Ottimizzazione della visualizzazione del trasporto assonale del carico endogeno mediante microscopia a fluorescenza in Caenorhabditis elegans vivente

Summary

L'articolo descrive l'ottimizzazione dei parametri di acquisizione al microscopio a fluorescenza per visualizzare il trasporto assonale di carichi marcati endogeni con risoluzione di un singolo neurone in un nematode vivente.

Abstract

Il trasporto assonale è un prerequisito per trasportare le proteine assonali dal loro sito di sintesi nel corpo cellulare neuronale alla loro destinazione nell'assone. Di conseguenza, la perdita del trasporto assonale compromette la crescita e la funzione neuronale. Lo studio del trasporto assonale migliora quindi la nostra comprensione della biologia delle cellule neuronali. Con i recenti miglioramenti nell'editing del genoma CRISPR Cas9, la marcatura endogena dei carichi assonali è diventata accessibile, consentendo di andare oltre la visualizzazione del trasporto basata sull'espressione ectopica. Tuttavia, la marcatura endogena spesso comporta una bassa intensità del segnale e richiede strategie di ottimizzazione per ottenere dati affidabili. Qui, descriviamo un protocollo per ottimizzare la visualizzazione del trasporto assonale discutendo i parametri di acquisizione e un approccio di sbiancamento per migliorare il segnale del carico marcato endogeno su un fondo citoplasmatico diffuso. Applichiamo il nostro protocollo per ottimizzare la visualizzazione dei precursori delle vescicole sinaptiche (SVP) marcati da RAB-3 marcati con proteina fluorescente verde (GFP) per evidenziare come la regolazione fine dei parametri di acquisizione possa migliorare l'analisi del carico assonale marcato endogenamente in Caenorhabditis elegans (C. elegans).

Introduction

Per tutta la vita, i neuroni si affidano al trasporto assonale per trasportare proteine, lipidi e altre molecole dal corpo cellulare alla loro destinazione finale nell'assone. Di conseguenza, la compromissione del trasporto assonale è associata a una perdita della funzione neuronale ed è spesso coinvolta nella patologia delle malattie neurodegenerative ^1,2. Quindi, comprendere i meccanismi che sono alla base del trasporto assonale è di grande interesse.

Diversi decenni di ricerca sul trasporto assonale hanno rivelato molte importanti intuizioni sul meccanismo molecolare che media questo trasporto, sulla loro composizione e sui meccanismi di regolazione. Il trasporto assonale a lungo raggio avviene sul citoscheletro dei microtubuli, che consiste in polimeri di microtubuli parzialmente sovrapposti che sono tipicamente orientati con la loro estremità positiva negli assoni³. Di conseguenza, il trasporto anterogrado è mediato da proteine motorie che camminano verso l'estremità positiva dei microtubuli, le chinesina, mentre il trasporto retrogrado dipende dal motore della dineina diretta all'estremità negativa. Sebbene siano stati rivelati molti aspetti del trasporto, per molte proteine assonali non è ancora chiaro come vengono caricate nel macchinario di trasporto, come sono organizzati i singoli pacchetti di trasporto e come questo trasporto è regolato³.

Il trasporto assonale è stato inizialmente studiato in esperimenti di radio-marcatura, in cui gli amminoacidi radiomarcati sono stati iniettati nel compartimento somatico, dove sono stati incorporati nelle proteine endogene nascenti e potevano essere rintracciati nel tempo nel compartimento assonale mediante autoradiografia⁴. Sebbene gli esperimenti di radiomarcatura abbiano permesso lo studio del trasporto assonale di proteine endogene in vivo, non consentono il follow-up diretto del comportamento del singolo carico per ottenere intuizioni meccanicistiche⁴. Questa limitazione è stata superata con l'uso della microscopia a fluorescenza. Tuttavia, il trasporto assonale spesso non viene visualizzato sulle proteine endogene, ma piuttosto attraverso l'espressione di una copia marcata fluorescente. Soprattutto per le proteine a bassa espressione, la sovraespressione fornisce intensità di segnale più elevate che rendono possibile la visualizzazione, preferibilmente con risoluzione di un singolo neurone. Inoltre, l'espressione ectopica della proteina marcata in fluorescenza elude la necessità e le sfide dell'editing del genoma. Al contrario, è stato sostenuto che il comportamento del carico espresso ectopicamente può differire dal comportamento del carico endogeno⁵.

