Per studiare i comportamenti di volo in un contesto di paura, introduciamo un protocollo di condizionamento della paura modificato. Questo protocollo assicura che i topi mostrino costantemente comportamenti di volo durante la presentazione del segnale nel condizionamento della paura.
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Articolo metodologico
Condizionamento della paura modificato per indurre comportamenti di volo nei topi
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Sommario
Abstract
La manifestazione appropriata di un comportamento difensivo in una situazione minacciosa è fondamentale per la sopravvivenza. La teoria prevalente suggerisce che un comportamento difensivo attivo, come il salto o il guizzo rapido, è espresso in condizioni di imminenza di minaccia elevata o minaccia effettiva, mentre il comportamento difensivo passivo, come il congelamento, è espresso quando la minaccia è prevista, ma l'imminenza della minaccia è relativamente bassa. Nel condizionamento classico della paura, i soggetti mostrano tipicamente il congelamento come risposta difensiva condizionata, con poca espressione di comportamento difensivo attivo nella maggior parte dei casi. Qui, introduciamo una procedura modificata di condizionamento della paura per i topi per osservare la transizione dal congelamento al volo e viceversa, che coinvolge cinque accoppiamenti ripetitivi di stimoli condizionati (CS; tono continuo, 8 kHz, 95 dB SPL (livelli di pressione sonora)) e stimoli incondizionati (US; shock del piede, 0,9 mA, 1,0 s) nell'arco di due giorni. Questa procedura modificata di condizionamento della paura richiede un numero relativamente elevato di sessioni di condizionamento e giorni di condizionamento, ma non richiede una scossa del piede ad alta intensità per una modesta espressione del comportamento di volo. L'uso dello stesso contesto per il condizionamento e le presentazioni CS salienti è essenziale per suscitare comportamenti di volo. Questa procedura modificata di condizionamento della paura è un metodo affidabile per osservare i comportamenti difensivi attivi nei topi, fornendo l'opportunità di chiarire i meccanismi e le caratteristiche di tali comportamenti in un contesto di paura.
Introduzione
La selezione appropriata di comportamenti difensivi in circostanze minacciose è fondamentale per la sopravvivenza di tutti gli animali. I comportamenti difensivi si spostano gradualmente dall'uno all'altro in base alla vicinanza della minaccia, come la transizione tra i comportamenti di congelamento e di fuga 1,2,3. La disregolazione di questi comportamenti è spesso osservata in vari disturbi mentali4. Il disturbo da stress post-traumatico (PTSD) è uno di questi disturbi caratterizzati da comportamenti difensivi esagerati, come le risposte di panico a stimoli non minacciosi4.
Il condizionamento classico della paura nei roditori è comunemente usato come modello per il PTSD 5,6,7, ma i roditori non esprimono comportamenti di fuga (simili al panico) in questo modello8. Di conseguenza, il classico modello di condizionamento della paura, spesso indicato come "modello PTSD dei roditori", manca di validità facciale per il PTSD negli esseri umani, in particolare nel catturare sintomi di fuga o di panico, che non sono stati ben studiati.
Recentemente, diversi protocolli modificati di condizionamento della paura hanno dimostrato con successo che i soggetti roditori mostrano un comportamento di volo durante queste procedure. Ad esempio, le associazioni ripetitive di uno stimolo condizionato (CS) e uno stimolo incondizionato (US) sette volte in un giorno hanno permesso alle femmine di ratto di esibire comportamenti guizzanti simili ai comportamenti di volo9. Nei condizionamenti di paura di due giorni utilizzando stimoli composti seriali (SCS; composti da tono seguito da rumore), i topi hanno iniziato a mostrare comportamenti di volo durante la parte di rumore delle presentazioni SCS 10,11,12. La descrizione dettagliata del metodo SCS è fornita in un rapporto di protocollo13. Un condizionamento della paura di tre giorni con SCS ha funzionato anche per i ratti per indurre comportamenti di fuga14. Tuttavia, questi nuovi protocolli presentano alcune limitazioni. Ad esempio, l'uso della presentazione seriale dei segnali non consente di escludere l'influenza della stima di prossimità sul comportamento difensivo. Nel caso di sette volte l'associazione di CS-US nei ratti, la maggior parte delle risposte di volo sono state osservate nelle femmine piuttosto che nei maschi.
