Adattamento agli estremi della vita: evoluzione sperimentale con l'estremofilo Archaeon Sulfolobus acidocaldarius

La vita primordiale sulla Terra potrebbe aver avuto origine in ambienti estremi, come le bocche idrotermali, che sono caratterizzate da temperature e acidità estremamente^elevate. I microbi continuano ad abitare ambienti estremi, tra cui le sorgenti termali e la solfatara vulcanica. Caratterizzare le dinamiche evolutive che si verificano in queste condizioni estreme può far luce sui processi fisiologici specializzati che consentono la sopravvivenza in queste condizioni. Ciò potrebbe avere implicazioni di vasta portata, dalla nostra comprensione delle origini della diversità biologica allo sviluppo di nuovi enzimi ad alta temperatura con applicazioni biotecnologiche.

La comprensione delle dinamiche evolutive microbiche in ambienti estremi rimane limitata nonostante la sua importanza critica. Al contrario, un significativo corpus di conoscenze sull'evoluzione negli ambienti mesofili è stato acquisito attraverso l'applicazione di una tecnica nota come evoluzione sperimentale. L'evoluzione sperimentale comporta l'osservazione del cambiamento evolutivo in condizioni di laboratorio 2,3,4,5. Spesso, ciò comporta un ambiente di cambiamento definito (ad esempio, temperatura, salinità, introduzione di una tossina o di un organismo concorrente)^7,8,9. Se combinata con il sequenziamento dell'intero genoma, l'evoluzione sperimentale ci ha permesso di testare aspetti chiave dei processi evolutivi, tra cui il parallelismo, la ripetibilità e le basi genomiche per l'adattamento. Tuttavia, fino ad oggi, la maggior parte dell'evoluzione sperimentale è stata eseguita con microbi mesofili (inclusi batteri, funghi e virus 2,3,4,5, ma in gran parte escludendo gli archei). Un metodo per l'evoluzione sperimentale applicabile ai microbi termofili ci permetterebbe di capire meglio come si evolvono e contribuirebbe a una comprensione più completa dell'evoluzione. Ciò ha implicazioni potenzialmente di vasta portata, dalla decifrazione delle origini della vita termofila sulla Terra alle applicazioni biotecnologiche che coinvolgono gli "estremozimi" utilizzati nei bioprocessi ad alta temperatura¹⁰ e nella ricerca astrobiologica¹¹.

L'archaeon Sulfolobus acidocaldarius è un candidato ideale come organismo modello per lo sviluppo di tecniche di evoluzione sperimentale per i termofili. S. acidocaldarius si riproduce aerobicamente, con una temperatura di crescita ottimale a 75 °C (intervallo da 55 °C a 85 °C) e un'elevata acidità (pH 2-3)4,6,12,13,14. Sorprendentemente, nonostante le sue condizioni di crescita estreme, S. acidocaldarius mantiene densità di popolazione e tassi di mutazione paragonabili ai mesofili 7,15,16,17,18. Inoltre, possiede un genoma relativamente piccolo e ben annotato (ceppo DSM639: 2,2 Mb, 36,7% GC, 2.347 geni)¹²; S. acidocaldarius beneficia anche di robusti strumenti di ingegneria genomica, che consentono una valutazione diretta del processo evolutivo attraverso knockout genici mirati¹⁹. Un esempio notevole di ciò è la disponibilità di ceppi geneticamente modificati di S. acidocaldarius, come i ceppi auxotrofici di uracile di MW001¹⁹ e SK-1²⁰, che possono fungere da marcatori selezionabili.

Ci sono sfide significative nel condurre l'evoluzione sperimentale con termofili come S. acidocaldarius. L'incubazione prolungata ad alte temperature richiesta per questi studi impone una notevole evaporazione sia per le tecniche di coltura liquide che solide. Il funzionamento prolungato ad alte temperature può anche danneggiare i tradizionali incubatori a scuotimento che sono comunemente utilizzati nell'evoluzione sperimentale in mezzi liquidi. L'esplorazione di più temperature richiede un notevole investimento finanziario per l'acquisizione e la manutenzione di diversi incubatori. Inoltre, l'elevato consumo di energia richiesto solleva notevoli preoccupazioni ambientali e finanziarie.

Questo lavoro introduce un metodo per affrontare le sfide incontrate nell'esecuzione dell'evoluzione sperimentale con termofili come S. acidocaldarius. Basandosi su una tecnica sviluppata da Baes et al. per studiare la risposta allo shock termico^14,21, il metodo qui sviluppato utilizza termomiscelatori da banco per un'incubazione costante e affidabile ad alta temperatura. La sua scalabilità consente la valutazione simultanea di più trattamenti a temperatura, con costi ridotti per l'acquisizione di ulteriori apparecchiature di incubazione. Ciò migliora l'efficienza sperimentale, consentendo una solida analisi statistica e un'indagine approfondita dei fattori che influenzano le dinamiche evolutive nei termofili²². Inoltre, questo approccio riduce significativamente l'investimento finanziario iniziale e il consumo di energia rispetto agli incubatori tradizionali, offrendo un'alternativa più sostenibile e rispettosa dell'ambiente.