I recenti miglioramenti nell'editing del genoma hanno reso più accessibili le strategie di marcatura endogena. Pertanto, una minore intensità del segnale è diventata la principale limitazione per studiare il trasporto assonale di un carico mediante espressione ectopica invece che endogena. Attente considerazioni nella strategia di marcatura endogena abbinate a un'ottimizzazione delle condizioni di acquisizione possono superare questa sfida.

I nematodi forniscono un eccellente modello di ricerca per studiare il trasporto assonale in vivo grazie alla loro trasparenza e facilità nelle manipolazioni genetiche. In questo protocollo, descriviamo una strategia di ricerca per visualizzare il trasporto assonale di proteine endogene con risoluzione di un singolo neurone in Caenorhabditis elegans vivente. Visualizziamo il trasporto assonale dei precursori delle vescicole sinaptiche utilizzando un ceppo generato dal Jorgensen Lab⁶, in cui la RAB GTPasi associata alla vescicola, RAB3, è marcata endogenamente con GFP, nel motoneurone DA9. Chiedendosi in che modo piccoli adattamenti in diversi parametri di acquisizione e il fotobleaching possano migliorare la visualizzazione dei singoli eventi di trasporto, il protocollo fornisce idee su come ottimizzare le condizioni di imaging.

Protocol

Per un protocollo dettagliato su come mantenere e preparare i nematodi per l'imaging di cellule vive, fare riferimento al lavoro di S.Niwa ⁷.

1. Generazione di ceppi di vermi

Oltre a generare ceppi di nematodi, il Caenorhabditis Genetics Center (CGC)⁸ contiene una collezione crescente di ceppi di nematodi con proteine marcate endogenamente in fluorescenza che possono essere ottenute direttamente dalla loro pagina web.

1. Scelta della strategia di marcatura a fluorescenza
   1. Utilizzare il ceppo nematode MTS1161, che contiene l'allele⁶ rab-3 (ox699), per visualizzare la GFP endogena marcata RAB-3 nel motoneurone DA9 (il ceppo verrà depositato al CGC). Per visualizzare altre proteine assonali, generare un ceppo di nematode con una proteina marcata endogena utilizzando il protocollo di editing CRISPR Cas9 del Mello Lab⁹.
      NOTA: MTS1161 utilizza un approccio di ricombinazione per marcare specificamente RAB-3 in modo endogeno con un tag GFP⁶. Un approccio alternativo comune si basa sulla ricostituzione di una proteina fluorescente split, che è raccomandata per proteine particolarmente a bassa espressione in quanto aumenta il numero di copie fluorescenti per proteina endogena utilizzando più copie fluorescenti divise¹⁰. Il numero di copie può essere inizialmente stimato sulla base dei set di dati del trascrittoma dalla pagina web CenGen (https://cengen.shinyapps.io/CengenApp/) ¹¹.
2. Scelta del neurone per visualizzare il trasporto assonale
   1. Nel MTS1161 di deformazione, visualizzare RAB-3 nel motoneurone DA9 (vedi Figura 1). Per altri carichi assonali, in particolare le proteine a bassa espressione, identificare un neurone in cui i livelli di espressione della proteina analizzata sono più alti utilizzando la pagina web CenGen.
      NOTA: Il progetto CenGen (cengen.org) fornisce un'ottima risorsa online per stimare i livelli di espressione di una proteina di interesse in molti neuroni del nematode sulla base di un ampio set di dati trascrittomici che copre tutti i 302 neuroni del sistema nervoso di C. elegans ^12,13.

