Articolo metodologico

Isolamento delle cellule stromali da organi ematopoietici

DOI:

10.3791/66231

⸱

26 gennaio 2024

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Harvard Stem Cell Institute, 3Department of Stem Cell and Regenerative Biology, Harvard University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui presentiamo protocolli che consentono l'isolamento di cellule stromali da osso murino, midollo osseo, timo e tessuto timico umano compatibile con la multiomica a singola cellula.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il sequenziamento di singole cellule ha permesso la mappatura di popolazioni cellulari eterogenee nello stroma degli organi ematopoietici. Queste metodologie forniscono una lente attraverso la quale studiare l'eterogeneità precedentemente irrisolta allo stato stazionario, nonché i cambiamenti nella rappresentazione del tipo cellulare indotti da stress estrinseci o durante l'invecchiamento. Qui, presentiamo protocolli graduali per l'isolamento di popolazioni di cellule stromali di alta qualità dal timo murino e umano, nonché dall'osso murino e dal midollo osseo. Le cellule isolate attraverso questi protocolli sono adatte per generare set di dati multiomici a singola cellula di alta qualità. Qui vengono discussi gli impatti della digestione del campione, l'esaurimento del lignaggio ematopoietico, l'analisi/smistamento FACS e il modo in cui questi fattori influenzano la compatibilità con il sequenziamento a singola cellula. Con esempi di profili FACS che indicano una dissociazione riuscita e inefficiente e rese di cellule stromali a valle nell'analisi post-sequenziamento, vengono forniti indicatori riconoscibili per gli utenti. Considerare i requisiti specifici delle cellule stromali è fondamentale per acquisire risultati di alta qualità e riproducibili che possano far progredire le conoscenze sul campo.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nell'adulto sano, la produzione de novo di cellule del sangue avviene nel midollo osseo e nel timo. Le cellule stromali in questi siti sono essenziali per il mantenimento dell'emopoiesi, ma lo stroma costituisce meno dell'1% del tessuto 1,2,3,4. Ottenere isolati puri di emopoiesi che supportano lo stroma costituisce quindi una sfida significativa, in particolare per la multiomica a singola cellula che richiede un'elaborazione rapida per ottenere campioni di alta qualità. I componenti di diversi cocktail di digestione possono interferire con alcune fasi dell'analisi multiomica 5,6. I protocolli qui presentati descrivono in dettaglio l'isolamento di un'ampia varietà di cellule stromali dal midollo osseo e dai tessuti timici.

Le perturbazioni dei costituenti stromali sia nel midollo osseo che nel timo provocano una profonda interruzione dello sviluppo delle cellule del sangue e possono provocare tumori maligni 7,8,9. L'emopoiesi che supporta lo stroma viene danneggiata in seguito al condizionamento citotossico e al trapianto di midollo osseo, con conseguente riduzione della secrezione di citochine e fattori di crescita che sostengono le cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HSPC)2,10,11. Inoltre, l'invecchiamento colpisce le cellule stromali del midollo osseo e del timo, contribuendo probabilmente ai fenotipi ematopoietici invecchiati. Il timo è il primo organo a subire un'estesa involuzione associata all'età. Il grasso e il tessuto fibrotico iniziano a sostituire lo stroma di supporto delle cellule T già all'inizio della pubertà12,13. Nel midollo osseo, il contenuto di adipociti aumenta con l'età e le nicchie vascolari ed endostali sono significativamente rimodellate 14,15,16.

Per consentire lo studio dello stroma di supporto all'emopoiesi in più stati di stress e nel caso del timo sia del tessuto umano che di quello murino, abbiamo ottimizzato i protocolli di digestione precedentemente pubblicati 1,2,8,17,18. Questi protocolli garantiscono un isolamento efficiente e riproducibile delle cellule e sono compatibili con il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNAseq) e altri tipi di multiomica.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutto il lavoro con tessuti umani è stato condotto dopo l'approvazione del Massachusetts General Hospital Internal Review Board (IRB). Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in conformità con le linee guida del Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Per il presente studio sono stati utilizzati topi C57Bl/6, di 8-10 settimane, sia maschi che femmine. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Preparazione del tessuto timico murino

