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Articolo metodologico

Tecniche di coltivazione in vitro per la modellazione dell'organogenesi epatica, la costruzione di assembloidi e la progettazione di tessuti sintetici utilizzando linee cellulari umane

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DOI:

10.3791/66229

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18 aprile 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University at Buffalo (State University of New York), 2Clinical and Translation Research Center (CTRC), University at Buffalo (State University of New York), 3Department of Chemical and Biological Engineering, University at Buffalo (State University of New York), 4Center for Cell, Gene and Tissue Engineering, University at Buffalo, State University of New York, 5Khufu Therapeutics, Inc.

In questo articolo

Sommario

Gli organoidi rivoluzionano la modellazione tissutale personalizzata per lo sviluppo di organi, la scoperta di farmaci e la ricerca sulle malattie. L'ingegneria degli organoidi avanza nella creazione di tessuti sintetici intricati. L'obiettivo è quello di integrare la morfogenesi, la tecnologia assembloide e le biomatrici per far progredire l'ingegneria tissutale. Questo protocollo aiuta a modellare l'organogenesi epatica e a stabilire linee guida per la costruzione di tessuti sintetici.

Abstract

La malattia epatica cronica ha raggiunto proporzioni epidemiche, colpendo oltre 800 milioni di persone in tutto il mondo. Il trattamento attuale, il trapianto ortotopico di fegato, ha diverse limitazioni. Nel campo della medicina rigenerativa del fegato sono emerse soluzioni promettenti, con l'organogenesi epatica che ha un potenziale significativo. L'organogenesi epatica precoce, che si verifica tra E8.5 e 11.5, comporta la formazione di interazioni epiteliali-mesenchimali che portano alla morfogenesi, alla formazione del cordone epatico e alla migrazione collettiva. Tuttavia, mancano metodi per la modellazione in vitro di questo processo. In questo studio, viene presentata una serie dettagliata di metodi, che consentono la modellazione di vari stadi e aspetti dell'organogenesi epatica con linee cellulari umane. In una serie di metodi, viene utilizzata la tecnologia assembloide con sferoidi epatici (HEP) e mesenchimali (MES), replicando le strutture precoci presenti nell'organogenesi epatica, modellando la morfogenesi precoce e dimostrando la migrazione cellulare interstiziale come osservato in vivo. Questi innovativi sistemi assembloidi aiutano a identificare i fattori che influenzano la formazione e la migrazione degli assembloidi. I sistemi di coltivazione di sferoidi HEP sono stati impiegati anche per modellare la migrazione collettiva e la morfogenesi ramificata. I terreni mesenchimalici condizionati (M-CM) svolgono un ruolo significativo nell'avvio della migrazione ramificata dose-dipendente. Tutti i metodi presentati hanno dimostrato di essere altamente riproducibili con un alto tasso di successo. Collegando questi eventi insieme, il nostro lavoro consentirà di ricreare eventi morfogenetici sequenziali per decodificare l'organogenesi in vitro e in vivo.

