Articolo metodologico

Valutazione dello screening ad alto rendimento della generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) utilizzando il colorante a fluorescenza diidroetidio (DHE)

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DOI:

10.3791/66238

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19 gennaio 2024

 , 
1Department of Pathology, University of New Mexico, 2Department of Chemical and Biological Engineering, University of New Mexico

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un nuovo metodo per quantificare le specie reattive dell'ossigeno (ROS) intracellulari utilizzando il diidroetidio (DHE) come sonda colorante a fluorescenza utilizzando un approccio di screening ad alto rendimento. Il protocollo descrive i metodi per la valutazione quantitativa delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) intracellulari nelle tre diverse linee cellulari di carcinoma epatocellulare.

Abstract

Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) svolgono un ruolo chiave nella regolazione del metabolismo cellulare nei processi fisiologici e patologici. La produzione fisiologica di ROS svolge un ruolo centrale nella modulazione spaziale e temporale delle normali funzioni cellulari come la proliferazione, la segnalazione, l'apoptosi e la senescenza. Al contrario, la sovrapproduzione cronica di ROS è responsabile di un ampio spettro di malattie, come il cancro, le malattie cardiovascolari e il diabete, tra le altre. Quantificare i livelli di ROS in modo accurato e riproducibile è quindi essenziale per comprendere la normale funzionalità cellulare. I metodi basati sull'imaging a fluorescenza per caratterizzare le specie di ROS intracellulari sono un approccio comune. Molti dei protocolli ROS di imaging in letteratura utilizzano il colorante 2'-7'-diclorodiidrofluoresceina diacetato (DCFH-DA). Tuttavia, questo colorante soffre di limitazioni significative nel suo utilizzo e nella sua interpretabilità. L'attuale protocollo dimostra l'uso di una sonda fluorescente al diidroetidio (DHE) come metodo alternativo per quantificare la produzione totale di ROS in un ambiente ad alto rendimento. La piattaforma di imaging ad alto rendimento, CX7 Cellomics, è stata utilizzata per misurare e quantificare la produzione di ROS. Questo studio è stato condotto su tre linee cellulari di cancro epatocellulare: HepG2, JHH4 e HUH-7. Questo protocollo fornisce una descrizione approfondita delle varie procedure coinvolte nella valutazione dei ROS all'interno delle cellule, tra cui: preparazione della soluzione di DHE, incubazione delle cellule con soluzione di DHE e misurazione dell'intensità di DHE necessaria per caratterizzare la produzione di ROS. Questo protocollo dimostra che il colorante fluorescente DHE è una scelta robusta e riproducibile per caratterizzare la produzione intracellulare di ROS in modo ad alto rendimento. È probabile che gli approcci ad alto rendimento per misurare la produzione di ROS siano utili in una varietà di studi, come la tossicologia, lo screening dei farmaci e la biologia del cancro.

Introduzione

Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono un gruppo di radicali chimici presenti in natura, altamente reattivi e temporalmente instabili che si formano come parte del normale metabolismo cellulare nelle cellule. I ROS svolgono un ruolo chiave ed essenziale nella modulazione dei normali processi fisiologici e biochimici che avvengono nelle cellule 1,2. La principale fonte di produzione di ROS nelle cellule proviene dalla via della catena di trasporto degli elettroni mitocondriale (ETC) come parte del normale ciclo bioenergetico. Ulteriori fonti significative di produzione di ROS includono reazioni enzimatiche come le NADPH ossidasi cellulari nelle cellule. Il metabolismo delle molecole alimentari (ad esempio, il glucosio) avviene attraverso la via della fosforilazione ossidativa nella matrice mitocondriale. Un livello basale di produzione di ROS è essenziale per regolare i normali processi fisiologici di segnalazione cellulare. Molte molecole proteiche chiave che fanno parte delle vie di segnalazione metabolica del glucosio (ad esempio, Akt e PTEN) sono note per rispondere ai livelli intracellulari di ROS. Inoltre, i ROS sono prodotti da vari enzimi intracellulari come la xantina ossidasi, l'ossido nitrico sintasi e i costituenti perossisomiali come parte delle vie enzimatiche cellulari 1,2. A differenza delle fonti naturali di ROS, alcuni fattori ambientali, come gli xenobiotici, gli agenti infettivi, i raggi UV, l'inquinamento, il fumo di sigaretta e le radiazioni, portano anche a un'eccessiva produzione di ROS, che sono un fattore chiave dello stress ossidativo intracellulare 1,3. L'elevato stress ossidativo cellulare può causare danni alle biomolecole native all'interno di una cellula, come lipidi, proteine e DNA, causando varie malattie come cancro, diabete, malattie cardiovascolari, infiammazioni croniche e disturbi neurodegenerativi 1,3,4. Pertanto, misurazioni accurate dei ROS sono essenziali per comprendere i meccanismi cellulari coinvolti nella fisiopatologia della malattia indotta dallo stress ossidativo.

