Isolamento delle cellule primarie di Müller gliali retiniche di topo

Le cellule di Müller (MC) sono le principali e più abbondanti cellule gliali presenti nel tessuto retinico. Sono i principali attori nel fornire integrità strutturale e funzioni metaboliche all'interno della retina¹. La struttura strategica delle MC è distribuita su tutto lo spessore della retina, fornendo così supporto alla retina. Oltre alle loro proprietà simili a impalcature, hanno funzioni metaboliche per i neuroni retinici, fornendo loro substrati energetici, tra cui glucosio e lattato. Queste funzioni sono fondamentali per mantenere una sana funzione neuronale. È stato riportato che le MC compromesse contribuiscono a varie malattie della retina, tra cui la degenerazione maculare legata all'età, la retinopatia diabetica e il glaucoma ^2,3. Le MC possono essere fonti cellulari endogene per la terapia rigenerativa nella retina¹. Comprendono anche una parte significativa della retina e forti prove suggeriscono che in diverse specie, queste cellule possono essere stimolate a sostituire i neuroni mancanti². Collaborano in modo benefico con i neuroni e le estremità delle cellule di Müller, ramificate coniche, disintegrano densamente i vasi sanguigni e collegano i componenti neurali della retina. Al fine di mantenere lo sviluppo neuronale e la plasticità neuronale, le cellule di Müller agiscono come un substrato morbido per i neuroni, proteggendoli dai traumi meccanici³. Inoltre, in circostanze patologiche, le cellule di Müller possono differenziarsi in progenitori neurali o cellule staminali che replicano o rigenerano i fotorecettori e i neuroni persi ^2,3,4. Le cellule di Müller conservano le caratteristiche delle cellule staminali retiniche, inclusi diversi livelli di potenziale di autorinnovamento e differenziazione ^5,6. La cellula gliale di Müller ha un significativo lignaggio retinico che produce fattori neurotrofici, assorbe e ricicla i neurotrasmettitori, tampona spazialmente gli ioni e mantiene la barriera emato-retinica per mantenere la retina in omeostasi ^7,8,9. Ciò evidenzia il potenziale delle cellule di Müller come strumento promettente nelle terapie cellulari per il trattamento di malattie legate alla degenerazione retinica. Le cellule di Müller sono la glia primaria distribuita in tutta la retina, che si collega sia ai neuroni che ai vasi sanguigni. Svolgono un ruolo protettivo cruciale, fornendo un supporto strutturale e metabolico essenziale per mantenere la vitalità e la stabilità delle cellule retiniche. Purtroppo, in letteratura si trovano pochissimi protocolli per l'isolamento primario delle cellule di Müller dalla retina^10,11.

Presentiamo un approccio avanzato per isolare e coltivare in modo affidabile le cellule primarie di Müller di topo. Questo protocollo è stato utilizzato nel nostro gruppo per isolare le cellule di Müller dai topi C57BL/6 wild-type e dai topi transgenici^12,13. Per questo protocollo vengono utilizzati topi di età compresa tra 5 e 11 giorni, senza preferenze di sesso. Le celle sono state attraversate fino a 4 volte; tuttavia, a P4 smettono di aderire al pallone e diventa difficile coltivare una coltura sana. La coltura è spesso contaminata da cellule epiteliali pigmentate retiniche (RPE), quindi le cellule devono essere fatte passare almeno una volta prima di eseguire ulteriori esperimenti sulla linea cellulare. Il passaggio consente un ulteriore isolamento dai contaminanti. Pertanto, il protocollo presentato offre un modo rapido ed efficace per isolare le cellule di Müller di topo, che possono quindi essere utilizzate come piattaforma affidabile per la ricerca di bersagli terapeutici e la valutazione di potenziali trattamenti per le malattie della retina¹⁴.

Tutti gli esperimenti con gli animali sono conformi alla dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva e sono stati eseguiti seguendo il nostro protocollo sugli animali approvato dall'Institute for Animal Care and Use Committee (IACUC) e dalle politiche dell'Università di Oakland (numero di protocollo 2022-1160)

1. Preparazione dei terreni e della soluzione

1. Preparare la soluzione Müller cell eye integrando il Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, dettagli nella tabella dei materiali) con penicillina/streptomicina alla diluizione di 1:1000. Ad esempio, per 10 ml di DMEM, aggiungere 10 μl di penicillina/streptomicina.
   NOTA: Questo è un semplice terreno di coltura senza siero preparato. Inoltre, riscaldare l'intero terreno in un bagno d'acqua a 37 °C prima di utilizzarlo per il lavoro di coltura cellulare.
2. Preparare un terreno di coltura cellulare Müller primario completo integrando DMEM con il 10% di siero fetale bovino (FBS, inattivato termicamente) e l'1% di penicillina/streptomicina. Ad esempio (500 ml di terreno DMEM + 50 ml di FBS + 5 ml di penicillina/streptomicina).
3. Preparare una soluzione di tripsina-EDTA allo 0,05% con collagenasi IV a una concentrazione di 200 U/mL (la tripsina-EDTA viene utilizzata per sciogliere la quantità calcolata di collagenasi IV polvere per raggiungere la concentrazione necessaria).