Introduzione

La migrazione delle cellule epatiche svolge un ruolo significativo nell'organogenesi epatica, nella malattia e nella terapia cellulare. Durante l'organogenesi epatica (E8.5-9.0, topo), l'epitelio pre-epatico dell'intestino anteriore ventrale inizia ad esprimere geni epatici a causa di segnali induttivi provenienti dal mesenchima circostante e dal cuore. A E9.0, l'epitelio dell'intestino anteriore si ispessisce quando le cellule passano da una morfologia cuboidale a una colonnare pseudostratificata, formando il diverticolo epatico1,2. In questa fase critica, il diverticolo epatico è composto da solo ~ 1.500 cellule. Successivamente, l'endoderma epatico che riveste il diverticolo epatico si ispessisce, si delamina e forma cordoni di epatoblasti migratori (HB). Questi HB co-migrano con le cellule endoteliali e le cellule mesenchimali, ramificandosi nel tessuto mesenchimale circostante, avviando la migrazione cellulare collettiva tridimensionale per formare la 3,4. Infatti, durante questa fase, le cellule subiscono collettivamente (1) co-migrazione, o movimento insieme ad altri tipi di cellule, (2) morfogenesi ramificata o formazione di strutture tubolari ramificate e (3) migrazione interstiziale, o migrazione sopra o tra altre cellule. Con E11.5, la migrazione cessa e si è formato il fegato primitivo, espandendosi di 103 volte3. La migrazione delle cellule epatiche può essere necessaria anche nelle fasi successive dell'organogenesi epatica, poiché l'espressione di HBs fetali di ratto ha mostrato prove di geni altamente sovraregolati associati alla migrazione cellulare collettiva 3D, alla morfogenesi e al rimodellamento della matrice extracellulare5. Oltre al suo ruolo nell'organogenesi epatica precoce, la migrazione collettiva 3D è strettamente legata alla diffusione locale e alle metastasi del carcinoma epatocellulare avanzato (HCC), portando infine a un peggioramento della prognosi e a un aumento della resistenza al trattamento6. Gli epatociti adulti e fetali impiegano anche la migrazione collettiva quando si spostano dalla milza all'interno del fegato durante il ripopolamento epatico. Studi di imaging in vivo hanno dimostrato che gli epatociti trapiantati entrano nella vena porta e poi nei capillari entro poche ore, migrando attraverso i sinusoidi epatici e attraverso il tessuto epatico7,8,9. Infine, studi recenti dimostrano che la migrazione degli HB si verifica durante la rigenerazione del fegato murino e umano, con alcune prove di movimento in sheets10. Nel complesso, la migrazione collettiva del fegato, capace di molteplici modalità di morfogenesi, svolge un ruolo significativo nell'organogenesi, nel cancro, nella terapia cellulare con epatociti e nella rigenerazione epatica.

Numerosi studi genetici hanno esplorato i percorsi molecolari alla base della migrazione collettiva delle cellule epatiche 3D. Questi studi rivelano che l'assenza di cordoni epatici ostacola la formazione del fegato, sottolineando la necessità della formazione del cordone epatico e delle loro interazioni con le cellule di supporto per la formazione del fegato1,11,12,13. Questi studi dimostrano anche che la crescita del fegato è avviata da vari fattori, tra cui l'FGF-2 secreto dal mesoderma cardiaco, il BMP4 secreto dal mesenchima circostante, l'HGF e le interazioni delle cellule endoteliali. Inoltre, i fattori di trascrizione associati alla migrazione, tra cui HEX, PROX1 e TBX3, svolgono un ruolo cruciale2,14. In conclusione, gli studi genetici forniscono la prova che la segnalazione del fattore solubile, che porta all'espressione del fattore di trascrizione, guida la migrazione, la segnalazione e le interazioni molecolari tra gli HB e il mesenchima circostante.

Sebbene la migrazione cellulare nell'organogenesi epatica precoce sia stata ampiamente studiata, gli attuali studi in vitro sulla migrazione epatica utilizzano spesso saggi 2D che utilizzano cellule HCC altamente migratorie insieme a modelli tumorali in vivo15. Questi studi hanno fornito informazioni su diversi fattori che influenzano la migrazione epatica, tra cui TGFβ-116, c-Myc17, YAP18, goosecoid19, actopaxin20 e miRNAs21,22,23. Sebbene siano stati compiuti notevoli progressi nella comprensione dei meccanismi molecolari nella migrazione delle cellule epatiche 3D, le distinte disparità tra la migrazione cellulare 2D e 3D suggeriscono che i saggi 2D possiedono limitazioni intrinseche. Inoltre, questi modelli spesso mancano dell'inclusione di tipi di cellule mesenchimali, che sono essenziali sia per la migrazione che per la crescita. Sebbene ci siano stati progressi nello sviluppo di modelli 3D per la migrazione del fegato che integrano il mesenchima di supporto, questi modelli enfatizzano principalmente la co-migrazione piuttosto che esplorare le diverse modalità di migrazione collettiva.