  1. Preparare i seguenti tamponi e soluzioni.
    1. Medium 199 (M199) con il 2% (v/v) di siero fetale bovino (FBS) (vedi Tabella dei materiali).
    2. Cocktail di dissociazione murina: 0,5 WU/mL Liberase TM e 6,3 U/mL DNasi I in M199 + 2% FBS (vedi Tabella dei materiali).
    3. M199 con albumina sierica bovina (BSA) al 2% (p/v).
      NOTA: Il terreno contenente FBS può essere commutato in BSA per migliorare la qualità dell'RNA.
  2. Eseguire la dissezione del timo murino
    1. Eutanasia del topo per asfissia da CO2 (seguendo protocolli istituzionalmente approvati) e posizionarlo sul dorso. Bagnare il pelo sul petto spruzzando etanolo al 70% e procedere all'apertura della cavità toracica.
    2. Sezionare con cura il timo praticando prima un'incisione trasversale appena sotto la gabbia toracica con le forbici chirurgiche. Taglia le costole su ciascun lato del topo fino alla clavicola. Quindi tagliare il diaframma in modo che la parete toracica possa essere rilasciata. Sollevare le costole con un paio di pinze per esporre la cavità toracica.
      1. Il timo è un organo bilobulare bianco, situato nella parte superiore della cavità, appena sopra il cuore. Tenere il timo con la pinza e tagliare delicatamente il tessuto connettivo che tiene il timo in posizione. Mettere il tessuto timico sezionato nel pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con M199 + 2% FBS su ghiaccio.
        NOTA: Quando si lavora con topi anziani o condizionati da radiazioni o ceppi mutanti con difetti timici, il timo può essere così piccolo che è necessario un microscopio da dissezione per asportare in modo affidabile l'organo.
    3. Utilizzando un microscopio da dissezione, rimuovere il tessuto extratimico utilizzando una pinza smussata e forbici a micromolla.
  3. Eseguire la dissociazione enzimatica del tessuto timico murino (30 min con incrementi di 10 min)
    1. Posizionare il timo pulito nel tappo di una provetta da 15 ml e tritare finemente il fazzoletto con le forbici chirurgiche sterili.
      NOTA: Tritare il fazzoletto nel tappo del tubo che deve essere utilizzato per la digestione riduce al minimo la perdita di tessuto dovuta al trasferimento da un contenitore all'altro. Questo è molto importante quando si lavora con topi anziani o condizionati dalle radiazioni o ceppi mutanti con difetti timici. Le piccole dimensioni del timo in questi ambienti richiedono la necessità di ridurre la perdita di materiale ove possibile.
    2. Aggiungere 2 mL di cocktail di dissociazione murina alla provetta da 15 mL, collegare il tappo contenente i pezzi di timo e capovolgere 5 volte per assicurarsi che il tessuto sia risospeso nel cocktail di dissociazione.
    3. Per evitare perdite, avvolgere il tappo del tubo in un film di paraffina. Quindi posizionare il tubo orizzontalmente in un bagno d'acqua a 37 °C con agitazione a 250 giri/min. Incubare per 10 min.
      NOTA: Il successo del protocollo di digestione dipende dall'incubazione eseguita a 37 °C e con agitazione. Il protocollo descritto è stato ottimizzato utilizzando un bagno d'acqua agitante. Se ciò non è disponibile, altri approcci che consentono l'agitazione in un ambiente riscaldato potrebbero funzionare, ma si consiglia di ottimizzare prima il protocollo per queste impostazioni.
    4. Posizionare la provetta da 15 ml in un rack e lasciare che i pezzi di tessuto si depositino. Rimuovere con cautela il surnatante e passarlo su un colino cellulare da 70 μm in una provetta ghiacciata da 50 ml.
    5. Ripetere i passaggi 2-4 due volte per un totale di 3 cicli di digestione. Il tessuto dovrebbe essere più o meno completamente dissociato entro la fine dell'ultima incubazione.
    6. Aggiungere 20 mL di M199 + 2% FBS alla sospensione cellulare raccolta. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
    7. Rimuovere il surnatante e risospendere in un volume appropriato di M199 + 2% FBS. Quindi procedere al conteggio delle cellule.
      NOTA: Il volume di M199 + 2% FBS in cui risospendere dipenderà dallo stato del timo. Per i topi di 6-10 settimane, si consiglia di risospendere il tessuto in 3-4 ml di M199 + 2% FBS. Tuttavia, per gli esperimenti che utilizzano tessuti invecchiati o condizionati da radiazioni o ceppi mutanti con difetti timici, le piccole dimensioni del timo richiederanno volumi inferiori che vanno da 0,1 a 1 mL.
    8. Contare le cellule diluendo la sospensione cellulare 1:2 in una soluzione di blu di tripano allo 0,4% (p/v). Caricare le celle su un emocitometro e contare al microscopio a campo chiaro. Contare le cellule non colorate per determinare il numero di cellule vive per millilitro e il numero di cellule colorate in blu per valutare la vitalità del campione.
  4. Eseguire lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza dello stroma timico murino
    1. Centrifugare le celle a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere le cellule a una concentrazione di 5 x 107 cellule/mL in M199 + 2% FBS integrato con 25 U/mL di inibitore della RNasi Protector (vedere la Tabella dei materiali).
    2. Aggiungere il blocco Fc murino (vedi Tabella dei materiali) a una concentrazione di 2 μg/mL e incubare per 10 minuti a 4 °C.
    3. Colorare le cellule con i seguenti anticorpi: CD45-PE/Cy7 (4 μg/mL), Ter119-PE (4 μg/mL), CD31-BUV737 (2 μg/mL) ed EpCam-BV711 (2 μg/mL) (vedere la Tabella dei materiali) per 30 minuti a 4 °C.
    4. Lavare i campioni in M199 + 2% BSA e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
    5. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in M199 + 2% BSA contenenti un colorante vitale come DAPI (0,5 μg/mL) o 7-AAD (1 μg/mL) (vedere la Tabella dei materiali). Procedere all'isolamento FACS delle cellule stromali timiche, seguendo i protocolli stabiliti19.