2. Manipolazione dei vermi e preparazione per l'imaging

1. Mantenere i nematodi su un prato di batteri (ceppo: OP50) seminati su piastre di terreno di crescita dei nematodi a 20 °C e cresciuti fino a un'età di 1 giorno nell'età adulta per l'imaging.
   NOTA: La misurazione del trasporto assonale in una fase di età definita è importante poiché i tassi di trasporto diminuiscono con l'invecchiamento in modo coerente tra diversi carichi assonali, classi di neuroni e organismi.^{I nematodi} 14,15,16,17,18 allo stadio larvale L4 o 1 giorno nell'età adulta sono stati utilizzati nella maggior parte degli articoli e quindi offrono i set di dati più ampi per i confronti.
2. Preparare i nematodi per l'imaging di cellule vive: eseguire tutti i passaggi successivi con uno stereomicroscopio per visualizzare e maneggiare i vermi.
   1. Trasferire i nematodi in una gocciolina di 0,5 mM di Levamisolo utilizzando un plettro di platino e incubare i nematodi per 20 minuti nella gocciolina.
   2. Montare con cautela 10-20 nematodi dalla gocciolina di Levamisolo in una goccia da 12 μl di terreno M9 su un cerotto di agarosio al 10% (disciolto in terreno M9) su un vetrino utilizzando un pizzicotto. Per una procedura dettagliata su come realizzare un cerotto di agarosio al 10%, fare riferimento al protocollo di S.Niwa⁷.
      NOTA: Il montaggio di un numero basso di nematodi è sufficiente poiché verranno esaminati solo pochi animali per vetrino prima che gli animali inizino a soffrire di ipossia.
   3. Posizionare un vetrino coprioggetti sopra la goccia (22 mm x 22 mm o 18 mm x 18 mm). Per il trasporto dell'imaging nell'assone DA9, posizionare l'assone vicino al vetrino coprioggetto. Per fare ciò, ruotare il vetrino coprioggetto di 45° dopo averlo posizionato sopra il cerotto di agar, per far rotolare gli animali sulla schiena.
   4. Sigillare lo spazio tra il vetrino coprioggetto e il vetrino con un gel viscoso come il petrolato. Ciò impedirà l'essiccazione della macchia di agarosio, che può causare la fuoriuscita dei nematodi dal campo di imaging.
      NOTA: È fondamentale trattare gli animali nel modo più delicato possibile. Concentrazioni troppo elevate di levamisolo o danni fisici al verme possono compromettere il trasporto assonale. Lievi contrazioni della coda durante la sessione di imaging sono un buon segno che l'animale rimane in uno stato di salute. Gli animali rimangono sani e possono persino riprendersi dal cerotto di agarosio dopo la sessione di imaging.

3. Microscopia su cellule vive

NOTA: I valori esatti dei parametri di acquisizione possono differire tra i microscopi. Tuttavia, le tendenze per ciascun parametro di acquisizione dovrebbero essere indipendenti dal microscopio utilizzato. In questo protocollo è stato utilizzato un microscopio confocale a disco rotante dotato di una linea laser separata per lo sbiancamento (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli sul microscopio). La fluorescenza verde è stata eccitata da un laser a 488 nm e l'emissione è stata filtrata da un filtro di emissione ET525/36. Lo sbiancamento è stato eseguito utilizzando una linea laser a 488 nm.

1. Assicurarsi che la temperatura della stanza, o se è disponibile un tavolino a temperatura controllata, sia impostata su una temperatura costante. Per i nematodi, impostare la temperatura a 20 °C.
2. Montare il vetrino e utilizzare la lente dell'obiettivo con ingrandimento 4x-20x per localizzare i nematodi sul vetrino e memorizzare le posizioni. Passa all'obiettivo con ingrandimento 63x per l'acquisizione delle immagini.
3. Scatta una singola immagine per controllare i parametri di acquisizione iniziale. Traccia le intensità del segnale nel campo visivo con l'istogramma dell'intensità del software di acquisizione. I valori di intensità devono coprire il terzo più basso del segnale massimo che la telecamera è in grado di rilevare. Evita la saturazione dei pixel. Aumentare l'intensità del laser di eccitazione se l'intensità del segnale è troppo bassa.
   NOTA: Non utilizzare intensità laser di eccitazione troppo elevate in quanto sbianca la proteina fluorescente durante il time-lapse.
4. Modificare il parametro di acquisizione e i passaggi qui per ottimizzare il rilevamento del segnale di fluorescenza.
   1. Implementazione di una fase di sbiancamento: sbiancare la regione dell'assone che verrà analizzata utilizzando una linea laser a 488 nm (potenza:15 mW) per la fase di sbiancamento. Puntare a un'efficienza di sbiancamento di almeno il 90%. Determinare l'efficienza dello sbiancamento confrontando l'intensità del segnale della regione prima e dopo la fase di sbiancamento.
      NOTA: Lo sbiancamento migliora il segnale delle particelle in movimento abbassando il segnale che deriva dalle particelle stazionarie così come il segnale che deriva dalla frazione citoplasmatica della proteina in background. Il carico membranoso, come il RAB-3 sui precursori delle vescicole sinaptiche, ha una bassa frazione citoplasmatica in modo che la fase di sbiancamento migliori solo leggermente il segnale del pacchetto di trasporto sul fondo citoplasmatico (Figura 2A, D). Tuttavia, lo sbiancamento migliora il tracciamento dei singoli eventi di trasporto su distanze maggiori e consente di quantificare i tempi di pausa (Figura 2A).
   2. Binning: utilizzare il binning 2 x 2 per migliorare l'intensità del segnale dei singoli eventi di trasporto. Il binning combina matrici di pixel in un unico pixel più grande. Ciò ridurrà la risoluzione spaziale ma migliorerà l'intensità del segnale dei singoli eventi di trasporto ed è particolarmente utile per le particelle deboli (Figura 2B, D).
   3. Tempo di esposizione: Migliora il tempo di esposizione per migliorare l'intensità del segnale. L'aumento del tempo di esposizione aumenta l'intensità del segnale del campione al costo di ottenere una risoluzione temporale inferiore per gli eventi di trasporto. Per l'esperimento qui, utilizzare una risoluzione temporale da 300 ms a 700 ms tra punti temporali consecutivi (100-500 ms di tempo di esposizione) per seguire i singoli eventi di trasporto di RAB-3. (Figura 2C,D)
5. Registrazione time-lapse: eseguire un intervallo di tempo di almeno 1-3 minuti a seconda dell'intensità del segnale della proteina e della frequenza dei singoli eventi di trasporto. Una volta registrato un lasso di tempo, passare all'animale successivo. Gli animali su un vetrino non devono essere ripresi per più di 30 minuti per garantire che gli animali registrati siano in uno stato di salute.
   NOTA: Lievi contrazioni della coda dell'animale durante la registrazione sono un indicatore che l'animale è ancora vivo.