La capacità di generare tessuti da sferoidi attraverso vari processi di autoassemblaggio e morfogenetici facilita l'esplorazione scientifica dei tessuti sintetici. Questi tessuti hanno ampie applicazioni nello sviluppo e nello screening di farmaci, nella modellazione delle malattie, nella terapia e in altre applicazioni biomediche e biotecnologiche. Vengono forniti i dettagli metodologici di diversi sistemi di coltivazione 3D in vitro progettati per mostrare diverse modalità di migrazione collettiva 3D del fegato. Questi sistemi comprendono (1) coltura di co-sferoidi con sferoidi HEP e MES in una matrice, (2) goccioline di matrice sferoidale HEP coltivate con M-CM, (3) sferoidi misti HEP-MES e (4) matrice sferoidale HEP coltivata con un'alta densità di cellule MES. Questi sistemi consentono una solida modellazione della migrazione collettiva del fegato in un ambiente 3D, migliorando così la nostra comprensione dei processi molecolari e cellulari alla base dell'organogenesi epatica, del cancro e della terapia.

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Protocollo

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella Tabella dei Materiali. Le abbreviazioni utilizzate in questo articolo sono definite nel File supplementare 1.

1. Preparazione di una soluzione di agarosio a bassa elettroendosmosi (EEO) all'1%

  1. Pesare 2,5 g di polvere di agarosio a basso contenuto di EEO e trasferirla in un bicchiere.
    NOTA: Assicurarsi che il becher sia almeno il doppio del volume desiderato per consentire la formazione di bolle durante la preparazione della soluzione.
  2. Utilizzare un cilindro graduato per misurare 250 ml di acqua distillata e versarla nel becher, puntando a una concentrazione finale (p/v) dell'1%.
  3. Coprire l'apertura del becher con pellicola trasparente, lasciando un piccolo foro per la ventilazione. Scaldare il bicchiere nel microonde per 30 s.
  4. Rimuovere con cautela il becher e agitare il contenuto. Ripetere questo processo ogni 30 s fino alla completa dissoluzione.
    ATTENZIONE: Maneggiare con cura la vetreria per microonde, utilizzando guanti adeguati. Monitorare attentamente la soluzione per evitare il surriscaldamento o l'ebollizione.
  5. Una volta ottenuta una soluzione omogenea, rimuovere il becher dal microonde. Agitare delicatamente la soluzione prima di trasferirla in un flacone pre-sterilizzato. Sterilizzare la soluzione in autoclave e conservare la soluzione di agarosio a temperatura ambiente (RT) fino al momento dell'uso.

2. Rivestimento piastra a 96 pozzetti

NOTA: in questi e in altri esperimenti possono essere utilizzate micropiastre di sferoidi a 384 pozzetti.

  1. Allentare il tappo del flacone contenente la soluzione sterile di agarosio all'1%. Riscaldare la soluzione nel microonde a intervalli di 30 s fino a quando non passa alla fase liquida; Quindi stringere il tappo.
    ATTENZIONE: Maneggiare con cura la vetreria per microonde, utilizzando guanti adeguati. Monitorare attentamente la soluzione per evitare il surriscaldamento o l'ebollizione.
    NOTA: Eseguire questi passaggi sotto una cappa a flusso laminare sterile per colture tissutali.
  2. Trasferire 55-65 μl della soluzione di agarosio all'1% per pozzetto per rivestire la piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti e ruotare immediatamente la piastra.
  3. Una volta che la soluzione di agarosio all'1% è stata trasferita nel numero di pozzetti desiderato, porre le piastre in frigorifero a 4 °C per 20-30 minuti per consentire all'agarosio di solidificarsi. Prima dell'uso, portare la piastra a temperatura ambiente (Figura 1A).