A causa dei brevi tempi di produzione ed eliminazione dei ROS all'interno delle cellule, le misurazioni quantitative di vari radicali ROS rimangono una sfida. Metodi come la risonanza paramagnetica elettronica (EPR)5, la cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) e l'imaging basato su sonde di fluorescenza vengono utilizzati per misurare i vari ROScellulari 6. Mentre metodi come l'EPR e l'HPLC forniscono stime quantitativamente accurate, questi metodi comportano la distruzione della morfologia spaziale cellulare e sono solitamente sotto forma di misurazioni globali e di massa di un campione. Al contrario, i metodi basati sull'imaging, come i metodi basati su sonde di fluorescenza, mantengono la morfologia cellulare e il contesto spaziale della generazione di ROS. Tuttavia, la specificità di varie sonde di fluorescenza per diversi tipi di radicali ROS non è stata ben stabilita 7,8. Diverse sonde fluorescenti come il diidroetidio (DHE), il diclorodiidrofluoresceina diacetato (DCFH-DA), la diidrorodamina (DHR), il dimetilantracene (DMA), il 2,7 diclorodiidrofluresceina (DCFH), l'1,3-difenilisobenzofurano (DPBF) e il MitoSox sono disponibili per il rilevamento dei ROS in commercio. Negli ultimi decenni, DHE, MitoSox e DCFH-DA sono i coloranti fluorescenti comunemente usati per misurare i ROS nelle cellule e nei tessuti 8,9. DCFH-DA è un colorante ampiamente utilizzato per rilevare H2O2 intracellulare e stress ossidativo. Nonostante la popolarità del DCFH-DA, diversi studi precedenti hanno dimostrato che non può essere utilizzato in modo affidabile per misurare i livelli intracellulari di H2O2 e altri livelli di ROS 8,9,10,11,12,13,14.

Al contrario, la sonda fluorescente diidroetidio (DHE) mostra una risposta specifica al radicale superossido intracellulare (O2-). Mentre il radicale superossido è una delle tante specie di ROS osservate nelle cellule, è un importante radicale coinvolto nella riduzione dei metalli di transizione, nella conversione in perossinitrato e nella formazione di idroperossidi, tra gli altri effetti intracellulari. Il DHE viene rapidamente assorbito dalle cellule e ha un'emissione di fluorescenza nella gamma di lunghezze d'onda rosse15. In seguito alla reazione con il radicale superossido in particolare, il DHE forma un prodotto fluorescente rosso, 2-idrossietidio (2-OH-E+). Pertanto, il DHE può essere considerato come una sonda specifica per il rilevamento del superossido. Tuttavia, il DHE può anche subire un'ossidazione non specifica con ONOO- o OH., H2O2 e citocromo c per formare un secondo prodotto di fluorescenza, etidio E+, che può interferire con i livelli misurati di 2-OH-E+. Tuttavia, questi prodotti 2-OH E+ ed E+, in combinazione, rappresentano una parte importante delle specie cellulari totali di ROS osservate all'interno di una cellula quando colorate con DHE. E+ si intercala nel DNA, aumentando notevolmente la sua fluorescenza 8,9,10,11,13,14,15,16. Poiché gli spettri di fluorescenza dell'etidio e del 2-idrossietidio differiscono solo leggermente, la maggior parte dei livelli di ROS osservati in una cellula secondaria alla produzione di superossido può essere rilevata e misurata utilizzando prodotti a fluorescenza DHE. Queste specie di ROS sono identificate utilizzando l'eccitazione a 480 nm di lunghezza d'onda e l'emissione di lunghezza d'onda a 610 nm 15,16,17.

Oltre a scegliere una specifica sonda fluorescente per il rilevamento dei ROS, è importante scegliere un metodo di rilevamento sensibile per misurare i ROS intracellulari. Una valutazione accurata dei livelli intracellulari di ROS è quindi fondamentale per identificare gli stati di equilibrio redox disturbati che si verificano nelle cellule malate o nelle cellule che sono state esposte a vari fattori di stress ambientale come radiazioni, composti tossicologici e agenti genotossici18. Poiché i ROS sono un fenomeno che si verifica comunemente nelle cellule ed è responsabile della regolazione di una varietà di attività di segnalazione cellulare, sono essenziali metodi robusti di rilevamento dei ROS. Per consentire una valutazione ad alto rendimento della produzione di ROS all'interno delle cellule, questo protocollo utilizza una piattaforma di screening ad alto contenuto (HCS) per misurare le specie di ROS. L'attuale protocollo consente l'analisi ad alto rendimento della produzione intracellulare di ROS, che è di fondamentale importanza in molti studi tossicologici19. Questo protocollo mira a fornire una soluzione semplice e versatile per rilevare e misurare i ROS intracellulari nelle cellule di carcinoma epatocellulare aderenti. I reagenti chimici di H2O2 e menadione sono utilizzati come potenti stimolatori di ROS per misurare i livelli relativi di produzione di ROS in un ambiente controllato e ad alta produttività. Questo protocollo può essere messo a punto per misurare la produzione di ROS in cellule aderenti e non aderenti in condizioni appropriate, se necessario.