2. Preparazione del tessuto timico umano

  1. Preparare i seguenti tamponi e soluzioni.
    1. Medium 199 (M199) con 2% (v/v) FBS.
    2. M199 con l'1,5% (p/v) BSA.
    3. Cocktail di dissociazione umana: 1 mg/ml di collagenasi IV e 2 mg/mL di dispasi e 6,3 U/mL di DNasi I in M199 +1,5% BSA (vedi Tabella dei materiali).
      NOTA: L'ultima fase della digestione nella preparazione del tessuto timico umano include la tripsina. È quindi essenziale che tutti i passaggi fino a quel momento siano eseguiti in BSA contenente tampone poiché FBS inibisce l'attività della tripsina.
  2. Eseguire l'isolamento del tessuto timico umano
    1. Porre il timo umano (raccolto seguendo il metodo19 precedentemente pubblicato) in un volume adeguato di M199 + 1,5% BSA e conservarlo su ghiaccio fino all'inizio della lavorazione.
    2. Mentre si lavora con il tessuto timico umano, maneggiarlo come se fosse potenzialmente infettivo eseguendo il lavoro in una cappa di coltura tissutale e utilizzando le precauzioni standard secondo le linee guida CDC20.
    3. Mettere il fazzoletto in una capsula di Petri da 10 cm con 10 ml di M199 ghiacciato + 1,5% BSA. Usando pinze e forbici sterili, pulisci accuratamente il grasso extratimico o il tessuto che è stato danneggiato durante l'estrazione dell'organo.
    4. Usando le forbici chirurgiche e un paio di pinze, tagliare il timo in cubetti di 1 cme 3 e utilizzare lo stantuffo di una siringa da 10 ml per spingere delicatamente verso il basso i pezzi. Questo rilascerà alcuni dei timociti in via di sviluppo, riducendo così il volume del tessuto da digerire.
      NOTA: Conservare la frazione ematopoietica rilasciata se è necessaria una successiva analisi degli stadi di sviluppo dei timociti. Tuttavia, non combinare questa frazione con la frazione di cellule stromali generata durante la digestione enzimatica. È stato osservato che l'unione delle due frazioni aumenta significativamente il rischio di formazione di ostruzioni nella sospensione cellulare, riducendo in ultima analisi la resa delle cellule stromali. Poche cellule stromali vengono perse durante la frantumazione delicata del tessuto.
  3. Eseguire la dissociazione enzimatica del tessuto timico umano (90 min con incrementi di 30 min)
    1. Trasferire circa 5 mg di pezzi di tessuto timico leggermente frantumati nel tappo di una provetta conica da 50 mL. Quindi tagliare finemente il tessuto utilizzando forbici chirurgiche sterili.
    2. Pipettare 8 mL di cocktail di dissociazione umana nella provetta da 50 mL, collegare il tappo contenente il tessuto timico umano tritato, quindi capovolgere delicatamente la provetta 5 volte per assicurarsi che tutto il tessuto sia mescolato con il cocktail enzimatico.
    3. Fissare il tappo della provetta con pellicola di paraffina per evitare perdite. Incubare la provetta orizzontalmente in un bagno d'acqua agitante (250 giri/min) a 37 °C per 30 minuti.
    4. Posizionare la provetta da 50 ml in un rack e lasciare che i pezzi di tessuto del timo umano si depositino prima di rimuovere il surnatante e passarlo su un colino cellulare da 70 μm in una nuova provetta da 50 ml posta sul ghiaccio.
    5. Ripetere i passaggi 2.3.2-1.3.4 per un totale di due cicli di digestione con il cocktail di dissociazione umana.
    6. Al termine del secondo ciclo di digestione, aggiungere altri 8 ml del cocktail di dissociazione umana al tessuto rimanente. Quindi pipettare anche 2 mL di tripsina allo 0,25% nella provetta di dissociazione tissutale. Incubare per altri 30 minuti a 37 °C, agitando a 250 giri/min.
      NOTA: È assolutamente essenziale che il tempo di digestione del tessuto umano sia di almeno 90 minuti, poiché tempi di incubazione più brevi portano a una drastica riduzione della resa delle cellule stromali.
    7. Una volta terminata l'ultima fase di incubazione, raggruppare la sospensione cellulare e i frammenti di tessuto rimanenti con il surnatante raccolto nelle fasi precedenti passando su un colino cellulare da 70 μm. Aggiungere 3 mL di FBS al campione per interrompere la reazione della tripsina e mettere su ghiaccio.
    8. Procedere al conteggio delle celle come descritto al punto 1.3.
  4. Eseguire lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza dello stroma timico umano
    1. Centrifugare la sospensione cellulare del timo umano e risospendere a una concentrazione di 5 x 107 cellule/mL in M199 + 2% FBS integrato con 25 U/mL di inibitore della RNasi Protector.
    2. Incubare con blocco Fc umano (5 μg/mL) (vedi Tabella dei materiali) per 10 minuti a 4 °C.
    3. Colorare il campione per 30 minuti a 4 °C con CD45-BV711 (2,5 μg/mL), CD235a-BV711 (2,5 μg/mL), Lineage-cocktail-FITC (3,76 μg/mL), CD66b-FITC (20 μL/100 μL campione), CD8-APC/Cy7 (5 μL/100 μL campione), CD4-BV605 (5 μL/100 μL campione), CD31-PE/Dazzle594 (10 μg/mL) ed EpCam-BV421 (2,5 μg/mL) (vedere la Tabella dei materiali).
    4. Lavare i campioni in M199 + 1,5% BSA e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
    5. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in M199 + 1,5% BSA contenenti un colorante vitale come DAPI (0,5 μg/mL) o 7-AAD (1 μg/mL). Procedere all'isolamento FACS delle cellule stromali timiche, seguendo i protocolli stabiliti19.

3. Preparazione dell'osso murino e del tessuto midollare

NOTA: Le frazioni ossee e midollari vengono preparate in due reazioni di digestione separate per ottenere la massima purezza delle cellule stromali e una dissociazione ottimale dei tessuti. I campioni possono essere raggruppati dopo le fasi di digestione per essere ordinati in un unico compartimento stromale.

