Articolo metodologico

Tecnologia 2D-HPLC-MS combinata con la rete molecolare per l'identificazione di componenti nel pendolo dell'aconito della medicina tibetana

DOI:

10.3791/66239

⸱

8 dicembre 2023

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1Ethnic Medicine Academic Heritage Innovation Research Center, Meishan Hospital, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Chemical Biology & Traditional Chinese Medicine Research, Ministry of Education, 4Key Laboratory of Phytochemical R&D of Hunan Province, Hunan Normal University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio utilizza la tecnologia bidimensionale di cromatografia liquida ad alte prestazioni e spettrometria di massa (2D-HPLC-MS) in combinazione con la rete molecolare per svelare l'intricata composizione chimica della pianta medicinale tibetana Aconitum pendulum Busch (APB). L'articolo fornisce un protocollo dettagliato per l'esplorazione sistematica e l'identificazione di componenti chimici complessi dei medicinali erboristici.

Abstract

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In questo studio, è stato impiegato un approccio globale, utilizzando la tecnologia 2D-HPLC-MS in combinazione con la rete molecolare per svelare l'intricata composizione chimica della pianta medicinale tibetana APB. Grazie all'implementazione dell'HPLC 2D, è stata ottenuta una migliore separazione di miscele complesse, consentendo l'isolamento di singoli composti per la successiva analisi. L'approccio della rete molecolare ha ulteriormente aiutato a chiarire le relazioni strutturali tra questi composti, contribuendo alla determinazione di potenziali molecole bioattive. Questa strategia integrata ha identificato in modo efficiente un'ampia gamma di componenti chimici presenti all'interno dell'impianto. I risultati hanno rivelato uno spettro diversificato di costituenti chimici all'interno dell'APB, inclusi gli alcaloidi, tra gli altri. Questa ricerca non solo fa progredire la comprensione del profilo fitochimico di questa medicina tradizionale tibetana, ma fornisce anche preziose informazioni sulle sue potenziali proprietà terapeutiche. L'integrazione di 2D-HPLC-MS e rete molecolare si rivela un potente strumento per esplorare e identificare sistematicamente composizioni chimiche complesse in erboristeria, aprendo la strada a ulteriori ricerche e sviluppi nel campo della scoperta di prodotti naturali.

Introduzione

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La medicina tibetana è parte integrante della medicina tradizionale cinese, aderisce ai principi delle pratiche mediche tibetane, ed è utilizzata per la prevenzionee il trattamento delle malattie. Tuttavia, l'erboristeria tibetana contiene complessi costituenti chimici vegetali caratterizzati da significative fluttuazioni del contenuto. La comprensione limitata degli elementi bioattivi fondamentali è diventata un collo di bottiglia nella modernizzazione della medicina tibetana2. L'applicazione della cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS), che combina il forte potere di separazione della cromatografia con l'elevata sensibilità della spettrometria di massa (MS), è stata ampiamente utilizzata nell'analisi della medicina naturale3. Tuttavia, a causa della limitazione di un singolo meccanismo di separazione, i componenti con strutture molto simili tendono a coeluire nella separazione cromatografica liquida unidimensionale. Nella successiva analisi spettrometrica di massa, i componenti co-eluiti a bassa abbondanza sono difficili da rilevare a causa della soppressione ionica causata dai componenti ad alta abbondanza4.

2D-HPLC, acronimo di cromatografia liquida bidimensionale ad alte prestazioni, rappresenta un nuovo metodo cromatografico che combina armoniosamente diversi meccanismi di separazione utilizzando una coppia di colonne. Ciò include la fusione o l'alternanza della cromatografia in fase normale con la cromatografia liquida in fase inversa e la cromatografia liquida con interazione idrofila con la cromatografia liquida in fase inversa5. Unendo queste proprietà cromatografiche complementari, si ottiene una maggiore capacità di separazione, affrontando efficacemente le sfide causate dalle matrici di campioni complesse6. Inoltre, accoppiando la cromatografia bidimensionale con la MS, la potente capacità di separazione della 2D-HPLC e l'elevata capacità di rilevamento della MS possono essere completamente integrate, fornendo supporto per lo studio di sistemi farmaceutici complessi e dei loro costituenti fondamentali 7,8,9.

La medicina tibetana presenta comunemente una serie sfaccettata di componenti e funzionalità, in cui i principi attivi sono tipicamente presenti in composizioni complesse e a concentrazioni minime. Integrando 2D-LC come robusto sistema di separazione e MS come rivelatore estremamente sensibile, le sfide poste da campioni complessi in termini di separazione e identificazione possono essere affrontate in modo più efficace 10,11,12. Questa fusione contribuisce in modo sostanziale a far avanzare l'esplorazione della composizione chimica della medicina tibetana.