Protocollo

1. Colture cellulari

  1. Seminare le cellule di prova (cellule di carcinoma epatocellulare HepG2, HUH7 e JHH4) in una piastra da 96 pozzetti con una densità di semina di 10.000 cellule/pozzetto in un volume di semina finale di 200 μL per pozzetto.
    1. Prima di coltivare le cellule HepG2, rivestire i 96 pozzetti della piastra con collagene di tipo IV (50 μg/mL) per una durata di 2 ore a temperatura ambiente (RT). Per evitare la solidificazione del collagene madre, mettere la soluzione madre nel ghiaccio e, successivamente, avviare il processo di diluizione alla concentrazione desiderata.
    2. Dopo un periodo di incubazione di 2 ore, aspirare il collagene in eccesso e lavare i pozzetti tre volte con il PBS 1x.
  2. Coltivare le cellule nel substrato Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco per una notte a 37 °C e una concentrazione di CO2 del 5% in un incubatore umidificato.
  3. Il giorno successivo, o al raggiungimento della confluenza dell'80%-90%, a seconda di quale evento si verifichi per primo, trattare le cellule con H2O2 (non trattato, 250 μM, 500 μM, 750 μM e 1000 μM) e Menadione (non trattato, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM), rispettivamente per 30 minuti per indurre lo stress ossidativo rappresentativo.
  4. In alternativa, scegliere di testare le cellule con la sostanza di prova desiderata in grado di indurre lo stress ossidativo all'interno delle cellule.

2. Preparazione della soluzione di stoccaggio e diluizione per la colorazione delle cellule con DHE

  1. Preparare la soluzione madre di DHE (5 mg/mL o 15,9 mM) sciogliendo 5 mg di DHE in 1 mL di DMSO.
  2. Diluire la soluzione madre di DHE con acqua autoclavata a doppia distillazione fino a una concentrazione finale di 100 μM.
  3. Per evitare il processo di congelamento e disgelo del colorante (che potrebbe danneggiare le proprietà di fluorescenza nel tempo), preparare diverse aliquote in provette da centrifuga da 1,5 mL con una concentrazione di 100 μM e conservarle a -20 °C.
  4. Per ottenere una concentrazione di lavoro finale di 10 μM, utilizzare un'aliquota della concentrazione di DHE di 100 μM e diluirla con un terreno DMEM preriscaldato.
    NOTA: La soluzione di lavoro deve essere preparata fresca il giorno dell'esperimento.
  5. Far scorrere a vortice la soluzione di colorante a fluorescenza di lavoro per 5-10 s per garantire una corretta miscelazione del colorante.

3. Processo di colorazione DHE

  1. Rimuovere il terreno contenente il farmaco o la sostanza in esame da ciascun pozzetto e lavarlo delicatamente una volta con 1x PBS o DMEM.
    NOTA: Quando si eseguono le fasi di aggiunta o lavaggio nell'esperimento, è fondamentale evitare il contatto diretto tra le cellule e il pipettero. Ciò può essere ottenuto pipettando delicatamente il PBS lungo i lati dei pozzetti per ridurre al minimo qualsiasi potenziale danno meccanico alle cellule. Garantire che il pipettatore non tocchi direttamente le cellule aiuterà a mantenere l'integrità e la vitalità delle cellule per tutta la durata dell'esperimento.
  2. Aggiungere 100 μL di terreno DMEM contenente 10 μM DHE (soluzione di lavoro) in ciascun pozzetto e incubare a 37 °C per 30 minuti.
  3. Dopo un periodo di incubazione di 30 minuti, rimuovere i terreni contenenti DHE e lavare delicatamente ogni pozzetto tre volte con la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Questa operazione può essere eseguita con un pipettatore multicanale per garantire una rapida inversione di tendenza.
  4. Aggiungere 200 μL di PBS 1x a ciascun pozzetto con colorante colorante nucleare Hoechst 33342 per 10 minuti a RT.
  5. Rimuovere la soluzione colorante nucleare Hoechst 33342 dal pozzetto e aggiungere 200 μL di PBS 1x a ciascun pozzetto.
    NOTA: Per ottenere cellule fisse, seguire lo stesso protocollo delle cellule vive, con un'ulteriore fase di aggiunta di PFA al 4% per 5 minuti dopo il trattamento e colorazione con DHE. Rimuovere la soluzione di PFA e lavare le celle con il PBS 1x. Quindi, incubare le cellule con il colorante colorante nucleare per 10 minuti.
  6. Spostare la piastra sulla piattaforma di screening ad alto contenuto, sulla microscopia a fluorescenza o sul lettore di piastre per l'acquisizione delle immagini il più rapidamente possibile.