  1. Preparare i seguenti tamponi e soluzioni.
    1. M199 con 2% (v/v) FBS.
    2. Cocktail di dissociazione murino B&M (osso e midollo): Stemxyme 2 mg/mL, Dispasi 1 mg/mL e 10 U/mL DNasi I (vedi Tabella dei materiali) in M199 +2% FBS.
      NOTA: Preparare la miscela di dissociazione B&M fresca e conservare la miscela sul ghiaccio fino al momento dell'uso.
    3. M199 con 0,5% (p/v) BSA.
    4. Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con BSA allo 0,5% (p/v).
    5. M199 con albumina sierica bovina (BSA) al 2% (p/v) e 2 mM EDTA.
      NOTA: Il terreno contenente FBS può essere convertito in BSA per migliorare la qualità dell'RNA.
  2. Eseguire la separazione del midollo osseo murino
    1. Eutanasia del topo per asfissia da CO2 (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Spruzzare con etanolo al 70% per bagnare il pelo.
    2. Rimuovere con cautela il femore, la tibia, il bacino e l'omero da ciascun lato e metterli in un pozzetto contenente M199 + 2% FBS su ghiaccio21,22.
    3. Rimuovere tutto il tessuto muscolare, legamentoso e cartilagineo con salviette per tessuti per ridurre al minimo i danni all'osso e preservare lo strato periostale. Metterli in un nuovo pozzetto con M199 + 2% FBS su ghiaccio.
    4. Usa un bisturi e taglia le placche di crescita delle ossa lunghe per rimuovere l'epifisi e mettilo in un piatto da 10 cm con M199 + 2% FBS su ghiaccio.
    5. Sciacquare il midollo osseo dalle ossa fino a quando non diventa bianco pallido. Utilizzare un ago da 28 G e una siringa da 10 mL riempita con 10 mL di M199 + 2% FBS per lavare il midollo in una provetta da 15 mL su ghiaccio. Posizionare l'osso arrossato nel piatto da 10 cm con l'epifisi.
      NOTA: Il lavaggio completo del midollo osseo per l'intera separazione dei tessuti si tradurrà in una migliore preparazione del campione.
  3. Eseguire la dissociazione enzimatica del tessuto del midollo osseo murino (totale 30 minuti con incrementi di 10 minuti)
    1. Lasciare la provetta da 15 ml in posizione verticale sul ghiaccio fino a quando il midollo non affonda sul fondo della provetta. Rimuovere lentamente i 10 mL di M199 + 2% FBS mediante pipettaggio.
    2. Aggiungere 4 mL di cocktail di dissociazione B&M alla provetta da 15 mL e metterla in un bagnomaria a 37 °C (senza agitare) per 10 minuti.
    3. Dopo 5 minuti, capovolgere il tubo tre volte e rimetterlo nel bagnomaria.
    4. Dopo i primi 10 minuti, assicurarsi che il pellet sia sul fondo e raccogliere il surnatante filtrando attraverso un colino cellulare da 70 μm in una provetta ghiacciata da 50 ml. Aggiungere 2 ml di cocktail di dissociazione B&M fresco al pellet BM rimanente e rimetterlo nel bagnomaria.
    5. Dissociare i pezzi di midollo osseo rimanenti mediante pipettaggio energico utilizzando una pipetta da 1 mL. Raccogli tutta la sospensione cellulare risultante nello stesso tubo dei passaggi precedenti. Aggiungere 20 mL di M199 + 0,5% BSA + 2 mM EDTA alla sospensione cellulare raccolta.
      NOTA: Nella fase 3.3.5, il tampone aggiunto dopo il campione finale digerito contiene EDTA per aiutare a inibire l'ulteriore attività enzimatica.
  4. Eseguire la deplezione delle cellule ematopoietiche del tessuto del midollo osseo murino.
    1. Centrifugare le celle a 500 x g per 5 min a 4 °C. Risospendere in 500 μL di PBS + 0,5% BSA con anticorpi alla biotina (5 mg/mL) diretti contro CD45, Ter119, CD11b, Gr1, B220 e CD3 (vedere la Tabella dei materiali). Trasferire in una provetta a fondo tondo con tappo.
    2. Incubare su un agitatore orbitale per 10 minuti a temperatura ambiente al buio.
    3. Agitare accuratamente le perline magnetiche e aggiungere 25 μl di perline magnetiche al tubo.
    4. Incubare su un agitatore orbitale per 5 minuti a temperatura ambiente al buio.
    5. Posizionare il tubo nel magnete corrispondente per 2-3 minuti e raccogliere il surnatante in un tubo nuovo.
      NOTA: Il midollo osseo può essere raggruppato o tenuto separato dalla frazione ossea dopo questo passaggio. Se la deplezione del lignaggio ha successo, la sospensione cellulare risultante dovrebbe essere priva di globuli rossi.
  5. Eseguire la dissociazione enzimatica del tessuto osseo murino.
    1. Rompere le ossa in pezzi più piccoli nel piatto da 10 cm con il tappo piatto di una provetta da 50 ml. Filtrare il surnatante attraverso un colino cellulare da 70 μm per isolare i frammenti ossei all'interno del filtro.
      NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare un mortaio e un pestello per la frammentazione ossea. Questa opzione, tuttavia, tende a generare più detriti e a ridurre la vitalità delle cellule stromali quando l'osso è macinato piuttosto che rotto. Le cellule stromali sono ancora attaccate all'osso e nel suo interno e il surnatante contenente cellule ematopoietiche deve essere scartato.
    2. Usa le forbici per tagliare i frammenti ossei nel colino cellulare. Ciò aumenterà l'area superficiale per una dissociazione enzimatica più efficiente. Lavare l'osso con 5 mL di M199 + 2% FBS.
    3. Posizionare la frazione ossea in 5 mL di miscela murina di dissociazione B&M (vedi Tabella dei materiali) in una nuova provetta da 50 mL.
    4. Per evitare perdite, avvolgere il tappo del tubo in un film di paraffina. Quindi posizionare la provetta orizzontalmente in un bagnomaria a 37 °C con agitazione a 120 giri/min per 30 minuti.
    5. Dopo la digestione, aggiungere 25 mL di M199 + 0,5% BSA + 2 mM EDTA e filtrare il surnatante contenente le cellule stromali attraverso un colino cellulare da 70 μm in una provetta ghiacciata da 50 ml.
      NOTA: Verificare che i frammenti ossei risultanti siano stati visibilmente diminuiti dalla digestione. Nella fase 3.5.5, il tampone aggiunto dopo il campione finale digerito contiene EDTA per aiutare a inibire l'ulteriore attività enzimatica.
  6. Eseguire lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza dell'osso murino e dello stroma del midollo osseo.
    1. Centrifugare le celle a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
    2. Risospendere in blocco Fc murino a una concentrazione di 10 μg/mL in PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA e incubare per 10 minuti a 4 °C.
    3. Colorare le cellule (fino a 10 milioni di cellule/100 μL di volume totale di colorazione) con i seguenti anticorpi: CD45-PE/Cy7 (1 μg/mL), Ter119-PE/Cy7 (1 μg/mL), CD31-BV421 (0,66 μg/mL), CD140a-APC (2 μg/mL), Sca1-AF700 (0,66 μg/mL), CD51-PE (2 μg/mL), CD105-PE/dazzle (2 μg/mL) (vedere la Tabella dei materiali).
    4. Lasciare equilibrare Calcein-AM a temperatura ambiente e risospendere in 50 μl di DMSO. Preparare fresco per ogni utilizzo. Conservare a temperatura ambiente dopo la risospensione. Pre-diluire la calceina in PBS (0,1 mg/mL) prima di aggiungerla al campione (20 μg/mL) già risospesa nel cocktail di colorazione anticorpale e incubare per 20-30 minuti a 4 °C al buio.
    5. Lavare i campioni in PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
    6. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA. Procedere all'isolamento FACS delle cellule stromali ossee e del midollo osseo seguendo i protocolli stabiliti19.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questi protocolli producono varietà di cellule stromali riproducibili dal timo e dal midollo osseo adatte per l'analisi citofluorimetrica, nonché per la multiomica a singola cellula, come il sequenziamento dello scRNA. Il tessuto timico murino subisce un significativo rimodellamento in risposta a fattori di stress, come il condizionamento citotossico che precede il trapianto di midollo osseo o il naturale processo di invecchiamento. Di conseguenza, la cellularità timica è drasticamente ridotta in entrambi questi contesti (Figura 1A). Mentre un timo di un topo selvatico di 8 settimane contiene circa 100 milioni di cellule, ci si può aspettare che la cellularità di un topo di 2 anni sia la metà di quella e un timo 4 giorni dopo l'irradiazione e il trapianto di midollo osseo può essere di soli 5.000.000 di cellule (Figura 1A).