3. Preparazione degli sferoidi HEP

  1. Coltivare le cellule HepG2-WT in un pallone T-75 utilizzando il terreno di crescita completato (cDMEM) composto da Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina (Pen-Streptomyc). Mantenere la coltura cellulare a 37 °C e 5% di CO2, cambiando il terreno di coltura ogni giorno.
  2. Al raggiungimento dell'80% di confluenza, sciacquare le celle con 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) ed eliminare il risciacquo. Aggiungere 5 mL di Tripsina-EDTA allo 0,05% nel pallone e incubare a 37 °C e 5% di CO2 per 5-10 minuti.
  3. Aggiungere quantità uguali di cDMEM e lavare le celle dal pallone. Una volta che le cellule si sono staccate, trasferire la miscela in una provetta da centrifuga conica sterile da 15 mL e centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti a RT.
    NOTA: Tutte le fasi di centrifugazione descritte in questo protocollo sono state eseguite a temperatura ambiente (RT). Tuttavia, queste procedure di centrifugazione possono essere eseguite in alternativa a basse temperature.
  4. Risospendere la sospensione cellulare in cDMEM fresco e contare le cellule per determinare la concentrazione finale in cellule/mL (Figura 1B).
  5. Marcatura con colorante delle cellule
    NOTA: Questo è un passaggio facoltativo.
    1. Trasferire la quantità desiderata di sospensione cellulare in una provetta da centrifuga conica sterile da 15 mL e centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti.
    2. Risospendere il pellet cellulare in un terreno di crescita privo di siero per ottenere una concentrazione finale di 1,0 x 106 cellule/mL. Aggiungere 5 μL di soluzione fluorescente per la marcatura cellulare per mL di sospensione cellulare e incubare la sospensione cellulare a 37 °C e 5% di CO2 in rotazione per 20 min.
      NOTA: Il terreno di coltura privo di siero è DMEM ed è integrato solo con l'1% di pen-streptococco. Regolare il tempo di incubazione per una colorazione uniforme in base alla densità della sospensione cellulare.
    3. Una volta completata l'incubazione, centrifugare la sospensione cellulare a 450 x g per 5 minuti e risospendere il pellet cellulare in cDMEM fresco. Ripetere questo processo di lavaggio altre due volte (Figura 1C).
  6. Formazione di sferoidi
    1. Sospendi le cellule in cDMEM fresco per ottenere una concentrazione finale di 5,0 x 104 cellule/mL in base alla conta cellulare. Miscelare il pozzetto di sospensione cellulare e trasferire 100 μl di sospensione cellulare per pozzetto nella piastra a 96 pozzetti rivestita di agarosio.
      NOTA: La densità della sospensione cellulare è impostata per raggiungere 5.000 cellule per pozzetto nella piastra a 96 pozzetti rivestita di agarosio. Per l'uso di piastre da 384 pozzetti, le cellule vengono sospese a una concentrazione finale di 2,0 x 105 cellule/mL e 50 μL di sospensione cellulare vengono trasferiti per pozzetto per ottenere una concentrazione di 10.000 cellule per pozzetto.
    2. Centrifugare la piastra a 340 x g per 10 minuti e incubare a 37 °C e 5% di CO2 per 5-9 giorni (Figura 1D).
      NOTA: Cambiare il terreno di coltura a giorni alterni dopo la piastra, rimuovendo delicatamente il 50% di cDMEM e sostituendolo. Gli sferoidi HEP sono adatti per il modello assembloide HEP-MES o il modello M-CM.