2. Enucleazione

1. Sopprimere eticamente il topo utilizzando l'inalazione di CO₂ seguendo le linee guida IACUC.
   1. In breve, posizionare l'animale (o gli animali) nella camera CO₂ per introdurre il 100% di CO₂ a una velocità di riempimento del 30-70% del volume / min della camera con CO₂ per raggiungere l'obiettivo di una rapida perdita di coscienza entro 2-3 minuti con il minimo disagio per i topi.
   2. Poiché i topi sono in giovane età (~ 10 giorni), eseguire la lussazione cervicale come metodo secondario per garantire una corretta eutanasia.
2. Dopo aver sterilizzato l'area di lavoro con etanolo al 70%, posizionare il mouse su un sottopiede sterile.
3. Estrarre gli occhi posizionando le braccia delle pinzette nella parte posteriore dell'occhio, tirando delicatamente dall'area orbitale ed enucleando gli occhi applicando pressione con una pinzetta stile 5/45 sull'area orbitale per causare la proptosi.
   NOTA: Sterilizzare gli strumenti di dissezione con etanolo al 70% seguito da soluzione salina tampone fosfato prima della dissezione.
4. Assicurarsi che il nervo ottico sia ancora collegato all'occhio enucleando lentamente l'occhio. Assicurati di tirare il nervo ottico (identificato visivamente come un cordone bianco) dietro l'occhio.
   NOTA: Questo passaggio non deve essere eseguito al microscopio e può essere eseguito su un banco sterilizzato.

3. Trattamento degli occhi enucleati

1. Coprire una provetta da centrifuga da 15 mL con un foglio di alluminio e riempire la provetta con 10 mL della soluzione oculare cellulare Müller.
2. Porre gli occhi sezionati nella provetta da 15 mL contenente la soluzione per l'occhio cellulare di Müller e lasciarli riposare per una notte, o circa 18 ore, a temperatura ambiente.
3. Dopo 18 ore, decantare la soluzione oculare e sciacquare brevemente gli occhi con 2-3 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) riscaldata (37 °C).
4. Decantare il PBS e spostare gli occhi su una piastra di Petri da 100 mm contenente 10 ml di soluzione di tripsina. (preparato al punto 1.3).
   NOTA: La tripsina viene utilizzata su tutto l'occhio enucleato, agendo come agente dissociativo per facilitare la separazione cellulare dagli strati retinici durante la dissezione. La retina sezionata ha molte cellule, comprese le cellule RPE, che sono appiccicose e hanno maggiori probabilità di contaminare la coltura cellulare di Müller¹⁴. L'esame microscopico ha dimostrato chiaramente che dopo 5 giorni di isolamento (durante il primo cambio di terreno), le cellule RPE si sono staccate dalla piastra e sono morte¹³. Il terreno utilizzato per l'isolamento dell'RPE è il DMEM/F-12, con una composizione diversa rispetto al DMEM (utilizzato nell'isolamento delle cellule di Müller), contenente piruvato di sodio e basso contenuto di glucosio.
5. Mettere la capsula in un'incubatrice e incubare per 1,5-2 ore a 37 °C e 5% di CO₂.
6. Dopo l'incubazione, trasferire gli occhi in una piastra di Petri da 60 mm contenente circa 5 mL di terreno di coltura cellulare Müller primario completo.

4. Dissezione

NOTA: Questa procedura deve essere eseguita all'interno dell'ambiente sterile della cappa di coltura. Pertanto, è essenziale sterilizzare accuratamente le superfici della cappa con alcol al 70%, insieme a tutti gli strumenti e al microscopio di dissezione. Vale la pena notare che il video è stato registrato all'esterno del cofano per una migliore visibilità e una dimostrazione più chiara.