Il condizionamento citotossico ablerà preferenzialmente le cellule ematopoietiche, quindi il compartimento stromale sarà arricchito proporzionalmente (Figura 1B). Tuttavia, la bassa cellularità complessiva renderà difficile isolare un numero sufficiente di cellule stromali timiche. Potrebbe quindi essere necessario raggruppare gli animali per ottenere numeri di cellule compatibili con le applicazioni multiomiche a valle e per ridurre al minimo la perdita di materiale, ove possibile. Per eseguire la multiomica su cellule stromali timiche, lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) di cellule CD45-Ter119- vive, singole (Figura 1C) garantirà che un numero sufficiente di cellule possa essere selezionato dalla maggior parte delle condizioni di stress.

Per preservare l'eterogeneità del compartimento stromale, in genere non selezioniamo un singolo marcatore stromale positivo, ma cancelliamo le cellule ematopoietiche. L'inclusione di marcatori di cellule stromali positive è ancora raccomandata per l'analisi per garantire che sia stata raggiunta una corretta dissociazione tissutale. Tuttavia, l'isolamento del FACS è imperfetto e, come determinato da scRNAseq, il 30%-50% delle cellule selezionate sarà di origine ematopoietica (Figura 1D, E). Questo può essere migliorato esaurendo magneticamente le cellule CD45+ prima del FACS; tuttavia, questo non è raccomandato per condizioni di ridotta cellularità timica (Figura 1A) poiché la perdita di materiale che deriva dalla lavorazione extra coinvolta nella deplezione magnetica si traduce in rese stromali troppo basse per le applicazioni a valle.

Per l'isolamento dello stroma timico umano, il passaggio più critico è la digestione enzimatica. Se la fase di dissociazione è affrettata, la resa complessiva delle cellule stromali, così come la rappresentazione del sottotipo di cellula stromale, saranno gravemente ridotte (Figura 2A). Si raccomanda inoltre di includere sempre i marcatori dell'endotelio e dell'epitelio timico per garantire che la digestione dei tessuti sia stata ottimale, poiché il semplice gating negativo per i marcatori ematopoietici non sarà sufficiente per valutare l'effettivo rilascio di cellule stromali. Ciò è esemplificato nella Figura 2A, dove la percentuale di cellule negative per i marcatori ematopoietici è più alta nel campione digerito per 30 minuti rispetto al campione incubato per 90 minuti. Tuttavia, come si vede nel cancello consecutivo, la resa delle cellule endoteliali ed epiteliali è molto scarsa nel protocollo di digestione più breve (Figura 2A).