4. Preparazione degli sferoidi MES

  1. Coltivare cellule HFF/MRC-5 in un pallone T-175 utilizzando cDMEM composto da DMEM, integrato con il 10% di FBS e l'1% di Pen-Strep. Mantenere la coltura cellulare a 37 °C e 5% di CO2, cambiando il terreno a giorni alterni.
  2. Al raggiungimento dell'80% di confluenza, eseguire un risciacquo delle celle con 1x PBS ed eliminare il risciacquo. Aggiungere 5 mL di 0,25% di Tripsina-EDTA al pallone e incubare a 37 °C e 5% di CO2 per 5-10 minuti.
  3. Aggiungere quantità uguali di cDMEM e lavare le celle dal pallone. Una volta che le cellule si sono staccate, trasferire la miscela in una provetta da centrifuga conica sterile da 15 mL e centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti.
  4. Risospendere la sospensione cellulare in cDMEM fresco e contare le cellule per determinare la concentrazione finale in cellule/mL (Figura 1B).
  5. Marcatura con coloranti di cellule
    NOTA: Questo è un passaggio facoltativo.
    1. Trasferire la quantità desiderata di sospensione cellulare in una provetta da centrifuga conica sterile da 15 mL e centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti.
    2. Risospendere il pellet cellulare in un terreno di crescita privo di siero per ottenere una concentrazione finale di 1,0 x 106 cellule/mL. Aggiungere 5 μL di soluzione fluorescente per la marcatura cellulare per mL di sospensione cellulare e incubare la sospensione cellulare a 37 °C e 5% di CO2 in rotazione per 20 min.
      NOTA: Il terreno di coltura privo di siero è DMEM ed è integrato solo con l'1% di pen-streptococco. Regolare il tempo di incubazione per una colorazione uniforme in base alla densità della sospensione cellulare.
    3. Una volta completata l'incubazione, centrifugare la sospensione cellulare a 450 x g per 5 minuti e risospendere il pellet cellulare in cDMEM fresco. Ripetere questo processo di lavaggio altre due volte (Figura 1C).
  6. Formazione di sferoidi
    1. Sospendi le cellule in cDMEM fresco per ottenere una concentrazione finale di 1,0 x 105 cellule/mL in base alla conta cellulare. Miscelare il pozzetto di sospensione cellulare e trasferire 100 μl di sospensione cellulare per pozzetto nella piastra a 96 pozzetti rivestita di agarosio.
      NOTA: La densità della sospensione cellulare è impostata per raggiungere una densità di 10.000 cellule per pozzetto nella piastra da 96 pozzetti rivestita di agarosio.
    2. Centrifugare la piastra a 340 x g per 10 minuti e incubare a 37 °C e 5% di CO2 per 5-9 giorni (Figura 1D).
      NOTA: Cambiare il terreno di coltura a giorni alterni dopo la piastra, rimuovendo delicatamente il 50% di cDMEM e sostituendolo. Gli sferoidi MES sono adatti per il modello assembloide HEP-MES.

5. Formazione assembloide HEP-MES

NOTA: Fare riferimento al passaggio 3 e al passaggio 4 per la formazione di sferoidi HEP (Figura 2A) e MES (Figura 2B).

  1. Raccogliere gli sferoidi HFF/MRC-5 singolarmente utilizzando una pipetta dalla piastra a 96 pozzetti. Trasferirli in una provetta da centrifuga conica sterile da 15 ml contenente cDMEM fresco. Lasciare riposare gli sferoidi nel tubo per 5 minuti, quindi risciacquare delicatamente con cDMEM.
    NOTA: Eseguire il processo di risciacquo delicatamente e con cura.
  2. Trasferire delicatamente un singolo sferoide HFF/MRC-5 utilizzando una pipetta in un pozzetto contenente uno sferoide HepG2-WT. Aggiungere il fattore di crescita ghiacciato ridotto (GFR) Matrigel (MG) o il collagene a coda di ratto (CG) in una diluizione 1:1 e 1:5 e incubare a 37 °C al 5% di CO2 per 3 ore (Figura 2C).
    NOTA: Scongelare MG per una notte con ghiaccio in frigorifero da 2 °C a 8 °C. Assicurarsi l'uso di pipette, puntali e provette pre-raffreddati durante la manipolazione della MG, poiché forma un gel a una temperatura superiore a 10 °C.
  3. Dopo l'incubazione, aggiungere 75 μL di cDMEM fresco a ciascun pozzetto e incubare a 37 °C al 5% di CO2 per 2-3 giorni.
    NOTA: Cambiare il terreno di coltura a giorni alterni dopo la piastra, rimuovendo delicatamente il 50% di cDMEM e sostituendolo. Gli assembloidi si formeranno ancora senza cambi di terreno per un massimo di 3-4 giorni. La formazione di assembloidi HEP-MES può avvenire senza l'uso della matrice.

6. Formazione di goccioline di sferoidi HEP

NOTA: Fare riferimento al passaggio 3 per la formazione di sferoidi HEP (Figura 3A). Due materiali diversi possono essere utilizzati per sospendere gli sferoidi HEP in goccioline. I due metodi sono forniti di seguito.