Indipendentemente dal fatto che si tratti di LC-MS tradizionale o 2D-LC-MS, è possibile ottenere una grande quantità di informazioni. Tuttavia, l'estrazione di informazioni strutturali di componenti di sistemi complessi da questa enorme quantità di informazioni è sempre stata una sfida significativa. Pertanto, i ricercatori hanno sviluppato vari metodi per lo screening e l'estrazione dei dati MS. Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) è una piattaforma di organizzazione e visualizzazione dei dati MS/MS in cui è possibile caricare i dati della spettrometria di massa 2D-LC-MS13. Ogni spettro è considerato come un vettore e confrontato con tutti gli altri spettri utilizzando la somiglianza del coseno. Quando la somiglianza tra due spettri supera una soglia, sono collegati in una rete molecolare (MN). Questo può essere utilizzato per l'identificazione rapida di composti noti e la determinazione di vari prodotti naturali sconosciuti14.

La medicina tibetana di solito ha molteplici funzioni, ma la sua composizione complessa e le significative differenze di concentrazione rendono difficile chiarire efficacemente la relazione tra funzione e base materiale15. Uno studio approfondito della medicina tibetana richiede la caratterizzazione sistematica del maggior numero possibile di componenti. Nell'ambito di questo studio, intendiamo utilizzare l'APB nella medicina tibetana come oggetto di ricerca per dimostrare la strategia e il processo di studio sistematico dei complessi componenti chimici della medicina tibetana utilizzando la tecnologia 2D-HPLC-MS e la tecnologia MN. Nella costruzione del sistema cromatografico 2D, abbiamo combinato la cromatografia liquida in fase inversa e la cromatografia liquida con interazione idrofila con meccanismi di separazione significativi per ottenere una separazione più efficace dei componenti complessi di APB16. Inoltre, per superare l'incompatibilità del solvente tra le due dimensioni, è stata adottata una modalità di modulazione della diluizione in colonna. Combinando la potente capacità di separazione del 2D-LC con la capacità di rilevamento ad alta sensibilità della MS, le informazioni spettrali dei componenti complessi in APB sono ottenute in modo più efficace e completo. Inoltre, attraverso la rete e la visualizzazione di informazioni spettrali massive mediante la tecnologia MN, i componenti di APB vengono analizzati sistematicamente. Si prevede che la strategia e il processo illustrati in questo studio saranno applicati allo studio di altre medicine tibetane, promuovendo la ricerca sulle basi materiali della medicina tibetana, che è di grande importanza per far progredire le risorse della medicina tibetana e migliorare gli standard di controllo della qualità per le erbe tibetane17. Il processo sperimentale complessivo è mostrato nella Figura 1.

Nell'esperimento qui presentato, un nuovo modulatore di diluizione a colonna è stato introdotto nel sistema di cromatografia liquida bidimensionale (2D-LC)18 di Agilent. Aggiungendo una pompa di mandata indipendente, il percorso del flusso dell'analisi è stato modificato, ottenendo un'elevata ortogonalità dell'analisi 2D-LC. L'accoppiamento e la commutazione tra le due dimensioni sono realizzati da due valvole a sei vie, come mostrato nella Figura 2. Quando un ciclo di campionamento viene riempito nella prima dimensione, un altro ciclo di campionamento viene analizzato nella seconda dimensione. Ciò significa che il tempo di riempimento del ciclo 1D e il tempo di esecuzione del 2D sono uguali. Ciò richiede il gradiente veloce generato dalla pompa binaria nella seconda dimensione. Non si perdono picchi quando si analizza l'intero effluente. Ciò è particolarmente utile per l'analisi di campioni sconosciuti. Il risultato è un gran numero di cromatogrammi 2D che devono essere combinati per l'analisi dei dati.

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Protocollo

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1. Preparazione

  1. Preparazione del campione
    1. Utilizzare una bilancia con sensibilità 1/10.000 per pesare 0,25 g (peso secco) di APB in una provetta da microcentrifuga da 3 mL, aggiungere 2,5 mL di metanolo e quindi sonicare per 30 minuti (potenza 240 W, frequenza 40 kHz).
    2. Eseguire la centrifugazione a 1,2 x g per 5 minuti, raccogliere il surnatante e filtrare attraverso un filtro a membrana con una dimensione dei pori di 0,22 μm.
  2. Preparazione dei materiali sperimentali
    1. Preparare la fase mobile bidimensionale, utilizzare l'acetonitrile come fase organica B e configurare l'acqua ultrapura di acido formico allo 0,1% come fase acquosa A.
    2. Eseguire la filtrazione bifase (0,22 μm) e sonicare utilizzando una macchina a ultrasuoni (40 kHz) per 15 minuti. Spurgare la fase mobile sostituita per rimuovere le bolle. In questo esperimento, la colonna C18 è stata utilizzata come colonna 1D, la colonna idrofila come colonna 2D e la colonna è stata montata sullo strumento.
  3. Regolazione del rapporto di derivazione appropriato
    1. Collegare la linea di uscita dello strumento 2D-LC attraverso un raccordo a T all'ingresso di massa e l'altra estremità del raccordo a T a una linea deviata. Regolare la portata su un valore adeguato per assicurarsi che la portata nello spettro di massa sia 0,3-0,5 ml/min.
      NOTA: Poiché la seconda dimensione del 2D-LC è solitamente impostata su 2 mL/min, questa velocità di flusso è troppo grande per la MS, quindi è necessario eseguire una divisione.