Alla luce di queste considerazioni, introduciamo un protocollo modificato di condizionamento della paura per i topi per studiare i comportamenti di volo in un contesto di paura. I topi maschi mostrano costantemente un comportamento di volo durante il nostro condizionamento della paura modificato. In questo protocollo, il tono saliente viene utilizzato come CS invece di SCS. Inoltre, è richiesto un minimo di cinque accoppiamenti di CS-US in un giorno per almeno due giorni, insieme al potenziamento della paura da parte del contesto condizionato. Il protocollo fornisce un'altra opzione per studiare i comportamenti di volo, integrando i protocolli precedenti, a seconda dello scopo della ricerca.
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Protocollo
Questo protocollo è stato condotto in conformità con i principi guida della Società Fisiologica del Giappone e ha ricevuto l'approvazione del Comitato per la cura degli animali dell'Università di Medicina di Kanazawa (2021-32). Tutte le procedure sono state condotte in conformità con le linee guida ARRIVE. Per lo studio sono stati utilizzati topi maschi adulti C57BL/6J (3-6 mesi) ed è stato precedentemente confermato che questi topi mostravano i comportamenti di volo descritti in questo manoscritto15.
1. Preparazione dell'animale
- Topi in gruppo (3-4 per gabbia; mantenuti a 23-27 °C; sotto un ciclo luce/buio di 12 ore; fornito ad libitum accesso a cibo e acqua) fino all'inizio degli esperimenti.
- Alloggiare individualmente ogni topo in una gabbia di plexiglass (14 cm × 21 cm × 12 cm) per almeno 3 giorni prima di sottoporsi a questo condizionamento della paura modificato.
2. Installazione degli strumenti/attrezzature
- Scatola di condizionamento della paura (Figura 1A)
- Utilizzare una camera di condizionamento della paura (25 cm × 25 cm × 25 cm) racchiusa in una scatola fonoassorbente (67 cm × 53 cm × 55 cm) (vedi Tabella dei materiali).
- Sono necessari due contesti (A e B). Per il contesto A, crea strisce bianche e nere sulle pareti attaccando del cartoncino di plastica bianco con dei nastri neri (3 cm di larghezza, 4 su un cartone). Usa una tavola di plastica bianca liscia per il pavimento.
- Pulisci le pareti e il pavimento con eptanolo (1%) prima di ogni sessione.
NOTA: Non viene utilizzato alcun sistema di ventilazione attivo. La pulizia con alcol alla fine della sessione diminuisce l'odore di eptanolo. - Per il contesto B, rendere l'aspetto delle pareti completamente nero rimuovendo la scheda utilizzata nel contesto A. Il pavimento è un pavimento a griglia.
NOTA: Non viene presentato alcun odore specifico a parte un leggero odore di alcol per la pulizia. - Illuminare la scatola sperimentale utilizzando un diodo a emissione di luce bianca (LED, 240 lux) (vedi Tabella dei materiali).
- Scandalistico
- Collegare un ammortizzatore scramble (vedi Tabella dei materiali) a un pavimento a griglia composto da aste in acciaio inossidabile. Questo viene utilizzato per fornire scosse al piede. L'intensità dello shock del piede è stata impostata a 0,9 mA seguendo i metodi comuni di condizionamento della paura 10,11,12,13.
- Generatore audio
- Posizionare un altoparlante (vedere la tabella dei materiali) sul soffitto. Tutti gli stimoli acustici vengono amplificati.