1. Metti un piccolo pezzo di tessuto sterilizzato da laboratorio nel piatto per aiutare a stabilizzare gli occhi durante la dissezione. Posizionare gli occhi sotto un microscopio da dissezione per iniziare la dissezione.
   NOTA: L'uso di tessuto di laboratorio facilita la manovra degli occhi in un piatto pieno di liquido (terreno completo), garantendo una dissezione precisa.
2. Usa le forbici Vannas e le pinzette in stile M5S per rimuovere il tessuto connettivo, i muscoli extraoculari e il nervo ottico.
   1. Afferra l'occhio con una pinzetta stile M5S e fai un'incisione nella sezione ora serrata con le forbici Vannas o l'ago di una siringa.
      NOTA: C'è una linea circolare azzurra tra la parte anteriore e quella posteriore dell'occhio chiamata ora serrata, che può essere utilizzata come punto di riferimento per una direzione accurata durante la dissezione.
   2. Afferrare l'incisione con una pinzetta stile M5S e tirare o strappare la cornea dalla parte posteriore dell'occhio. Tirare in piccoli incrementi per garantire che l'integrità della retina rimanga intatta.
      NOTA: Questi passaggi servono a rimuovere la parte anteriore dell'occhio (cornea, iride e cristallino) dalla parte posteriore della conchiglia oculare (retine neurali e pigmentate).
   3. Per mantenere l'integrità degli strati retinici, tirare delicatamente e rimuovere l'epitelio pigmentato retinico dalla retina neurale. La retina neurale dovrebbe essere priva di macchie nere per garantire il più possibile la purezza dell'isolamento, poiché lo strato di RPE è solitamente appiccicoso e attaccato alla retina neuronale.
   4. Tagliare la retina neurale sezionata in piccoli pezzi prima di raccoglierla in una piastra per garantire una diffusione omogenea delle cellule sulla piastra.
3. Placcare le retine neurali in un pallone T25 contenente 4 mL di terreno di crescita delle cellule Müller primarie complete.
4. Infine, porre il matraccio in un incubatore e incubare a 37 °C e 5% di CO₂.

5. Coltura di cellule gliali primarie di Müller

1. Non spostare il pallone per 3-5 giorni per favorire la crescita cellulare.
2. Cambiare il terreno dopo il quinto giorno e successivamente a giorni alterni fino a quando le celle non sono confluenti al 90%.

6. Passaggio di cellule gliali primarie di Müller

1. Aspirare il terreno di coltura cellulare Müller, seguito da 2 mL di lavaggio in PBS, e aspirare il PBS. Aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% (1x), o quanto basta per coprire la piastra.
2. Incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
3. Assicurarsi che le cellule siano staccate dalla piastra al microscopio. Quindi, raccogliere la sospensione cellulare e aggiungere 4 mL di terreno di coltura cellulare Müller primario completo preriscaldato (37 °C) (preparato nella fase 1.2) nella provetta di raccolta.
4. Centrifugare per 7 min a 300 x g. Dopo aver aspirato il surnatante, risospendere il pellet in 10 mL di terreno di coltura cellulare Müller primario completo. Poiché il numero di cellule può variare in base al numero di occhi sezionati, quindi, è meglio contare le cellule prima della semina e dell'incubazione. La densità di semina consigliata è di 3,0 x 10⁶ celle in un pallone T75.
   NOTA: Le celle possono essere passate fino a 4-5 volte. Tuttavia, i risultati più coerenti dell'esperimento si trovano dopo 1-2 passaggi.

7. Immunofluorescenza

NOTA: Utilizzare il protocollo di immunofluorescenza per colorare e convalidare la specificità delle cellule di Müller. Ecco una breve panoramica del protocollo di immunofluorescenza. Questo passaggio viene eseguito dopo il primo passaggio¹².

