-100UN | 100 unità |
| Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo | ThermoFisher Scientific | 25300062 | |
| Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo | ThermoFisher Scientific | 25200072 | |
| Vybrant DiD Soluzione per la marcatura cellulare | ThermoFisher Scientific | V22887 | |
| Vybrant DiI Soluzione per la marcatura cellulare | ThermoFisher Scientific | V22885 | |
| Vybrant DiO Marcatura cellulare Soluzione | ThermoFisher Scientific | V22886 | |
| Microscopio a fluorescenza Zeiss Axio | ZEISS | SE64, 1.344 & moltiplicato per 1.024 pixel di densità |
Riferimenti
- Bort, R., Signore, M., Tremblay, K., Martinez Barbera, J. P., Zaret, K. S. Hex homeobox gene controls the transition of the endoderm to a pseudostratified, cell emergent epithelium for liver bud development. Dev Biol. 290 (1), 44-56 (2006).
- Gualdi, R., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