4. Acquisizione delle immagini e misurazione dell'intensità

  1. Caricamento della piastra
    1. Aprire il software di screening ad alto contenuto (HCS) Cellomics CX7 per l'acquisizione dei dati.
    2. Calibrare attentamente la piattaforma di imaging in base alle specifiche del produttore in anticipo con la piastra specifica a 96 pozzetti scelta per l'uso per evitare immagini sfocate o sfocate nei dati.
      NOTA: Le piastre a più pozzetti di vari fornitori possono avere proprietà del materiale diverse e possono influenzare la qualità delle immagini finali ottenute.
    3. Una volta calibrati, salvare i parametri di sistema specifici per la marca della piastra nel database dello strumento e riutilizzarli per future acquisizioni di dati.
    4. Posizionare con cautela la piastra con i campioni preparati sul tavolino riscaldato del sistema di imaging HCS. Assicurarsi che la piastra sia posizionata saldamente e con l'orientamento corretto per l'imaging sul supporto per micropiastre (ad esempio, individuare l'etichetta contrassegnata con A1 sul tavolino lettore, quindi ruotare la micropiastra in modo che la posizione del pozzetto A1 corrisponda all'angolo con l'adesivo).
    5. Premere delicatamente sulla micropiastra per assicurarsi che poggi piatta contro il tavolino. Un livellamento irregolare della piastra nel sistema HCS può causare errori nell'acquisizione delle immagini.
    6. Dopo che la piastra è in posizione, tenere premuto il tasto Ctrl , quindi fare clic su Ctrl-OK nella finestra di dialogo Carica/Scarica piastra nel software.
  2. Selezione dei parametri di imaging
    1. Nel sistema di imaging HCS, aprire la modalità di attivazione del bersaglio nell'interfaccia delle bioapplicazioni di Cellomics e creare un nuovo protocollo utilizzando il protocollo di configurazione a due canali compatibile con (a) colorazione nucleare e (b) acquisizione dei dati della sonda di fluorescenza DHE. Nel protocollo attuale, i filtri 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS e 386_BGS_RS sono stati utilizzati rispettivamente per (a) la colorazione nucleare di Hoechst 33342, (b) la produzione totale di ROS e (c) la rilevazione di radicali superossidi. La scelta di questi filtri è stata guidata dalla sovrapposizione specifica per le proprietà di emissione di ciascun colorante (DAPI e DHE) utilizzato come parte di questo protocollo.
      NOTA: La convenzione di denominazione dei filtri, ad esempio 386-23_BGRFRN_BGRFRN, si riferisce all'eccitazione del campione con luce a 386 nm con una larghezza di banda di 23 nm, seguita da un filtro dicroico che fa passare luce blu (B), verde (G), rossa (R), rossa (R), rossa (FR) e infrarossa vicina (N) a intervalli di lunghezze d'onda specifici e la 386_BGS_RS si riferisce a un filtro di emissione che fa passare la luce di lunghezza d'onda di emissione BGS e RS dopo la dicroica.
    2. Specificare gli obiettivi per il processo di acquisizione delle immagini all'interno dell'interfaccia del protocollo software, ad esempio l'ingrandimento 10x o 20x, se necessario.
    3. Scegliere l'ingrandimento dell'obiettivo appropriato in base al livello desiderato di dettaglio dell'immagine e alle risoluzioni necessarie per l'esperimento. Tuttavia, la risoluzione di ogni obiettivo è fissa. I dettagli a risoluzione più elevata richiederanno la modifica dell'obiettivo sulla piattaforma. Nel protocollo attuale, viene utilizzato un obiettivo 20x, 0,45 NA, che fa parte della piattaforma di screening ad alto contenuto utilizzata in questo protocollo.
      NOTA: L'obiettivo 20x rappresenta un buon compromesso tra i dettagli della risoluzione dell'immagine e la velocità di acquisizione necessaria per catturare le variazioni ROS nel tempo. È possibile scegliere obiettivi con ingrandimento più elevato (ad esempio, 40X), tuttavia, ciò comporterà un aumento dei tempi di acquisizione.
    4. Specificare le impostazioni di esposizione della telecamera di acquisizione immagini, ad esempio il tempo di esposizione, il binning della fotocamera e l'intervallo z-stack, in base ai requisiti specifici del protocollo.
      NOTA: Il tempo di esposizione (spesso in millisecondi) varia in base alla potenza del segnale e alla sensibilità degli specifici fluorofori utilizzati. Questo può anche differire leggermente da esperimento a esperimento in base alla concentrazione del colorante e alla qualità della colorazione. Nel protocollo attuale, i parametri di acquisizione sono fissati come segue: % target - 35%, modalità di acquisizione dell'immagine - 1104 x 1104 (con binning 2x2) e obiettivo 20x, 0,45 NA. Questi parametri possono essere impostati in base alle specifiche condizioni sperimentali.
  3. Parametri di configurazione dell'imaging
    NOTA: Una volta impostati i parametri di imaging, è possibile avviare il processo di raccolta delle immagini utilizzando l'interfaccia software.
    1. Parametri di raccolta delle immagini
      1. Identificare l'oggetto di tracciamento primario di interesse (il nucleo delle cellule) utilizzando diversi algoritmi disponibili nello strumento (ottiche - isodati, fisse e triangolari).
        NOTA: In questo protocollo viene utilizzato il metodo isodati per l'identificazione e la marcatura dell'oggetto primario.
      2. Segmentare l'oggetto (se presente) in base alla forma o al parametro di intensità.
      3. Convalidare l'oggetto principale in base ai parametri di dimensione, forma e intensità desiderati univoci per ogni tipo di cella.
      4. Quindi, definisci la "regione di interesse" (ROI) intorno a questo oggetto primario.
        NOTA: Il ROI è un parametro chiave dell'acquisizione dei dati che definisce la posizione in cui l'intensità del colorante di fluorescenza viene identificata come coerente e ripetibile tra i tipi di cellule. Il ROI definisce i parametri chiave (come l'intensità del colorante), che vengono misurati per ogni oggetto di tracciamento primario (cioè una cella) in diversi canali dello strumento. Il ROI può essere definito sotto forma di un cerchio o di un anello attorno al nucleo di ciascuna cellula. Il software HCS ottiene automaticamente l'intensità del marcatore del colorante di fluorescenza DHE nel canale 2 entro il limite del ROI per ogni cellula che viene segmentata e analizzata in modo automatizzato.
      5. Impostare un cerchio di 20 μm attorno all'oggetto primario (nucleo). La distanza di 20 μm è stata scelta in questo studio in base alle dimensioni approssimative delle varie linee cellulari utilizzate in questo protocollo (HepG2, JHH-4 e HUH-7). Il ROI dell'anello di 20 μm intorno alle cellule ha ottenuto l'intensità della fluorescenza in modo coerente e ripetibile.
        NOTA: Il parametro chiave nella scelta di un ROI è la capacità di coprire adeguatamente l'area cellulare; la dimensione del ROI circolare dipende dalla dimensione della cella. Le celle più grandi possono richiedere un ROI maggiore e viceversa per un ROI inferiore. Questi parametri devono essere determinati in anticipo per ogni tipo di cellula e colorante di fluorescenza di interesse.
  4. Caratterizzazione della popolazione e selezione delle caratteristiche da memorizzare
    1. Una volta definiti i vari parametri di acquisizione nel protocollo di imaging HCS, impostare il sistema HCS in modalità di acquisizione dati.
    2. I parametri di acquisizione delle immagini per questo protocollo sono stati impostati come segue: un limite di scansione di 1000 celle/pozzetto, con un requisito minimo di 10 oggetti (celle) per campo.
      NOTA: Il numero di campi valutati per ciascun pozzetto è stato determinato in base al numero finale di celle che raggiunge il numero 1000. Il sistema HCS continua a cercare varie posizioni all'interno del pozzetto fino a ottenere la popolazione target di 1000 cellule/pozzetto. La velocità di acquisizione dipende quindi dalla confluenza e dal numero totale di cellule presenti in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti. Nell'attuale protocollo, l'intensità totale e media del canale 2 (che rappresenta i radicali superossidi e la produzione totale di ROS) sono stati raccolti da ciascun pozzo per ulteriori analisi a valle.
  5. Acquisizione, elaborazione e analisi delle immagini
    1. Dopo aver regolato e finalizzato i parametri di acquisizione dell'immagine, avviare il processo di scansione per ciascuna piastra a 96 pozzetti.
      NOTA: Il sistema di imaging Cellomics CX7 consente lo screening ad alto contenuto e l'analisi automatizzata di campioni di una varietà di parametri, tra cui la produzione di ROS all'interno delle cellule in modo ad alto rendimento. Oltre alla produzione di ROS, il sistema HCS è in grado di fornire ulteriori preziose informazioni su vari parametri come la morfologia cellulare, la localizzazione subcellulare e molte altre caratteristiche cellulari di interesse. Una volta ottimizzata per l'acquisizione, la piattaforma di imaging HCS consente una caratterizzazione completa, qualitativa e quantitativa dei parametri cellulari in modo robusto.
    2. Al termine del processo di scansione, avviare il software View Analysis ed esportare i vari parametri dei dati quantitativi in un formato .csv per ulteriori analisi.
    3. Utilizzando software di terze parti, copiare e incollare i vari valori quantitativi di interesse per ulteriori analisi a valle.
      NOTA: Nell'attuale protocollo, il software GraphPad Prism è stato utilizzato per analizzare i valori di intensità del DHE in risposta allo stress ossidativo indotto dovuto all'esposizione a H2O2 e menadione.
  6. Dati e analisi statistiche
    1. Calcolare l'intensità media media del canale 2 (che rappresenta i valori totali di ROS e radicali superossidi).
      NOTA: Tutti gli esperimenti per calcolare i valori di intensità sono stati ripetuti tre volte con 6 repliche per condizione ad ogni livello di dosaggio.
    2. Eseguire l'ANOVA unidirezionale o il test t per misurare le differenze nei valori di intensità tra le varie condizioni di test.