- Modifica e calibra digitalmente le ampiezze complessive di ogni stimolo per ottenere livelli di pressione sonora (SPL, re: 20 μ Pa) nella parte anteriore di 5 cm dell'altoparlante con un microfono da 1/4 di pollice. Presenta un'esplosione di tono continuo attraverso questo altoparlante.
NOTA: La calibrazione dell'altoparlante audio è fondamentale per esaminare l'impatto fine dello stimolo sonoro sui comportamenti difensivi durante questo condizionamento della paura modificato.
- Trasduttore
- Posizionare il pavimento della camera di prova su un trasduttore (vedere la tabella dei materiali) per il rilevamento delle vibrazioni. Il segnale proveniente dal trasduttore viene trasmesso a una scheda audio con una frequenza di campionamento di 8 kHz per registrare le vibrazioni comportamentali.
- Videocamera
- Posizionare una telecamera CMOS (vedere Tabella dei materiali) sul soffitto per seguire i movimenti del soggetto e registrare il suono nella scatola di condizionamento.
- Sistema di innesco
- Utilizzare un software audio (vedere la Tabella dei materiali) per attivare toni o scosse di piedi a tempi programmati.
NOTA: Qualsiasi stimolatore disponibile in commercio funzionerà per questo.
- Utilizzare un software audio (vedere la Tabella dei materiali) per attivare toni o scosse di piedi a tempi programmati.
3. Esperimento comportamentale
- Pianifica quattro giorni di procedure di condizionamento della paura: assuefazione (1 giorno, 5 prove), condizionamento (2 giorni, 5 prove ciascuna) e sessioni di test/estinzione (1 giorno, 5 o 15 prove). Gli intervalli intertrial variavano tra 60-75 s (Figura 1B).
NOTA: Preferibilmente, includere dieci o più soggetti in un gruppo per ottenere tendenze comportamentali affidabili. Sono necessari due o tre gruppi a seconda dello scopo dello studio.- Durante la sessione di condizionamento, presentare lo stimolo incondizionato (US) (1 s, 0,9 mA) immediatamente dopo la terminazione dello stimolo condizionato (CS) (burst di tono continuo, 8 kHz, 20 s, 95 dB SPL) come mostrato nella Figura 1B. Consegna cinque coppie CS-US in una giornata di condizionamento.
- Dopo la fine del 5° shock, lasciare il soggetto nel contesto per 1 minuto prima di rimetterlo nella gabbia di casa. Pulire la camera con alcol al 70% per la pulizia dopo ogni test comportamentale.
NOTA: L'intensità di CS e US può essere modificata a seconda dello scopo dello studio. Rapporti precedenti hanno dimostrato che una maggiore intensità di CS innesca comportamenti difensivi più attivi rispetto a quelli più morbidi15. I giorni di condizionamento possono anche essere prolungati.
- Indurre comportamenti di volo durante le presentazioni CS seguendo il programma indicato di seguito.
NOTA: In questo esperimento vengono utilizzati un CS (95 dB SPL) e un US (0,9 mA).- Il giorno 1, esporre i soggetti a 5 studi di sola CS nel contesto A.
- Nei giorni 2 e 3, i soggetti affetti da condizioni con 5 studi di associazione CS-US nel contesto B.
- Il giorno 4, esporre i soggetti a 5 prove di sola CS per la sessione di richiamo nel contesto B. In caso di test di estinzione della memoria, esporre i soggetti a 15 prove di sola CS.
NOTA: Per testare la stabilità della memoria, è utile estendere le sessioni di estinzione per 2-3 giorni. Inoltre, testare la memoria una settimana dopo invece che il giorno 4 può fornire un'ulteriore conferma della stabilità della memoria.
4. Analisi dei comportamenti difensivi
NOTA: vengono analizzati il movimento, la percentuale di congelamento e il numero di salti durante le presentazioni CS. I dettagli sono descritti di seguito. Se possibile, sarebbe meglio analizzare in doppio cieco.