  1. Goccioline GFR MG
    1. Raccogliere gli sferoidi HepG2-WT singolarmente utilizzando una pipetta dalla piastra a 96 pozzetti, consentendone la sedimentazione in una centrifuga conica sterile da 15 ml su ghiaccio.
    2. In una provetta da centrifuga conica sterile da 15 mL separata, miscelare 1 mL di GFR MG ghiacciato e terreno di crescita di controllo ghiacciato a una diluizione 1:1. Aspirare il terreno utilizzando una pipetta dalla provetta da 15 mL contenente gli sferoidi HepG2-WT e posizionarlo sul ghiaccio.
      NOTA: Scongelare MG per una notte in ghiaccio in frigorifero da 2 °C a 8 °C. Assicurarsi che pipette, puntali e provette pre-raffreddati siano pre-raffreddati quando si maneggia la MG, poiché si forma un gel a una temperatura superiore a 10 °C.
    3. Aggiungere la soluzione MG agli sferoidi HepG2-WT, garantendo una distribuzione uniforme degli sferoidi all'interno della soluzione MG.
    4. Utilizzando una pipetta da 200 μl, raccogliere un volume di 15 μl di un singolo sferoide nella soluzione MG e seminarlo lentamente su una piastra di Petri da 60 mm (Figura 3B).
      NOTA: Se viene seminato più di uno sferoide per gocciolina, rimuoverlo e riseminarlo correttamente. Gli sferoidi vengono riposizionati se necessario per assicurarsi che siano al centro della gocciolina. Per una semina ottimale degli sferoidi, si consiglia di utilizzare il pipettaggio inverso per ridurre al minimo la formazione di bolle d'aria.
  2. Gocce CG coda di ratto
    NOTA: Tutta la preparazione del CG deve essere eseguita sul ghiaccio.
    1. Raccogliere gli sferoidi HepG2-WT singolarmente utilizzando una pipetta dalla piastra a 96 pozzetti, consentendone la sedimentazione in una provetta da centrifuga conica sterile da 15 ml su ghiaccio (Figura 3B).
    2. In una provetta da microcentrifuga, aggiungere 358,8 μL di acqua deionizzata, 100 μL di 10x PBS, 12,1 μL di 1 N NaOH e 529,1 μL di CG stock a coda di ratto per un volume totale di 1 mL.
      NOTA: Il CG della coda di topo di serie deve essere sempre aggiunto alla fine.
    3. Aggiungi la soluzione CG agli sferoidi HepG2-WT, garantendo una distribuzione uniforme degli sferoidi all'interno della soluzione CG.
    4. Utilizzando una pipetta da 200 μl, raccogliere un volume di 15 μl di un singolo sferoide nella soluzione CG e seminarlo lentamente su una piastra di Petri da 60 mm.
      NOTA: Se viene seminato più di uno sferoide per gocciolina, rimuoverlo e riseminarlo correttamente. Gli sferoidi vengono riposizionati per assicurarsi che siano al centro della gocciolina. Per una semina ottimale degli sferoidi, si consiglia di utilizzare il pipettaggio inverso per ridurre al minimo la formazione di bolle d'aria.
  3. Incubare le goccioline a 37 °C e 5% di CO2 per 60 minuti prima di aggiungere il terreno di coltura.
  4. Aggiungere lentamente 5 mL del terreno di crescita desiderato alla capsula di Petri e incubare a 37 °C e il 5% di CO2 con il terreno di crescita cambia ogni tre giorni (Figura 3C).
    NOTA: Il M-CM è stato utilizzato nel saggio di formazione di goccioline HEP.

7. Preparazione di M-CM

  1. Raccogliere le cellule HFF/MRC-5 e seminarle in un pallone trattato con coltura tissutale T-75 a una densità di semina di 5.000 cellule/cm2 e incubare il pallone a 37 °C e 5% di CO2 per 72 ore in 15 mL di cDMEM.
    NOTA: Monitorare il pallone durante questo periodo per garantire una salute ottimale delle cellule.
  2. Dopo 72 ore di incubazione, raccogliere l'M-CM in una provetta da centrifuga conica sterile da 15 mL. Centrifugare l'M-CM a 290 x g per 5 minuti per la rimozione dei detriti e filtrare utilizzando un filtro da 0,2 μm per la sterilizzazione (Figura 4A).
  3. Diluire l'M-CM con un mezzo di crescita completo con un rapporto di diluizione da 1:1 a 1:7 e aggiungerlo all'esperimento desiderato (Figura 4B).
    NOTA: Utilizzare M-CM nel saggio di formazione di goccioline HEP.