Risultati

Il diidroetidio (DHE) è un colorante fluorescente reattivo ai superossidi che fornisce informazioni specifiche sugli stati dei ROS intracellulari. Il colorante DHE emette intrinsecamente fluorescenza blu nel citoplasma. Tuttavia, in seguito all'interazione con i radicali superossido, si trasforma in 2-idrossietidio, che emette fluorescenza nelle lunghezze d'onda rosse (>550 nm) (Figura 1). Il colorante DHE viene facilmente trasportato nelle cellule e nel nucleo. La fluorescenza emessa può essere visualizzata con una configurazione di microscopia a fluorescenza comunemente disponibile in molti laboratori. Nello studio corrente, l'utilità del colorante DHE su più linee cellulari di carcinoma epatocellulare - cellule HUH7, JHH4 e HepG2 come sonda della generazione di specie ROS è stata testata su una piattaforma di screening ad alto contenuto. Le cellule sono state trattate con due agenti generatori di ROS - (a) perossido di idrogeno e (b) menadione per 30 minuti in modo dose-dipendente (vedere la Figura 2 e la Figura 3 per i dettagli sul dosaggio) per indurre lo stress ossidativo nelle cellule seguito dalla marcatura del colorante DHE in una piastra a 96 pozzetti. Sia l'H2O2 che il menadione hanno aumentato notevolmente l'intensità della fluorescenza in tutte e tre le linee cellulari in modo dose-dipendente. Utilizzando gli algoritmi di segmentazione e quantificazione delle immagini all'interno della piattaforma di screening ad alto rendimento, l'intensità della fluorescenza DHE indotta da ROS è stata quantificata in 1000 cellule per pozzetto in sei repliche. Sono state misurate tre repliche indipendenti e i risultati sono stati aggregati e analizzati. Il colorante nucleare Hoechst 33342 svolge un ruolo importante nell'identificazione del piano in cui le cellule aderenti sono presenti in ciascun pozzetto. Inoltre, la fluorescenza 2-OH-E+ ed E+ può essere rilevata sia nel nucleo che nel citoplasma delle cellule testate, rispettivamente, sulla piattaforma di screening ad alto rendimento (vedere la Figura 4).