Per l'isolamento FACS di cellule stromali timiche umane per applicazioni multiomiche, si suggerisce la colorazione con un cocktail di anticorpi di linea ematopoietica, nonché con anticorpi CD4 e CD8, oltre al marcatore pan-ematopoietico CD45 e al marcatore eritroide CD235a (Figura 2B) per migliorare l'arricchimento delle cellule stromali. Pertanto, per l'analisi multiomica umana dello stroma timico, le cellule CD45-CD235a-Lineage-CD4-CD8- vive e singole devono essere selezionate FACS (Figura 2B). Come si è visto per scRNAseq di campioni murini, ciò provoca ancora la contaminazione del 30%-50% delle cellule ematopoietiche, ma ciò fornisce ancora una risoluzione accettabile del compartimento stromale del timo umano (Figura 2C, D).

Per l'osso e lo stroma BM, è stata utilizzata la stessa strategia utilizzata per il tessuto timico; Le cellule stromali vengono isolate mediante gating su cellule negative per i marcatori ematopoietici e ulteriori marcatori di cellule stromali sono inclusi come controlli della digestione (Figura 3). La dissociazione del tessuto calcificato come l'osso provoca un significativo accumulo di detriti. L'aggiunta di calceina come colorante vitale consentirà l'esclusione della maggior parte di questi detriti, che altrimenti gonfiano falsamente i numeri ordinati e diminuiscono le frequenze di popolazione recintata (Figura 3). Questo è esemplificato nei grafici FACS che confrontano il gating su tutte le celle e il gating solo su Calcein+ (Figura 3). Come osservato per le cellule stromali timiche umane, la percentuale di cellule ematopoietiche marcatore-negative non è una lettura affidabile per l'efficienza della dissociazione ossea e del tessuto midollare (Figura 3). Mentre il cancello CD45-Ter119- può contenere un'abbondanza di cellule in un campione in cui la fase di digestione non è riuscita, ulteriori analisi dei tipici marcatori delle cellule stromali ossee e del midollo osseo CD31, CD140a e CD51 dimostrano chiaramente uno scarso rilascio di stroma (Figura 3 e Figura 4).

Per l'isolamento FACS dell'osso murino e delle cellule stromali del midollo osseo, si suggerisce l'utilizzo della strategia di gating come nella Figura 3, dove selezioniamo solo CD45-Ter119-Calcein+ ma monitoriamo le proprietà di dispersione diretta e laterale e l'espressione dei marcatori delle cellule stromali della popolazione selezionata per garantire una digestione ottimale (Figura 3A). La combinazione della deplezione delle cellule magnetiche positive per il lignaggio ematopoietico del midollo osseo prima della FACS e lo smistamento sui cancelli mostrati si traduce nel sequenziamento di singole cellule che sono >90% di stroma. Un esempio di tale esecuzione di seq scRNA (Figura 5A, B) illustra questa bassa contaminazione ematopoietica dopo l'annotazione basata sul trascrittoma delle cellule analizzate (esempi di geni marcatori ematopoietici Figura 5C). Ciò è in netto contrasto con le preparazioni stromali timiche, in cui la deplezione delle cellule magnetiche non è stata eseguita prima della fase di selezione a causa del materiale di partenza limitato nel tessuto timico post-trapianto (Figura 1F).

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Figura 1: Citometria a flusso e sequenziamento dell'RNA a singola cellula dello stroma del timo murino. (A) Quantificazione del numero di timociti in topi di 8 settimane (Controllo), topi di 8 settimane irradiati letalmente e trapiantati 4 giorni prima (trapianto) e topi di 2 anni (Aged). (B) Grafici rappresentativi di citometria a flusso che dimostrino l'arricchimento nei sottotipi di cellule stromali 4 giorni dopo l'irradiazione letale e il trapianto. (C) Strategia di gating della citometria a flusso per ordinare lo stroma del timo murino per l'analisi multiomica a singola cellula. (D) UMAP del timo murino che indica lo stroma (blu) e le cellule ematopoietiche (rosso). (E) UMAP che mostrano geni marcatori ematopoietici murini in campioni di timo. (F) Quantificazione di cellule stromali ed ematopoietiche murine in campioni di scRNAseq del timo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Analisi citofluorimetrica e sequenziamento dell'RNA a singola cellula dello stroma timico umano. (A) Grafici FACS che mostrano risultati rappresentativi dell'impatto di diversi tempi di digestione sul rilascio di popolazioni di cellule stromali timomiche umane. (B) Strategia di gating della citometria a flusso per selezionare lo stroma timico umano per l'analisi multiomica a singola cellula. (C) UMAP del timo umano che indica lo stroma (blu) e le cellule ematopoietiche (rosso). (D) UMAP che mostrano geni marcatori ematopoietici umani in campioni di timo. (E) Quantificazione di cellule stromali ed ematopoietiche umane in campioni di scRNAseq del timo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: I marcatori stromali del midollo osseo murino e la calceina sono utili per stimare l'efficienza della dissociazione. (A) Analisi rappresentativa della citometria a flusso delle cellule stromali murine del midollo osseo CD45-Ter119- gate su tutte le cellule e sulle cellule della calceina+. Con il successivo gating CD31- che mostra una percentuale più elevata di cellule CD140a+CD51+ quando si selezionano le cellule Calceina+. (B) Analisi di citometria a flusso rappresentativa di una digestione ossea fallita con cellule CD140a+CD51+ mancanti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Strategia di gating dello stroma del midollo osseo. (A) Strategia di gating della citometria a flusso per selezionare lo stroma del midollo osseo murino per la multiomica a singola cellula. (B) Analisi di citometria a flusso rappresentativa di una digestione del midollo osseo fallita con cellule CD140a+CD51+ mancanti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Sequenziamento dell'RNA a singola cellula del midollo osseo con composizione delle cellule stromali ed ematopoietiche. (A) UMAP dell'osso murino e del midollo osseo che indica lo stroma (blu) e le cellule ematopoietiche (rosso). (B) Quantificazione di cellule stromali ed ematopoietiche in campioni murini di osso e midollo osseo. (C) UMAP di geni marcatori ematopoietici in campioni di midollo osseo murino. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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Le cellule stromali negli organi ematopoietici sono fondamentali per la normale produzione di sangue e le perturbazioni dello stroma ematopoietico possono causare gravi compromissioni nel mantenimento ematopoietico e nella risposta allo stress 9,23,24. La comprensione delle cellule stromali ematopoietiche è essenziale per comprendere le malattie ematologiche 7,9,10,24 e per la capacità di sviluppare terapie per combatterle 25,26. La separazione riproducibile dello stroma ematopoietico dal parenchima è tuttavia una sfida, in particolare con l'avvento della multiomica a singola cellula che richiede preparazioni di campioni di alta qualità massimizzando la resa e la varietà delle cellule stromali. I protocolli qui descritti sono stati ottimizzati per essere compatibili con la maggior parte delle applicazioni multiomiche a valle, affrontando al contempo le sfide dell'isolamento delle cellule stromali ematopoietiche 1,2,19.