8. Formazione di sferoidi misti HEP-MES

NOTA: Fare riferimento ai passaggi 3.1-3.5 per la preparazione della sospensione cellulare HepG2-WT e ai passaggi 4.1-4.5 per la preparazione della sospensione cellulare HFF/MRC-5.

  1. Sospendere le cellule HepG2-WT in cDMEM fresco per ottenere una concentrazione finale di 1,0 x 105 cellule/mL per ciascuna sospensione cellulare.
  2. Sospendere le cellule HFF/MRC-5 in cDMEM fresco per ottenere una concentrazione finale di 1,0 x 105 cellule/mL per ciascuna sospensione cellulare.
  3. Trasferire le sospensioni cellulari HepG2-WT e HFF/MRC-5 in una provetta da centrifuga conica sterile da 15 mL in rapporto 1:1 per ottenere una concentrazione finale di 2,0 x 105 cellule/mL. Miscelare accuratamente la sospensione cellulare e trasferire 100 μl di sospensione cellulare per pozzetto nella piastra a 96 pozzetti rivestita di agarosio.
    NOTA: La densità della sospensione cellulare è impostata per ottenere 20.000 cellule per pozzetto nella piastra a 96 pozzetti rivestita di agarosio.
  4. Centrifugare la piastra a 340 x g per 10 minuti e incubare a 37 °C e 5% di CO2 per 1-2 giorni (Figura 5C).
  5. Aggiunta di idrogel di fibrina
    NOTA: Questo è un passaggio opzionale che viene eseguito in 72 ore dopo la placcatura di sferoidi misti HEP-MES.
    1. In una provetta da centrifuga conica sterile da 15 mL, mescolare il fibrinogeno (3,25 mg/mL) e la trombina (12,5 unità/mL) in un rapporto 4:1 per la formazione di fibrina e mettere la provetta sul ghiaccio.
  6. Trasferire la fibrina in ciascun pozzetto con uno sferoide misto preesistente a una diluizione 1:1 con cDMEM corrente nel pozzetto. Incubare la piastra a 37 °C e 5% di CO2 per 30 minuti.
  7. Dopo l'incubazione, aggiungere 75 μL di cDMEM fresco a ciascun pozzetto e incubare a 37 °C al 5% di CO2 per 1-2 giorni.
    NOTA: Cambiare il terreno di coltura a giorni alterni dopo la piastra, rimuovendo delicatamente il 50% di cDMEM e sostituendolo.

9. Modello migratorio MES ad alta densità

NOTA: Fare riferimento al passaggio 3 per la preparazione dello sferoide HepG2-WT (Figura 6A) e ai passaggi 4.1-4.5 per la preparazione della sospensione cellulare HFF/MRC-5 (Figura 6B).

  1. Sospendere le cellule HFF/MRC-5 in cDMEM fresco per ottenere una concentrazione finale di 6,0 x 105 cellule/mL e metterle in ghiaccio.
  2. Miscelare la sospensione cellulare HFF/MRC-5 e l'MG/CG ghiacciato a una diluizione 1:1 (Figura 6C).
    NOTA: La densità della sospensione cellulare è impostata per ottenere 30.000 cellule per pozzetto nella piastra a 96 pozzetti rivestita di agarosio. Scongelare MG per una notte in ghiaccio in frigorifero a 2-8 °C. Assicurarsi che pipette, puntali e provette pre-raffreddati siano pre-raffreddati quando si maneggia la MG, poiché si forma un gel a una temperatura superiore a 10 °C.
  3. Trasferire 100 μl di soluzione di HFF/MRC-5 e MG utilizzando una pipetta in un pozzetto contenente uno sferoide HepG2-WT. Incubare la piastra a 37 °C e 5% di CO2 per 30 minuti.
  4. Dopo l'incubazione, aggiungere 75 μL di cDMEM fresco a ciascun pozzetto e incubare a 37 °C al 5% di CO2 per un massimo di 12 giorni.

10. Analisi statistica

  1. Rivedi e analizza i dati raccolti utilizzando Microsoft Excel o qualsiasi software statistico/grafico.
    NOTA: Per la valutazione statistica tra due gruppi, è stato eseguito il test t di Student (tipo II con due code) e i valori p uguali o inferiori a 0,05 sono stati considerati di rilevanza statistica e sono definiti all'interno del testo e delle figure/legende delle figure.