L'esposizione a H2O2 ha determinato un incremento statisticamente significativo della fluorescenza indotta da ROS in tutte le linee cellulari analizzate in modo dose-dipendente (vedi Figura 2; pannello inferiore). Tuttavia, tale risposta dose-dipendente non è stata osservata nel caso di esposizioni al menadione. Con il menadione, la linea cellulare JHH4 ha mostrato un incremento dose-dipendente dell'intensità della fluorescenza, mentre nelle linee cellulari HepG2 e HUH7, una differenza significativa nell'intensità della fluorescenza è stata osservata solo alle concentrazioni più elevate di menadione (vedi Figura 3; pannello inferiore). Queste differenze nelle risposte di generazione di ROS potrebbero essere dovute ai distinti meccanismi di produzione di ROS di H2O2 e menadione. Mentre H2O2 innesca la formazione di ROS nelle cellule in modo più diretto (ad esempio, attraverso l'azione di enzimi antiossidanti come perossidasi e catalasi), si ipotizza che il menadione generi specie di ROS in modo indiretto attraverso la disfunzione mitocondriale indotta. A causa del meccanismo indiretto della produzione di ROS, la fluorescenza del DHE può richiedere più tempo per manifestarsi con il menadione. Questi risultati indicano che la fluorescenza ROS-dipendente di DHE è sensibile alla durata delle esposizioni allo sforzo ossidativo, alla concentrazione ed ai tipi di cellule. L'ottimizzazione del protocollo sperimentale per ogni singolo tipo di cellula è quindi un must. Ancora più importante, questo protocollo dimostra la fattibilità dell'uso del colorante DHE come agente di rilevamento ROS in un modo ad alto rendimento, che è di uso in aree come la tossicologia, la biologia del cancro e lo screening della droga.

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Figura 1: Uno schema che illustra le vie di conversione ossidativa della molecola di fluorescenza DHE in 2-idrossietidio (2-OH-E+) ed etidio (E+), rispettivamente. Gli spettri di emissione della fluorescenza di 2-OH-E+ ed E+ si sovrappongono ad un'eccitazione di 480 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Il trattamento con perossido di idrogeno aumenta i livelli intracellulari di ROS in modo dose-dipendente. Le cellule di carcinoma epatocellulare - (A) HUH7, (B) JHH4 e (C) HepG2 sono state trattate con H2O2 a dosi di 250 μM, 500 μM, 750 μM e 1000 μM per un periodo di 30 minuti. Le cellule sono state colorate con colorante DHE (10 μM) in terreni di coltura per altri 30 minuti, seguito da colorazione nucleare Hoechst 33342. In ogni pozzetto sono state contate un totale di 1000 cellule. Un aumento lineare, dose-dipendente, della fluorescenza DHE è osservato in tutte e tre le linee cellulari (pannello superiore). Aumenti statisticamente significativi della fluorescenza sono stati osservati in tutte le linee cellulari per il dosaggio di 500 μM e oltre (pannello inferiore). Ogni set di dati è una media di sei repliche in una piastra a 96 pozzetti ottenuta da tre esperimenti indipendenti (n = 3). Le condizioni di trattamento sono state confrontate con i campioni non trattati utilizzando un test ANOVA unidirezionale (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; barra della scala dell'immagine - 50 μm) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Il trattamento con menadione aumenta i livelli intracellulari di ROS in modo dose-dipendente. Le cellule di carcinoma epatocellulare - (A) HUH7, (B) JHH4 e (C) HepG2 sono state trattate con menadione a dosi di 25 μM, 50 μM, 75 μM e 100 μM per un periodo di 30 minuti. Le cellule sono state colorate con colorante DHE (10 μM) in terreni di coltura per altri 30 minuti, seguito da colorazione nucleare Hoechst 33342. In ogni pozzetto sono state contate un totale di 1000 cellule. Un aumento lineare, dose-dipendente, della fluorescenza DHE è osservato in tutte e tre le linee cellulari (pannello superiore). Aumenti statisticamente significativi della fluorescenza sono osservati in modo coerente per la dose massima (100 μM; pannello inferiore). Si osserva variabilità per le dosi rimanenti di menadione su diverse linee cellulari (JHH4 > HUH7 > HepG2). Ogni set di dati è una media di sei repliche in una piastra a 96 pozzetti ottenuta da tre esperimenti indipendenti (n = 3). Le condizioni di trattamento sono state confrontate con campioni non trattati utilizzando un test ANOVA unidirezionale (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; barra della scala dell'immagine - 50 μm) Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.