Il primo problema da considerare per l'isolamento delle cellule stromali ematopoietiche sono le condizioni di dissociazione. La dissociazione ottimale è fondamentale per rilasciare le cellule stromali dal tessuto per riflettere la completa eterogeneità del compartimento stromale 1,2. La scelta della giusta miscela di dissociazione dipende dall'ambito sperimentale e dai protocolli a valle. Si consiglia di preparare miscele di dissociazione il più fresche possibile e di tenerle in ghiaccio fino all'uso. Alcuni componenti sono difficili da sciogliere, come la dispasi, e potrebbero richiedere più tempo per la miscelazione delle pipette. Il vortex non è raccomandato in quanto potrebbe interrompere la conformazione nativa degli enzimi della digestione, portando infine alla loro inattivazione. È importante sottolineare che l'EDTA inibisce l'attività enzimatica e deve essere evitato durante le fasi di digestione attiva, ma può essere impiegato per fermare la reazione se l'enzima contenente tampone non può essere rimosso tempestivamente. Oltre alla miscela enzimatica stessa, due punti sono fondamentali per un'efficiente dissociazione dei tessuti, (1) frantumazione e taglio accurati per aumentare la superficie e (2) tempo di incubazione sufficiente con gli enzimi della digestione. Il tessuto timico umano è, ad esempio, significativamente più difficile da dissociare rispetto al tessuto murino e i tempi di digestione devono quindi essere più lunghi. Se non viene effettuato un aggiustamento per il tessuto umano, la resa stromale e la varietà cellulare saranno ridotte (Figura 2A). Gli enzimi di dissociazione richiedono una temperatura ottimale di 37 °C che influenza inevitabilmente l'espressione genica27. Sebbene la dissociazione a freddo o a temperatura più bassa sia auspicabile per conservare gli stati cellulari, attualmente non esistono combinazioni di enzimi di dissociazione freddo-attivi disponibili in commercio adatte all'osso e al midollo osseo. Per qualsiasi tessuto che richiede digestione, l'eterogeneità e il contributo percentuale acquisito dai diversi tipi di cellule cambieranno invariabilmente con il tempo di digestione, la composizione del cocktail enzimatico e l'elaborazione. A valle di queste fasi iniziali, l'eterogeneità e la rappresentazione saranno ulteriormente limitate dalle fasi di filtrazione, come le dimensioni degli ugelli durante lo smistamento e la cattura di tipi di cellule difficili (ad esempio, adipociti dallo stroma) e diametri dei canali dei dispositivi fluidici. Pertanto, quando si confrontano i set di dati, dovremmo essere consapevoli del fatto che queste differenze nei protocolli possono influire sulla rappresentazione delle sottopopolazioni. Ne consegue logicamente che dobbiamo essere vigili nel mantenere uguali le fasi di lavorazione quando misuriamo l'impatto delle perturbazioni nei sistemi stromali.

Mentre il costo del sequenziamento è stato e sta diminuendo, le tecnologie a singola cellula sono spesso limitate dal numero di cellule che possono essere analizzate. Per ottimizzare la capacità di ciascun kit di reagenti, è stata impiegata la deplezione magnetica delle cellule ematopoietiche quando possibile. Ciò consente di evitare un numero elevato di cellule contaminanti che sono molto più numerose dello stroma sia nel midollo osseo che nelle frazioni di campioni di timo. Tuttavia, se il materiale di partenza è limitato, come nel caso del tessuto timico post-trapianto, l'aumento e non specifico della perdita di cellule in cui incorrono invariabilmente le strategie di deplezione magnetica, può renderlo sconsigliabile. Inoltre, durante la preparazione e la digestione dei tessuti, la frantumazione, il taglio e il rilascio enzimatico dei componenti della matrice extracellulare generano una grande quantità di detriti. Questo tipo di contaminante, se lasciato nel campione per l'analisi, può causare problemi di intasamento nella lavorazione a valle, causare pozzetti negativi per lo smistamento dell'indice di singola cellula e gonfiare notevolmente le percentuali di gate padre nell'analisi. La colorazione con calceina è stata utilizzata per il gate positivo per cellule/cellule vive. La calceina è disponibile in diversi colori, il che la rende altamente adattabile alla matrice di colorazione. Quando si lavora con la calceina, fare attenzione a non sottoporre il colorante a ripetuti cicli di congelamento-scongelamento (ad esempio, preparare sempre fresco e conservare a temperatura ambiente dopo lo scioglimento).