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Risultati

L'interesse per tessuti sintetici in una vasta gamma di applicazioni biomediche, come la modellizzazione delle malattie, la scoperta di farmaci e l'ingegneria tissutale (Figura 7), è in costante aumento. All'interno di questo settore, gli organoidi, gli sferoidi e le cellule derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) stanno venendo trasformati in tessuti sintetici più complessi e di maggiori dimensioni. Questa trasformazione implica l'applicazione dei principi della morfogenesi,...

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Discussione

Il presente protocollo comprende diversi metodi per la coltivazione di assembloidi semplici e complessi, nonché tecniche per indurre la migrazione cellulare collettiva 3D nell'organogenesi epatica precoce24,25. I protocolli delineati evidenziano diversi passaggi critici, con la formazione di sferoidi che è un aspetto centrale in tutte le metodologie. I micropozzetti (96 o 384 pozzetti) sono utilizzati con piastre non aderenti o rivestite di agarosio per ottenere ...

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Dichiarazioni

NP è il fondatore di Khufu Therapeutics, un'azienda di ingegneria degli organoidi che sviluppa trattamenti per le malattie epatiche acute e croniche.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano esprimere sincera gratitudine a Ogechi Ogoke e Osama Yousef per i loro inestimabili contributi ai dati utilizzati in questo articolo. NP è stato supportato dai fondi di avvio UB CBE, da una Mark Diamond Fellowship, dal New York State Stem Cell Science C024316, dal centro UB Stem Cells in Regenerative Medicine (ScIRM), dal Center for Cell, Gene, Tissue Engineering (CGTE) dell'Università di Buffalo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
384 pozzetti Nero/Trasparente Fondo rotondo Attacco ultra-basso Micropiastra sferoidaleCorning3830
96-wl Piastra per colture cellulari Piatta, TC, STRL, 1/pk, 100/CSProdotti da laboratorio Vendite701001
AgaroseSigma-AldrichA0576a basso EEO
ZEISSversione 4
Piatto per colture cellulari, 60mm, TC, STRL, 20/pk, 500/CSVendita di prodotti da laboratorio705001
Pallone per colture cellulari, 175 cm², Sfiato,TC,STRL,5/pk,40/CSVendita di prodotti da laboratorio709003
Pallone per colture cellulari,75 cm², Sfiato,TC,STRL,5/pk,100/CSVendita di prodottida laboratorio 708003
Provette per centrifuga, 15mL,PP,STRL,grad,50/bg,500/CSVendita di prodotti da laboratorioL226010
Collagene I, coda di ratto, 100 mgCorning354236
DMEM, glucosio alto, integratore GlutaMAX, piruvatoThermoFisher Scientific10569010
EVOS Microscopio fluorescente, a contrasto di faseEVOSAMEFC4300R1.360 x 1.024 densità di pixel
Siero fetale bovino, qualificato, Stati UnitiThermoFisher Scientific26140079
Fibrinogeno dal plasma umanoSigma-AldrichF4883-500MG500 mg
Hep G2 [HEPG2]ATCCHB-8065
HERAcell vios 160iThermoFisher Scientific51033557
HFF-1ATCCSCRC-1041
ImageJIJ1.46r; https://imagej.net/ij/
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Membrana basale Matrice, senza LDEV, 10 mLCorning354230
MRC-5ATCCCCL-171
MSCGMT Crescita di cellule staminali mesenchimali umane BulletKitLonzaPT-3001
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
Trombina da plasma umanoSigma-AldrichT6884-100UN100 unità
Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenoloThermoFisher Scientific25300062
Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenoloThermoFisher Scientific25200072
Vybrant DiD Soluzione per la marcatura cellulareThermoFisher ScientificV22887
Vybrant DiI Soluzione per la marcatura cellulareThermoFisher ScientificV22885
Vybrant DiO Marcatura cellulare SoluzioneThermoFisher ScientificV22886
Microscopio a fluorescenza Zeiss AxioZEISSSE64, 1.344 & moltiplicato per 1.024 pixel di densità
Software Axiovision

Riferimenti

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