2. Funzionamento 2D-LC

  1. Fare doppio clic sull'icona Instrument 1 Online e la workstation chimica comunicherà automaticamente con il 1260 LC ed entrerà nella workstation.
  2. Per l'impostazione dei parametri del metodo 2D-LC, selezionare la schermata Metodo ed esegui controllo dal menu Visualizza per richiamare l'interfaccia desiderata, che normalmente verrà inserita per impostazione predefinita. Fare clic sul modulo iniettore, fare clic con il pulsante destro del mouse su Metodo, impostare il volume di iniezione, la portata e il gradiente di tempo di fase mobile della pompa 1D.
  3. Immettere il tempo di esecuzione del campione in Tempo di arresto. Fare clic sul menu principale Strumento e fare clic su Metodo 2D-LC nel menu a discesa. Selezionare Completo in modalità 2D-LC. Immettere 2 minuti al tempo di modulazione , 1,9 minuti al tempo di arresto del gradiente 2D . Impostare le impostazioni di flusso su 2 ml. Modifica il gradiente 2D e imposta le lunghezze d'onda. Dopo aver modificato il metodo, selezionare Salva metodo con nome dal menu Metodo per assegnare un nome al nuovo metodo, quindi fare clic su OK.
    NOTA: La pompa di trasferimento esterna richiede l'impostazione manuale della portata.

3. Funzionamento MS

  1. Accendere l'interruttore della pompa del vuoto. Aprire la valvola principale della bombola di argon e la valvola del ripartitore di pressione e regolare la pressione a circa 0,3 MPa. Aprire la valvola dell'azoto.
  2. Attendere almeno 8 ore per garantire un vuoto adeguato alle condizioni sperimentali. Verificare che la pressione atmosferica di argon e azoto sia sufficientemente alta prima dell'analisi.
  3. Per avviare il software di controllo MS, fare clic su Sorgente SEI di riscaldamento nel pannello del software e inserire i parametri MS, tra cui la temperatura del riscaldatore (350 °C), la portata della guaina (35 arb), la portata dell'aria ausiliaria (15 arb), la tensione di spruzzo (3,8 KV in modalità positiva, -2,5 KV in modalità negativa) e la temperatura capillare (275 °C). Fare clic sul pulsante Applica per attivare la sorgente ionica.
  4. Per impostare il metodo MS, immettere i valori per configurare il tempo di acquisizione, la polarità, l'intervallo di massa, il numero del valore di trasferimento, la durata del valore di trasferimento e altro ancora. Impostare il tempo di esecuzione MS (min): 93.00. Imposta i dettagli di ScanEvent: ITMS + c norm o (100.0-1200.0), CV=0.0v. ITMS + c norm Dep MS/MS, ione più intenso da (1): Tipo di attivazione: CID, Segnale minimo richiesto: 500, Larghezza di isolamento: 2.00, Energia Coll. normalizzata: 35.0, Stato di carica predefinito: 3, Attivazione Q: 0.250, Tempo di attivazione: 93.000. Per impostare le impostazioni dipendenti dai dati, utilizzare impostazioni di polarità separate come disabilitato, Perdita neutro in alto:3, Prodotto in alto: 3. Fare clic su Salva per configurare le impostazioni come metodo dello strumento.
    NOTA: La fine del tempo di esecuzione è coerente con il 2D-LC.
  5. Fare clic sul pulsante Impostazione sequenza per aprire la tabella delle sequenze. Immettere il tipo di campione, il nome del file, il percorso, l'ID del campione, il metodo dello strumento, la posizione, la quantità di iniezione e altre informazioni nel modulo.
  6. Fare clic sul pulsante Salva per registrare l'elenco della sequenza, quindi fare clic sul pulsante Avvia analisi per impostare e avviare l'acquisizione MS. Fare clic su Run Control sullo strumento 2D-LC e selezionare Run Method (Metodo di esecuzione). Allo stesso tempo, lo strumento MS fa clic anche sul pulsante Esegui .
    NOTA: Poiché il 2D-LC e l'MS non sono controllati dallo stesso software in questo esperimento, devono essere configurati separatamente su entrambi gli strumenti.