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Figura 4: Fluorescenza DHE a singola cellula - Una vista ravvicinata dei cambiamenti di fluorescenza DHE osservati dopo il trattamento con (A) perossido di idrogeno e (B) menadione per una durata di 30 minuti. I cambiamenti citoplasmatici e nucleari della fluorescenza di DHE sono osservati nelle cellule differenti. Si vede anche la maschera di segmentazione automatica generata dalla piattaforma di screening ad alto contenuto. Barra della scala dell'immagine - 10 μm. Ingrandimento - 20x. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Imaging della fluorescenza DHE guidata da superossido in risposta al perossido di idrogeno. Le cellule di carcinoma epatocellulare - (A) HUH7, (B) JHH4 e (C) HepG2 sono state trattate con H2O2 a dosi di 250 μM, 500 μM, 750 μM e 1000 μM per un periodo di 30 minuti. Le cellule sono state poi colorate con colorante DHE (10 μM) in terreni di coltura per altri 30 minuti. Successivamente, le cellule sono state illuminate con LED a 386 nm e l'imaging a fluorescenza è stato raccolto a >560 nm. Non è stata eseguita alcuna controcolorazione nucleare per evitare la diafonia spettrale. Un aumento dose-dipendente della fluorescenza di DHE è osservato a dosi > 500 μM. La fluorescenza UV-illuminata di DHE dovrebbe essere dovuta alla maggior parte della produzione di radicali del superossido. Ogni set di dati è una media di sei repliche in una piastra a 96 pozzetti ottenuta da due esperimenti indipendenti (n = 2). Le condizioni di trattamento sono state confrontate con i campioni non trattati utilizzando un'ANOVA unidirezionale (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; barra della scala dell'immagine - 50 μm) Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Imaging della fluorescenza DHE guidata da superossido in risposta al menadione - Le cellule di carcinoma epatocellulare - (A) HUH7, (B) JHH4 e (C) HepG2 sono state trattate con menadione a dosi di 25 μM, 50 μM, 75 μM e 100 μM per un periodo di 30 minuti. Le cellule sono state poi colorate con colorante DHE (10 μM) in terreni di coltura per altri 30 minuti. Simile al perossido di idrogeno, è stato osservato un aumento dose-dipendente della fluorescenza di DHE. Ogni set di dati è una media di sei repliche in una piastra a 96 pozzetti ottenuta da due esperimenti indipendenti (n = 2). Le condizioni di trattamento sono state confrontate con i campioni non trattati utilizzando un'ANOVA unidirezionale (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; barra della scala dell'immagine - 50 μm) Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

In questo studio, è stato stabilito un protocollo per valutare la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) intracellulari guidate dal superossido utilizzando il colorante a fluorescenza diidroetidio (DHE) su un sistema di screening ad alto contenuto. La maggior parte degli attuali protocolli disponibili in letteratura utilizza il DCFH-DA come sonda di imaging a fluorescenza per quantificare le specie di ROS. Tuttavia, diversi studi hanno dimostrato che il DCFH-DA non è una sonda ideale per la misurazione dei ROS intracellulari. Varie ragioni postulate per l'inadeguatezza del DCFH-DA come sonda includono: (i) DCFH-DA non mostra una reazione diretta con H2O2, il che lo rende un colorante inappropriato per valutare il livello intracellulare di H2O2. (ii) Diverse specie ossidanti a un elettrone, come OH., NO2. e ONOO-, ossidano DCFH a DCF. (iii) i metalli di transizione, il citocromo C e l'eme perossidasi possono promuovere l'ossidazione del DCFH in presenza di ossigeno e H2O2 . (iv) Ancora più importante, DCFH-DA produce il prodotto intermedio DCFH.- / DCF., che, in presenza di ossigeno, induce la produzione di superossido aggiuntivo. La dismutazione con O2.- genera ulteriore H2O2, che può comportare un aumento artefatto dell'intensità della fluorescenza e livelli di ROS erroneamente elevati. Diversi autori hanno ritenuto l'uso di DCFH-DA come una sonda fluorescente inaffidabile per la rilevazione di H2O2 intracellulari e altre specie di ROS 8,9,10,11,12,13,14.

A differenza del DCFH-DA, DHE reagisce in modo specifico con il radicale superossido, portando alla generazione di un prodotto fluorescente, il 2-idrossietidio (2-OH E+). Le specie ROS non superossido possono anche reagire con il DHE per generare un secondo prodotto fluorescente, l'etidio (E+). Mentre gli spettri di fluorescenza di 2-OH-E+ ed E+ sono relativamente simili, queste due molecole rappresentano i prodotti finali delle interazioni specifiche tra le specie ROS intracellulari e DHE e sono responsabili dell'intensità totale della fluorescenza osservata all'interno delle cellule a causa dello stress ossidativo. Alcuni studi hanno indicato che l'eccitazione selettiva a lunghezze d'onda UV più corte (<400 nm) può essere più specifica per l'eccitazione dell'etidio 2-OH (al contrario di E+) e, quindi, per la produzione di radicali superossido 7,12,14. Questo è stato valutato eccitando le celle con la sola luce LED a 386 nm. Rispetto all'eccitazione della lunghezza d'onda di 480 nm, è stata osservata una ridotta intensità di emissione alla lunghezza d'onda di 560 nm (vedi Figura 1 e Figura 2 supplementari). Tuttavia, non si può essere certi che ciò sia dovuto esclusivamente alla sola fluorescenza dell'etidio 2-OH e rappresenti un potenziale difetto dell'approccio attuale. Altri studi hanno dimostrato che l'eccitazione UV (ad esempio, 386 nm) può anche provocare un'emissione simultanea di fluorescenza dell'etidio, anche se a livelli inferiori rispetto all'etidio2-OH 7,15. Indipendentemente da ciò, il nostro protocollo stabilisce che il DHE è una migliore alternativa al colorante per misurare le differenze quantitative della maggior parte della produzione intracellulare di ROS utilizzando un sistema di imaging e screening ad alto contenuto.