- Sincronizza i tempi degli eventi nel video e i tempi degli stimoli (CS e US) utilizzando l'insorgenza del tono registrata nel video.
- Utilizza un codice personalizzato per calcolare sia i movimenti medi che quelli totali dei topi in base alla differenza nel centro di massa della silhouette del soggetto tra i fotogrammi.
NOTA: Per questa misurazione viene utilizzata un'unità arbitraria poiché la velocità di movimento dipende dalla frequenza di campionamento del filmato. - Per misurare la percentuale di congelamento, utilizzare il segnale del trasduttore in tempo.
- Pre-processare i segnali del trasduttore utilizzando un filtro passa banda 20-500 Hz.
- Calcolare l'ampiezza quadratica media del segnale del trasduttore nel tempo per ogni intervallo di 50 ms.
- Impostare una soglia per l'ampiezza del segnale per rilevare il periodo di immobilità. La durata dell'immobilità è il periodo di segnale inferiore alla soglia per più di 1 s.
- Misurare manualmente la durata del congelamento guardando il video.
- Regolare la soglia dell'ampiezza del segnale per il congelamento confrontando la percentuale di congelamento misurata manualmente e la percentuale calcolata dal segnale del trasduttore.
- Conta manualmente il numero di salti dai file video.
NOTA: Contare il numero di dardi sarà utile anche per valutare la risposta del volo.
5. Analisi statistica
- Impostare la significatività statistica a p < 0,05.
- Per confronti tra più gruppi e più fattori, eseguire un'ANOVA a più vie seguita da test post-hoc. Se viene testato un giorno specifico del programma di condizionamento, eseguire più test di confronto o test di permutazione.
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Risultati
Vengono presentati i risultati ottenuti con il condizionamento modificato della paura in topi maschi (C57BL/6J; 3-6 mesi), seguendo lo schema mostrato in Figura 1C. L'esperimento è stato progettato per indagare come il contesto condizionato influenzi l'espressione dei comportamenti di volo. Sono stati assegnati due gruppi: il Gruppo 1 (n = 10) e il Gruppo 2 (n = 10). In questo esperimento sono stati utilizzati un CS (95 dB SPL) e un US (0,9 mA).
Il giorno 1, tutti...
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Discussione
Il protocollo di condizionamento della paura modificato introdotto in questo articolo è un metodo stabile per studiare i comportamenti di volo in un contesto di paura. Impiegando questo protocollo, abbiamo scoperto che i comportamenti di fuga dei topi nel contesto pauroso sono innescati da stimoli salienti e dipendono dal contesto. Le caratteristiche del comportamento di volo non sono state ben studiate, in quanto non esisteva un protocollo adatto per osservare i comportamenti di volo. Questo protocollo sarà uno dei meto...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi contrastanti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da KAKENHI Grants JP22K15795 (a T.F.), JP22K09734 (a N.K.), JP21K07489 (a R.Y.), Kanazawa Medical University (C2022-3, D2021-4, a R.Y.) e The Naito Foundation (a T.F.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Altoparlante audio | Fostex | FT17H | |
| Amplificatore | Sony | TA-F500 | |
| Telecamera CMOS | Sanwa Supply Inc. | CMS-V43BK | |
| Camera di condizionamento della paura | Panlab S.L.U. | LE116 | |
| Pellet alimentare | Nosan | Labo MR standard | |
| LED | Yamazen | LT-B05N | |
| Microfono | ACO | tipo 4156N | |
| Scramble shocker | Panlab S.L.U. | LE 100-26 | |
| Scheda audio | Behringer | UMC202 | |
| Software audio | Software Syntrillium | Cool Edit 2000 | |
| Trasduttore | Panlab S.L.U. | LE 111 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice
Posted by JoVE Editors on 5/17/2024. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/66266