4. Analisi dei dati di trasporto assonale

NOTA: Utilizzare ImageJ/Fiji¹⁹ per le successive fasi di analisi delle immagini. Fiji è in grado di leggere i dati da tutti i comuni pacchetti software di microscopia.

1. Generazione del chimografo
   1. Importa dati: importa il file di dati time-lapse nelle Fiji. Nel caso in cui non sia possibile importare i dati nelle Fiji, esportare la registrazione dell'ora come file tiff dal pacchetto software e caricarla successivamente nelle Fiji.
   2. Correzione della deriva: controlla se il segmento animale/assone si è spostato o leggermente spostato durante l'acquisizione dell'immagine. Correggi il movimento o la deriva degli animali eseguendo il plug-in StackReg²⁰. Quando si esegue il plug-in, scegliere la trasformazione Corpo rigido .
   3. Generazione manuale di un chimografo: una procedura dettagliata passo dopo passo è fornita nella Figura 3. Utilizza il filmato corretto dalla deriva per generare il chimografo. Utilizzare lo strumento Linea segmentata e regolare la larghezza della linea in modo che corrisponda al diametro dell'assone facendo doppio clic con il pulsante sinistro del mouse sull'icona della linea segmentata per disegnare una linea lungo il segmento dell'assone che verrà analizzata. Esegui il plug-in ImageJ/Fiji Kymoreslicewide per generare il chimografo e utilizzare il valore di intensità massima su tutta la larghezza della linea nelle impostazioni dei parametri.
      NOTA: Mantenere la coerenza nella direzione di disegno della linea (ad esempio, sempre prossimale all'assone distale o inverso) semplifica il tracciamento della direzione del movimento a ritroso nei chimografi.
2. Analisi dei parametri di trasporto
   1. Calcolare il parametro di trasporto: numero di evento, velocità, lunghezza di corsa e durata della pausa dal chimografo seguendo i passaggi successivi.
      1. Traccia gli eventi di trasporto nel chimografo: utilizzare lo strumento Linea retta per tracciare i singoli eventi di trasporto sul chimografo. Salva ogni riga nel gestore ROI e traccia tutti gli eventi di trasporto nel chimografo. Scegliere i seguenti parametri di misurazione in ImageJ/Fiji: Area, Rettangolo di delimitazione, Valore medio di grigio, Diametro di Feret.
      2. Calcola parametro di trasporto: incolla la tabella dei risultati in un foglio di calcolo e utilizza le seguenti colonne delle sezioni dei risultati per calcolare:
         Lunghezza della tiratura: moltiplica la larghezza (in pixel) per la risoluzione della fotocamera (ad esempio, x μm/pxl) per determinare la lunghezza della tiratura in μm.
         Velocità: lunghezza della corsa/durata della corsa. Per determinare la durata di un evento di movimento in secondi, moltiplicare l'altezza (in pixel) per il tempo di acquisizione tra punti temporali consecutivi (ad esempio, x s/pixel).
         Tempo di pausa: durata dell'esecuzione tra due movimenti consecutivi in cui la velocità è 0.
         Numero di eventi: gli eventi totali possono essere normalizzati alla lunghezza totale del chimografo per determinare il numero di eventi al minuto e il segmento di lunghezza dell'assone. Gli eventi possono essere ulteriormente classificati in eventi di trasporto anterogradi e retrogradi. Per determinare la direzionalità di ogni evento di movimento, utilizzare lo strumento Angolo di Feret. Nei chimografi che sono stati inizialmente generati disegnando la linea segmentata da prossimale a distale e gli eventi di trasporto anterogrado nel chimografo puntano da destra a sinistra, un angolo di Feret < 90° indicherà un evento anterogrado e >90° un evento retrogrado, altrimenti sarà l'inverso.