La mancanza di driver intermedi della generazione di ROS (come quelli osservati in DCFH-DA) è postulata come un vantaggio importante nell'uso di DHE per valutare la produzione intracellulare di ROS. Tuttavia, questo meccanismo di fluorescenza del DHE non è ancora saldamente stabilito. Nei casi in cui è necessaria una quantificazione accurata dei livelli di ROS, si consiglia di utilizzare ulteriori metodi ortogonali di validazione quantitativa come HPLC e/o metodi di cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) per stimare con precisione i livelli di 2-OH-E+ all'interno delle cellule 8,9,13. Tuttavia, bisogna essere consapevoli del fatto che i metodi HPLC e LC-MS comportano necessariamente l'aggregazione e la solubilizzazione delle cellule per la valutazione. Pertanto, le informazioni spazio-temporali codificate in un metodo di imaging basato sulla fluorescenza come nell'attuale protocollo andrebbero perse in HPLC e LC-MS e rappresentano un grande vantaggio dei metodi di valutazione ROS basati sull'imaging. Un ulteriore vantaggio della fluorescenza spostata verso il rosso del DHE è che la luce a lunghezza d'onda più lunga (in rosso) è meno tossica per le cellule a causa della minore energia trasportata dalla luce rossa.

La natura dose-dipendente della fluorescenza di DHE per misurare i cambiamenti intracellulari relativi di ROS è stata testata usando menadione e perossido di idrogeno come induttori di stress ossidativo. Il menadione e il perossido di idrogeno sono stati scelti come sostanze in esame a causa dei meccanismi variabili della generazione di ROS e stress ossidativo20,21. Mentre la produzione di ROS dovuta all'esposizione al menadione è indiretta (attraverso la disfunzione mitocondriale), H2O2 produce stress ossidativo in modo più diretto. Le concentrazioni crescenti di menadione hanno portato a una maggiore produzione di fluorescenza di DHE in modo lineare, ripetibile e dose-dipendente. Simile al menadione, H2O2 è un noto induttore di ROS in grado di generare radicali ossidrilici (OH.) attraverso la chimica di Fenton in modo diretto22. Una risposta lineare e dose-dipendente è stata osservata similmente nella fluorescenza di DHE dovuto l'esposizione a H2O2. A causa della selettività del DHE per il radicale superossido in particolare, non reagisce direttamente con l'H2O2 .Invece, i radicali superossido intracellulari prodotti inizialmente reagiscono con H2O2 per formare specie ROS secondarie, come i radicali idrossilati attraverso le reazioni di Haber-Weiss e Fenton, che vengono poi rilevate dalla fluorescenzaDHE 23. Lo spettro di emissione della fluorescenza del DHE in risposta a due diverse sostanze ossidanti misurando la maggior parte della produzione intracellulare di ROS è stabilito nell'attuale protocollo 8,13. Questi risultati stabiliscono l'utilità del colorante fluorescente DHE come migliore alternativa per la rilevazione e la quantificazione dei livelli intracellulari di ROS utilizzando approcci di screening ad alto rendimento.

La selettività, la sensibilità e le proprietà ottiche superiori del DHE lo rendono un'alternativa valida per studiare la produzione di ROS e il danno ossidativo in modo ad alto rendimento, come stabilito nell'attuale protocollo. Gli studi futuri nel nostro laboratorio esploreranno il ruolo del DHE come marcatore ROS nella cross-reattività fra ROS e meccanismi di segnalazione cellulare in varie condizioni fisiologiche e patologiche in un ambiente ad alto rendimento.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

RK e RRG sono stati supportati da una sovvenzione dell'UNM Center for Metals in Biology and Medicine (CMBM) attraverso la sovvenzione NIH NIGMS P20 GM130422. RRG è stato supportato da un premio pilota della sovvenzione NM-INSPIRES P30 1P30ES032755. Il supporto per i core di imaging per lo strumento CX7 Cellomics è stato fornito attraverso i core del centro AIM finanziati dalla sovvenzione NIH P20GM121176. Vorremmo ringraziare la Dott.ssa Sharina Desai e la Dott.ssa Li Chen per la loro preziosa assistenza con le questioni tecniche relative all'uso della piattaforma di imaging CX7 Cellomics.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette da centrifuga da 1,5 mLVWR20170-038 
Piastra a 96 pozzetti Corning Costar 07-200-90 
Cellomica Cx7ThermoFisher
CollageneBiomatrice avanzata   5056 
DHE (Diidroetidio) ThermoFisher D1168 
DMEM Sigma   6046 
FBS VWR97068-085 
GraphPad PrismGraphPadVersione 6.0
HepG2 linea cellulareATCC
Hoechst ThermoFisher 33342 
Linea cellulare HUH7ATCC
Perossido di idrogenoSigma 88597 
Linea cellulare JHH4ATCC
Menadione Sigma M5625 
HCSDCX7LEDPRO

Riferimenti

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