4. Funzionamento della rete molecolare

  1. Preparazione dei dati: Esportazione di dati spettrali di massa grezzi 2D-HPLC-MS e conversione di dati spettrali di massa secondari in dati mzXML o mzML tramite Msconvert di ProteoWizard. (http://proteowizard.sourceforge.net/).
  2. Per caricare i dati, scarica il software WinSCP sul sito ufficiale e carica i dati mzML sull'account creato da GNPS tramite protocollo FTP. Una volta completata l'installazione, avvia WinSCP.
  3. Connettiti al server FTP GNPS: nell'interfaccia WinSCP, nella pagina di configurazione della sessione , inserisci le seguenti informazioni di connessione: Protocollo file: seleziona FTP. Per Nome host: Immettere massive.ucsd.edu., per Numero porta: Mantenere il valore predefinito 22.
  4. Inserisci il numero di account e la password. Dopo aver inserito le informazioni di cui sopra, fare clic sul pulsante Accedi per stabilire una connessione al server FTP GNPS.
  5. Creare reti molecolari aprendo un browser web e visitando il sito web del GNPS (https://gnps.ucsd.edu/). I nuovi utenti devono registrarsi per un account e quindi accedere.
  6. Nell'interfaccia principale del sito web GNPS, fare clic sulla scheda Attività nella barra di navigazione superiore e selezionare Crea una nuova attività dal menu a discesa. Nella pagina di creazione dell'attività, fare clic sul pulsante Aggiungi file, quindi selezionare e caricare il file di dati. (ad esempio, il formato mzML).
  7. Nella scheda Parametri attività impostare i vari parametri che generano il MN. Questi parametri includono l'algoritmo di estrazione del picco, il valore di overtravel del picco, il metodo di calcolo della somiglianza, ecc. Effettuare le impostazioni dei parametri appropriate in base alle esigenze. Fare clic sul pulsante Avvia analisi nella parte inferiore della pagina per eseguire l'attività.
  8. Dopo l'esecuzione dell'attività, individuare l'attività creata nell'elenco delle attività e fare clic sul nome del servizio per visualizzare i risultati dell'analisi. Il sito Web fornisce diagrammi MN, sostituti, reti simbiotiche e altre informazioni correlate.

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Risultati

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L'APB è stato utilizzato come organismo modello per convalidare la fattibilità della tecnologia 2D-HPLC-MS in combinazione con il metodo MN. Importando i dati grezzi MS nel MN con i parametri impostati come predefiniti, è stato generato un MN. MN è una strategia computazionale visiva che visualizza tutti gli ioni molecolari rilevati in un esperimento LC-MS-MS completo e le relazioni chimiche tra questi ioni molecolari13.

La MN si basa sui frammenti dello spettro di mass...

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Discussione

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L'obiettivo principale di questo esperimento era l'ottimizzazione di un metodo parziale nell'ambito della separazione bidimensionale della fase liquida. Per raggiungere questo obiettivo, un nuovo modulatore di diluizione in colonna è stato perfettamente integrato nel sistema di cromatografia liquida bidimensionale (2D-LC). Questo aggiustamento tecnico è stato di fondamentale importanza in quanto ha aumentato significativamente la competenza nel profilare i costituenti chimici presenti nella medicina tibetana nota come AP...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China (82130113), dalla National Natural Science Foundation of China (82204765), dalla Nature Science Foundation of Sichuan (2022NSFSC1470), dal Sichuan Provincial Postdoctoral Special Funding Project (TB2023020) e dallo Xinglin Scholars Research Promotion Program dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu (BSH2021030). Questi fondi forniscono sostegno in termini di attrezzature sperimentali, materiali sperimentali e spese di pubblicazione.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AcetonitrileFisher chimicoF22M81203Fase mobile
Aconitum pendolo//Erboristeria
medicina Agilent 1290 Infinity (II) 2D-LC Agilent TechnologiesG2198-90001Cromatografia liquida
Siringhe monousoChengdu Keen/da 1 ml
Attrezzatura sperimentale Chengdu Keen/
iniezione in fase liquidaAttrezzatura sperimentale Chengdu Keen/1,5 ml
Thermo FisherLTQ21991Spettrometro di massa
Membrane microporose Attrezzatura sperimentale Chengdu Keen/0.22μ m
Ultimate XB-C18,5 μ m,2.1 x 200 mmWelch00201-31015colonna a fase inversa
GT SonicUGT20DEC048YPulitore ad ultrasuoni 240W 40KHz
XAmide,3 μ m,100ADalian Mondi TechnologyD2019110601Colonna idrofila
Tubo EP Flacone per da 3 ml Spettrometro di massa LTQ XL da Pulitore ad ultrasuoni a

Riferimenti

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