Results

Panoramica del sistema modello e della procedura di misurazione
Per visualizzare il trasporto assonale dei precursori delle vescicole sinaptiche, abbiamo tracciato endogenamente il RAB-3 marcato con GFP. Qui facciamo uso di un ceppo⁶ di GFP::Flip-on::RAB-3 generato di recente, in cui l'espressione della ricombinasi Flippasi sotto un promotore specifico cellulare (glr-4p) etichetta il RAB-3 endogeno nel motoneurone DA9. DA9 è un motoneurone bipolare, con il suo corpo cellulare situato nella parte posteriore dell'animale sul lato ventrale, vicino all'ano (Figura 1A). Contiene un corto dendrite che corre anteriormente lungo il cordone nervoso ventrale e un lungo assone che corre posteriormente, forma una commessura e poi corre anteriormente lungo il cordone nervoso dorsale, dove forma sinapsi en passant che innervano il muscolo dorsale e il neurone VD 22,23,24. Visualizziamo il trasporto assonale nella regione asinaptica; la maggior parte degli eventi di trasporto può essere catturata con un singolo piano focale (Figura 1A). Viene attuata una fase iniziale di foto-sbiancamento per ridurre lo sfondo delle vescicole stazionarie in quest'area, che spesso tendono a fermarsi in questa regione (Figura 1B). I video time-lapse vengono registrati nell'arco di 3 minuti e il segnale RAB-3 lungo la regione asinaptica viene tracciato in un chimografo per estrarre i singoli eventi di trasporto (Figura 1C).

Regolazione dei parametri di acquisizione per ottimizzare la visualizzazione del trasporto assonale
Per superare la bassa intensità del segnale di molte proteine marcate con fluorescenza endogena, i parametri di acquisizione del microscopio devono essere ottimizzati. Per una solida quantificazione degli eventi di trasporto, l'intensità del segnale dei singoli eventi di trasporto deve essere il più luminosa possibile sul fondo citoplasmatico o in pausa e sul carico stazionario. I precursori delle vescicole sinaptiche spesso si fermano nella regione asinaptica in pool di vescicole distinte, che interferiscono con l'individuazione di nuove vescicole in arrivo e rendono difficile seguire le loro tracce di trasporto⁷.

Una singola fase iniziale di sbiancamento della fluorescenza può ridurre fortemente il segnale di fluorescenza derivante dai pool di vescicole per migliorare il rilevamento del movimento di nuove vescicole in arrivo (Figura 2A). La fase di sbiancamento ha solo leggermente aumentato il segnale del movimento delle vescicole di RAB-3 oltre l'intensità del fondo citoplasmatico, probabilmente perché la frazione citoplasmatica di RAB-3 è molto bassa (Figura 2D).

L'uso del binning fornisce un livello aggiuntivo per migliorare il segnale sullo sfondo dei singoli eventi di trasporto combinando una matrice di pixel in un singolo pixel. Un binning 2 x 2 dimezzerà la risoluzione spaziale (qui da 108,33 nm/pixel a 216,7 nm/pixel), che è ancora sufficiente per tracciare le singole particelle di trasporto RAB-3 (Figura 2B) ma migliora notevolmente l'intensità del segnale delle singole vescicole (Figura 2D). A meno che non sia richiesta una risoluzione spaziale molto elevata, il binning può essere applicato anche per visualizzare molti altri carichi assonali.