1. Seminare le cellule in un vetrino per camera di coltura cellulare (30.000 cellule per pozzetto per un vetrino da 8 pozzetti).
2. Coltura delle cellule isolate per 24-48 ore in un terreno di coltura cellulare Müller completo (preparato nella fase 1.2) a 37 °C e 5% di CO₂.
3. Aspirare il terreno e lavare il vetrino della camera con 250-300 μl di 1x PBS su ciascun pozzetto quando le celle sono confluenti all'80-90%.
4. Fissare il vetrino per 10-15 minuti in 250-300 μl di paraformaldeide al 4% su ciascun pozzetto, quindi lavare con PBS/TX-100 (5 minuti ciascuno/3x).
5. Aggiungere il tampone di blocco per 1 ora a 37 °C (vedere la tabella dei materiali).
6. Aspirare la soluzione bloccante, quindi aggiungere gli anticorpi primari specifici per le cellule di Müller per confermare la purezza delle cellule isolate utilizzando glutammina sintetasi e vimentina ^5,12. Incubare per 3 ore a 37 °C (utilizzando una concentrazione di anticorpi di 1:100-1:200 in tampone bloccante in un volume di 150-200 μL/vetrino). Lavare il vetrino con lavaggi PBS/TX-100 (5 e 10 minuti ciascuno).
   NOTA: Questi anticorpi sono stati scelti in quanto sono segni distintivi per identificare le cellule di Müller e garantire il successo e la purezza della coltura cellulare di Müller.
7. Aggiungere l'anticorpo secondario (con una concentrazione di anticorpi compresa tra 1:1000 in tampone bloccante in un vetrino da 150-200 μl/vetrino) e incubare per 1 ora a 37 °C. Quindi, lavare con PBS/Triton X-100, tre volte (5-10 minuti ciascuna).
8. Applicare una goccia di terreno di montaggio DAPI per etichettare i nuclei prima di coprire il vetrino con un vetrino coprioggetti. Evitare la formazione di bolle d'aria quando si posiziona il vetrino coprioggetti.
9. Utilizzare un microscopio a fluorescenza per controllare il vetrino e acquisire le immagini (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: le celle sono localizzate con DAPI a ex/em 359/461 con ingrandimento 10x per localizzare le celle; Un ingrandimento più elevato può catturare le cellule. Altre lunghezze d'onda dipenderebbero dal colore scelto. Colore verde (GFP) - ex/em 488/510. Colore rosso (Cy3) - ex/em 555/569.

Validazione della specificità, della purezza e della funzione barriera delle cellule di Müller isolate
Per confermare la vitalità, la morfologia e le qualità distintive delle cellule di Müller isolate, le cellule sono state esaminate al microscopio ottico. Sono state registrate immagini P0 e P1 (Figura 1A). Per verificare la contaminazione delle cellule Müller isolate con le cellule RPE e confermarne la purezza, è stata eseguita la colorazione in immunofluorescenza (IF) utilizzando anticorpi specifici per il marcatore cellulare RPE, RPE65. Le cellule pigmentate della retina umana (ARPE-19) sono state utilizzate come controllo positivo. Le celle RPE colorate con RPE65 (rosso e blu per la colorazione nucleare) sono mostrate nella Figura 1B (pannello inferiore). Gli anticorpi specifici RPE65 non hanno colorato le cellule di Müller isolate (Figura 1B, pannello superiore). Il fatto che l'RPE65 abbia colorato le cellule ARPE-19 (rosso) e non abbia colorato le cellule isolate, indica che le cellule isolate non sono cellule RPE. La presenza di piruvato e basso glucosio nei terreni stabilisce condizioni sfavorevoli per la crescita delle cellule RPE. Di conseguenza, anche in caso di contaminazione delle cellule RPE, esse finiranno per staccarsi dal pallone.

Inoltre, per confermare l'identità delle cellule isolate, è stata utilizzata una colorazione in immunofluorescenza con cellule di Müller per marcatori specifici per le cellule di Müller per confermare il successo dell'isolamento delle cellule di Müller. È stata utilizzata la proteina del filamento intermedio del citoscheletro chiamata vimentina12,13. Inoltre, èstata utilizzata anche la glutammina sintetasi (GS), che catalizza la reazione di condensazione del glutammato e dell'ammoniaca per formare glutammina, come funzione chiave delle cellule di Müller gliali retiniche5.

Collettivamente, le cellule isolate sono risultate negative per RPE65 (rosso, Figura 1B), positive per vimentina (verde, Figura 1C) e GS (verde, Figura 1D). La colorazione IF conferma il successo dell'isolamento (purezza e specificità) delle cellule di Müller isolate. La Figura 1E, è un controllo negativo per vimentina (pannello superiore) e GS (pannello inferiore), che conferma la specificità degli anticorpi.

Figura 1: Validazione dell'isolamento cellulare di Müller (purezza e specificità). (A) Immagine al microscopio ottico per passaggi: passaggio zero (P0) e (P1) morfologia. (B) Immunocolorazione RPE65 combinata con colorazione nucleare DAPI. (C) Immunocolorazione con vimentina con colorazione nucleare DAPI ad alto ingrandimento. (D) Immunocolorazione GS allo stesso alto ingrandimento. (E) controlli negativi per confermare la specificità della vimentina e della colorazione degli anticorpi GS. barra di scala = 300 μm, 300 μm, 50 μm, 20 μm, 20 μm, 50 μm, 50 μm, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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