La capacità di multiplexare i campioni basati su anticorpi codificati a barre con oligodi DNA 28 consente una maggiore utilità delle reazioni di sequenziamento di singole cellule su piattaforme come 10x Genomics. Gli anticorpi hashtagging progettati per il multiplexing dei campioni sono dotati di diversi bersagli per le molecole della superficie cellulare o della membrana nucleare e di specificità sia per il topo che per l'uomo. Mentre il sistema di hashtagging cellulare è stato utilizzato con successo per più tessuti, gli esperimenti che combinano miscele di enzimi di digestione con il successivo uso di hashtag possono portare a una drastica riduzione del recupero. Abbiamo cercato di includere ulteriori fasi di lavaggio dopo la dissociazione e abbiamo aggiunto EDTA per inibire l'attività degli enzimi della digestione. Tuttavia, anche con questi passaggi, aspettati un'identificazione degli hashtag inferiore rispetto alle cellule ematopoietiche. È stato riscontrato che con i protocolli di digestione enzimatica, i tassi di cattura degli hashtag erano compresi tra il 30% e il 70%. Ciò si verifica nonostante il fatto che lo stesso clone di anticorpo con un coniugato fluorocromo marcato >90% delle cellule stromali nella stessa popolazione. Qualsiasi disegno sperimentale che abbini la digestione enzimatica del tessuto con l'hashtagging dovrebbe essere pilotato e si dovrebbe prendere cautela per garantire l'inibizione enzimatica.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.T.S. è direttore e azionista di Agios Therapeutics e Editas Medicines; fondatore, direttore, azionista e membro del comitato consultivo scientifico di Magenta Therapeutics e LifeVault Bio, azionista e fondatore di Fate Therapeutics e Garuda Therapeutics e direttore, fondatore e azionista di Clear Creek Bio, consulente di FOG Pharma, Inzen Therapeutics e VCanBio e destinatario di finanziamenti per la ricerca sponsorizzati da Sumitomo Dianippon. D.T.S e K.G sono inventori di US20220143099A1 brevettuali.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siamo stati supportati con l'assistenza tecnica di esperti dalla struttura di citometria a flusso HSCI-CRM del Massachusetts General Hospital e dalla struttura Bauer Core dell'Università di Harvard. T.K e K.G sono stati sostenuti dal Consiglio svedese per la ricerca e C.M. dalla Fondazione tedesca per la ricerca. Ringraziamo Sergey Isaev e I-Hsiu Lee per l'assistenza nell'analisi dei dati di sequenziamento dell'RNA a singola cellula.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,25% Tripsina-EDTAThermo Fisher Scientific25200-072
7AAD (7-aminoactinomicina D)BD Biosciences559925
Cocktail di lignaggio anti-umano 3-FITCBD Biosciences643510
Siero bovinoAlbumina Millipore SigmaA9647
C57Bl/6 topiJackson664Maschi o femmine, 8-12 settimane
di Calcein Fisher Scientific65-0853-78
Collagenasi IVMillipore SigmaC5138
Filtri per Cellule Sterili Corning, Bianco, Dimensioni della maglia: 70 &; mFisher Scientific08-771-2
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Soluzione Dnase IThermo Fisher Scientific90083  2500 U/mL
Streptavidina di topo Easysep Kit di isolamento RapidSpheresStemCell Technologies19860
Siero fetale bovinoGibcoA31605-01Qualificato One Shot
Human Fc BlockBD Biosciences564220
Liberase TM Millipore Sigma5401127001Research Grade
Medium 199Gibco12350
Topo anti-umano CD235a-BV77BD Biosciences740785
Topo anti-umano CD31-PE/Dazzle594Biolegend303130
Topo anti-umano CD45-BV77Biolegend304050
Topo anti-umano CD4-BV605BD Biosciences562658
Topo anti-umano CD66b-FITCBD Biosciences555724
Topo anti-umano CD8-APC/Cy7BD Biosciences557760
Topo anti-umano EpCam-BV421Biolegend324220
Protettore Inibitore della RNasiMillipore Sigma3335402001
Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594Biolegend120424
Ratto anti-topo CD11b-BiotinaBiolegend101204
Rat anti-mouse CD140a-APCFisher Scientific17-1401-81
Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Biosciences553142
Rat anti-mouse CD31-BUV737BD Biosciences612802
Rat anti-mouse CD31-BV421Biolegend102424
Ratto anti-topo CD3-BiotinaBiolegend100244
Rat anti-mouse CD45.2-BiotinBiolegend109804
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Anti-topo di ratto CD45R/B220-BiotinBiolegend103204
Anti-topo di ratto CD51-PEBiolegend104106
Anti-topo di ratto EpCam-BV711BD Biosciences563134
Anti-topo di ratto Ly-6A/E(Sca-1)-AF700Biolegend108142
Anti-topo di ratto Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-BiotinBiolegend 108404
Anti-topo di ratto Ter119-BiotinaBiolegend116204
Anti-topo di ratto Ter119-PEBiolegend116208
Anti-topo di ratto Ter119-PE/Cy7Biolegend116222
Stemxyme Worthington BiochemicalLS004107

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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