Successivamente, ci siamo chiesti in che modo le variazioni del tempo di esposizione possono migliorare l'intensità del segnale dei singoli eventi di trasporto. Abbiamo incluso in particolare il tempo di esposizione nell'analisi per dimostrare che un tempo di esposizione fino a 500 ms con 700 ms tra i successivi punti temporali di imaging fornisce ancora una risoluzione temporale alla quale i precursori delle vescicole sinaptiche possono essere tracciati (Figura 2C, D).

Generazione e analisi di chimografi con Fiji
Per generare un chimografo e analizzare i singoli eventi di trasporto, attenersi alla procedura descritta nella Figura 3.

Figura 1: Panoramica del sistema modello per visualizzare il trasporto assonale di RAB-3 fluorescente endogeno. (A) Pannello superiore: Panoramica del nematode con indicato l'asse posteriore-anteriore e ventrale-dorsale. Il motoneurone DA9 è etichettato in blu. Pannello centrale: ingrandisce la regione in scatola mostrata nel pannello superiore con la compartimentazione DA9 indicata. Le sinapsi en passant sono illustrate in verde, * indica l'ano. Si noti che l'assone continua nel cordone nervoso dorsale fino a quando non supera la vulva. La casella rossa indica la regione della zona asinaptica. Pannello inferiore: Immagine al microscopio confocale di GFP endogena marcata con RAB-3 nell'assone prossimale su un singolo piano focale. Si noti che ci sono pozzi di vescicole di RAB-3 in pausa più lunga nella regione asinaptica, sebbene la maggior parte dei gruppi di segnali RAB-3 nella regione sinaptica. La regione asinaptica è inscatolata in rosso. Scala: 20 μm. (B) Immagini rappresentative di una registrazione time-lapse per visualizzare il trasporto assonale. Per migliorare la tracciabilità delle singole particelle di trasporto su particelle stazionarie, la regione asinaptica viene inizialmente fotosbiancata. I pannelli inferiori nella regione del riquadro viola mostrano un esempio di un evento di movimento anterogrado (punta di freccia arancione) e retrogrado (punta di freccia blu). I pannelli dall'alto verso il basso rappresentano punti temporali consecutivi. (C) La registrazione time-lapse in (B) è stata tracciata come un chimografo (rappresentazione 2D del tempo sulla posizione). Le linee diagonali rappresentano eventi di movimento in cui la pendenza indica la velocità. Le linee verticali mostrano gli eventi stazionari. Il riquadro viola è uno zoom avanti del chimografo per evidenziare gli eventi di trasporto che sono mostrati anche in (B) e gli eventi di trasporto anterogrado (arancione) e retrogrado (blu) sono tracciati. Le linee verticali tratteggiate indicano gli eventi di pausa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Ottimizzazione delle fasi e dei parametri di acquisizione per migliorare la visualizzazione del carico assonale endogeno. Le GFP::RAB-3 endogene sono state visualizzate nella zona asinaptica dell'assone DA9 scattando immagini di un singolo piano focale su un microscopio confocale a disco rotante. I chimografi sono stati acquisiti per visualizzare i singoli eventi di trasporto in direzione anterograda (da destra a sinistra) e retrograda (da sinistra a destra) (A-C). (A) I chimografi mostrano gli eventi di trasporto RAB3 senza (chimografi sinistri) o con una fase di sbiancamento integrata. Si noti che la fase di sbiancamento migliora la visualizzazione degli eventi di pausa (indicati da punte di freccia gialle) tra eventi di trasporto consecutivi (punte di freccia arancioni). (B) L'implementazione del binning 2 x 2 aiuta a migliorare l'intensità del segnale degli eventi di trasporto RAB3 deboli. Le immagini sono state acquisite con un tempo di esposizione di 300 ms e con (C) un aumento incrementale del tempo di esposizione (da 100 ms all'estrema sinistra a 500 ms all'estrema destra) aiuta a migliorare l'intensità del segnale dei singoli eventi di trasporto. Le immagini sono state acquisite con binning 2 x 2 e utilizzando una fase iniziale di fotosbiancamento. Tutti i chimografi mostrano una durata totale di 3 minuti e sono disegnati alla stessa scala in modo che i chimografi con meno punti di tempo di acquisizione a causa di un intervallo di tempo più lungo tra punti di imaging consecutivi abbiano una lunghezza totale del chimografo più breve. (D) Quantificazione dell'intensità del segnale per evento di trasporto dopo sottrazione della fluorescenza di fondo dai chimografi in (A-C). Si noti che il binning e il passaggio di sbiancamento fotografico sono stati acquisiti con un tempo di esposizione di 300 ms. Confronto statistico utilizzando n eventi per 100 ms (n_eventi = 27 in n_animali = 2), 200 ms (n_eventi = 30 in n_animali = 2), 300 ms (n_eventi = 88 in n_animali = 6), 500 ms (n_eventi = 12 in n_animali = 1), 300 ms senza (w.o.) binning (n_eventi = 31 in n_animali = 3), 300 ms con (w) binning (n_eventi = 88 in n_animali = 6) e 300 ms, Binning 2 x 2 con sbiancamento (n_eventi = 88 in n_animali = 6) e senza sbiancamento. Ogni punto dati rappresenta l'intensità del segnale di un singolo evento di trasporto di RAB-3 dopo la sottrazione di fondo (citoplasma dell'assone) in un singolo punto temporale lungo la sua traccia che è stato scelto casualmente. Il tempo di esposizione è stato confrontato utilizzando un test di Kruskal-Wallis seguito dal confronto multiplo di Dunn, il binning e il photo bleaching sono stati confrontati utilizzando un test di Mann-Whitney a coppie. Le barre di errore indicano la deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Procedura passo passo per generare un chimografo e misurare i singoli eventi di trasporto. (A) Dopo aver caricato la registrazione video nelle Fiji, lo strumento della linea segmentata viene utilizzato per tracciare una linea lungo la lunghezza del segmento assonale che verrà analizzato. (B) Un chimografo (pannello di destra) viene generato utilizzando il plug-in Kymoreslicewide con i parametri illustrati nel pannello di sinistra. (C) I singoli eventi di trasporto vengono tracciati con lo strumento di linea lineare e memorizzati nel gestore del ROI. Il pannello di destra mostra le impostazioni di misurazione utilizzate per generare la tabella dei risultati. (D) I risultati nella tabella vengono utilizzati per calcolare il parametro di trasporto. Le caselle indicano i parametri importanti descritti nella sezione dei metodi del protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Limitazioni del metodo e metodi alternativi
In questo protocollo, abbiamo ottimizzato i parametri di acquisizione per visualizzare il trasporto assonale di RAB-3 marcato endogenamente, che è associato ai precursori delle vescicole sinaptiche. Per visualizzare RAB-3, abbiamo fatto uso di un ceppo⁶ di FLIP-on::GFP::RAB-3 pubblicato di recente e abbiamo espresso la ricombinasi Flippasi sotto un promotore specifico per la cellula (glr-4p)²⁵. Questa strategia ci permette di marcare RAB-3 con un singolo fluoroforo GFP. RAB-3 è relativamente facile da visualizzare perché è altamente espresso e fortemente arricchito sui precursori delle vescicole sinaptiche, in modo che i singoli eventi di trasporto abbiano un'intensità di segnale brillante rispetto a un segnale basso che deriva dal fondo citoplasmatico. Altre proteine assonali potrebbero richiedere ulteriori strategie di ottimizzazione al di fuori delle impostazioni di microscopia per consentire la visualizzazione degli eventi di trasporto. Soprattutto per le proteine a bassa espressione, il sistema split-GFP offre un'ottima alternativa. In questo sistema, la GFP₁₁ è inserita nel locus endogeno della proteina di interesse e la GFP_1-10 è espressa da un promotore specifico della cellula. Un grande vantaggio di questo sistema è la piccola dimensione del modello di riparazione del DNA (circa 70 nucleotidi) che deve essere inserito genomicamente, il che rende la ricombinazione omologa più efficiente rispetto all'inserimento dell'ORF dell'intero tag fluorescente^26,27. A causa delle sue piccole dimensioni, più frammenti di GFP₁₁ possono essere inseriti nella proteina endogena, il che amplifica il numero di fluorofori GFP ricostituiti per proteina e quindi aumenta il segnale fluorescente della proteina endogena e quindi del pacchetto di trasporto²⁸.

Oltre a marcare la proteina con un approccio split-GFP o GFP, possono essere utilizzati altri fluorofori geneticamente codificati che presentano vantaggi e svantaggi unici per quanto riguarda le loro proprietà fotochimiche, che sono stati recentemente confrontati²⁹. Inoltre, i fluorofori chimici con proprietà più fotostabili possono essere utilizzati etichettando endogenamente la proteina di interesse con un tag HALO o SNAP³⁰.

Soprattutto per le proteine citoplasmatiche che sono abbondanti in tutto l'assone, potrebbe essere necessario un approccio di marcatura condizionale. Recentemente abbiamo visualizzato un tale carico, la spettrorina endogena, mediante microscopia a fluorescenza utilizzando la marcatura temporalmente controllata per visualizzare solo nuove proteine spettrine sintetizzate. Per la marcatura condizionale con risoluzione di un singolo neurone, abbiamo combinato l'espressione guidata dallo shock termico di una ricombinasi con un sistema split-GFP³¹.

Se l'obiettivo della ricerca è quello di comprendere il trasporto degli organelli, l'espressione di un dominio proteico che si associa all'organello può fornire un'alternativa all'espressione ectopica della proteina a lunghezza intera.

Passaggi critici nel protocollo
Un'attenta preparazione per ottimizzare la visualizzazione della proteina in base ai livelli di espressione attesi e per scegliere la strategia di marcatura ottimale è particolarmente critica per il successo della visualizzazione delle proteine marcate endogene. I livelli di espressione per la maggior parte delle proteine in molti neuroni possono essere stimati sulla base del set di dati trascrittomici di Cengen¹³. La bassa intensità del segnale prevista degli eventi di trasporto per proteine a bassa espressione o citoplasmatiche può essere migliorata attaccando più copie del fluoroforo. Si noti, tuttavia, che con qualsiasi esperimento di marcatura, è necessario prestare attenzione a non interrompere la funzione della proteina marcata. Nel caso in cui esista un fenotipo noto per il mutante corrispondente, è importante verificare che l'etichettatura non generi questo fenotipo. Nei casi in cui non esiste un fenotipo noto, sono necessari approcci alternativi che variano da caso a caso.

Un passaggio critico nell'imaging degli eventi di trasporto assonale è lo stato di salute dell'animale. Gli animali devono essere trattati il più delicatamente possibile per la preparazione dell'immagine e durante l'imaging (ad esempio, l'uso di uno stuzzicacapelli invece di un filo metallico per trasferire gli animali paralizzati, riducendo al minimo il tempo di incubazione nell'agente paralizzante, riducendo al minimo il tempo di imaging per evitare la fototossicità).

Modifiche e risoluzione dei problemi
Mentre intendiamo ottimizzare la visualizzazione del trasporto assonale di proteine endogene, le strategie di ottimizzazione per i parametri di acquisizione sono applicabili anche alle proteine espresse ectopiche. Soprattutto se i livelli di espressione endogena sono troppo bassi per visualizzare gli eventi di trasporto, l'espressione ectopica della proteina può fornire un'alternativa.

Nel caso in cui non sia possibile registrare eventi di trasporto nonostante una forte intensità del segnale della proteina marcata endogena, gli animali potrebbero essere in uno stato di cattiva salute. Questo può essere risolto preparando gli animali per la microscopia con procedure di preparazione più delicate (ad esempio, riducendo il tempo di incubazione nell'agente paralizzante). In alternativa, gli eventi di trasporto potrebbero essere rari e una registrazione video di 3 minuti potrebbe non essere sufficiente per acquisire gli eventi. L'acquisizione di eventi di trasporto rari può essere ottimizzata aumentando la durata della registrazione video, aumentando il numero di animali ripresi o visualizzando gli animali in una fase di sviluppo diversa in cui gli eventi di trasporto potrebbero essere più frequenti.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarosio	Sigma-Aldrich	A9539
Vetrini coprioggetti (22 mm x 22 mm, No1); Vetro copri sigillo d'oro	Thomas Scientific	6672A14
Levamisole	ChemCruz	sc-205730
Microscopio: microscopio invertito Nikon Ti2, testina di scansione Yokogawa CSU-W1 SoRa, fotocamera Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS, obiettivo a immersione in olio Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA, scanner per fotostimolazione Nikon a 488 nm con filtro di emissione ET525/36	Microscopio
NIS-elements AR	Nikon		Software per la Nikon Ti2
Vetrini per microscopia semplici prepuliti	Thermo Scientific	420-004T
Ceppo di nematodi	Identificatore	Fonte
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)	Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)	MTS1161	Sarà depositato presso CGC (https://cgc.umn.edu/)