Il nostro metodo pone le basi per lo studio sperimentale delle dinamiche evolutive in ambienti caratterizzati da temperature estreme, che potrebbero aver svolto un ruolo chiave durante le prime fasi della diversificazione della vita sulla Terra. Gli organismi termofili hanno proprietà uniche, ma le loro condizioni di crescita estreme e i requisiti specializzati hanno spesso limitato la loro accessibilità come sistema modello. Il superamento di queste barriere non solo amplia le opportunità di ricerca per lo studio delle dinamiche evolutive, ma migliora anche la più ampia utilità dei termofili come sistemi modello nella ricerca scientifica.

1. Preparazione del terreno di crescita di S. acidocaldarius (BBM⁺)

NOTA: Per coltivare S. acidocaldarius, questo protocollo utilizza Basal Brock Medium (BBM⁺)²³. Questo viene preparato combinando prima le soluzioni stock inorganiche descritte di seguito per creare BBM⁻, che può essere preparato in anticipo. BBM⁺ viene quindi preparato secondo necessità aggiungendo le soluzioni stock organiche a BBM⁻. Le ricette della soluzione madre sono presentate anche nella Tabella 1. Tutti i mezzi e le soluzioni madre devono essere preparati in doppia distillazione di H₂O (ddH₂O).

1. Preparazione di soluzioni madre inorganiche per terreno di coltura
   1. Preparare la soluzione madre di oligoelementi.
      1. Preparare la soluzione madre di oligoelementi aggiungendo 9 g/L di tetraborato di sodio decaidrato (Na₂B₄O₇·10H₂O) a ddH₂O, seguito dall'aggiunta di 1:1 H₂SO₄ goccia per goccia fino a quando non si è sciolto.
      2. Introdurre in sequenza 0,44 g/L di solfato di zinco eptaidrato (ZnSO₄·7H₂O), 0,1 g/L di cloruro di rame(II) diidrato (CuCl₂·2H₂O), 0,06 g/L di molibdato di sodio diidrato (Na₂MoO₄·2H₂O), 0,06 g/L di solfato di vanadio(IV) diidrato (VOSO 4,2H₂O), 0,02 g/L di solfato di cobalto(II) eptaidrato (CoSO₄·7H₂O), e 3,6 g/L di cloruro di manganese(II) tetraidrato (MnCl_{2.4H 2}O). Autoclavare la soluzione in autoclave e conservarla a 4 °C.
   2. Preparare la soluzione madre di Fe (1000x) sciogliendo 20 g/L di cloruro ferrico esaidrato (FeCl₃·6H₂O) in ddH₂O. Sterilizzare la soluzione filtrando attraverso un filtro da 0,22 μm e conservare a 4 °C.
   3. Preparare la soluzione Brock I (1000x) sciogliendo 70 g/L di cloruro di calcio (CaCl₂·2H₂O) in acqua bidistillata (ddH₂O). Autoclavare in autoclave e conservare a 4 °C.
      ATTENZIONE: La dissoluzione di CaCl₂·2H₂O in acqua è un processo esotermico. Eseguire questo passaggio con cura. Indossare guanti a rischio termico classificati EN407 per proteggersi da lesioni. Non chiudere ermeticamente il recipiente, poiché la pressione potrebbe accumularsi.
   4. Preparare la soluzione di Brock II/III combinando 130 g/L di solfato di ammonio ((NH₄)₂SO₄), 25 g/L di solfato di magnesio eptaidrato (MgSO₄·7H₂O), 28 g/L di fosfato monobasico di potassio (KH₂PO₄) e 50 mL della soluzione madre di oligoelementi precedentemente preparata. Con l'aiuto di 1:1 H₂SO₄, regolare il pH della soluzione madre su 2-3. Sterilizzare la soluzione in autoclave e conservarla a temperatura ambiente (RT).
2. Preparazione di soluzioni madre organiche per terreno di coltura
   1. Preparare la soluzione madre di D-glucosio (100x) sciogliendo 300 g/L (30% p/v) di D-glucosio in ddH₂O e sterilizzare con il filtro (attraverso un filtro da 0,22 μm). Conservare a 4 °C.
      NOTA: Altre fonti di carbonio possono essere utilizzate al posto del D-glucosio in base ai requisiti sperimentali (ad esempio, D-xilosio).
   2. Preparare il peptone dalla soluzione madre di caseina (100x) sciogliendo il peptone dalla caseina a 100 g/L in ddH₂O. Autoclave per sterilizzare e conservare la soluzione madre a RT.
   3. Preparare la soluzione madre di uracile (100x) sciogliendo 2 g/L di uracile in ddH₂O e sterilizzare con il filtro (attraverso un filtro da 0,22 μm); conservare a −20 °C.
3. Preparazione del terreno di crescita BBM⁺ a concentrazione di lavoro 1x
   1. Innanzitutto, preparare 988 ml di ddH₂O sterile mediante autoclave.
   2. Preparare 1 L di BBM⁻ aggiungendo 1 mL di Brock Stock Solution I, 10 mL di Brock Stock Solution II/III e 1 mL di Fe stock solution ai 988 mL di ddH₂O sterile sterilizzato in autoclave in precedenza. Regolare il pH del fluido nell'intervallo 2-3 con 1:1 H₂SO₄.
      NOTA: BBM⁻ può essere effettuata in anticipo e conservata presso RT per un massimo di 1 mese.
   3. Infine, per produrre 1 L di BBM⁺, combinare 10 mL di soluzione madre di D-glucosio, peptone dalla soluzione madre di caseina e soluzione madre di uracil con 985 mL di BBM⁻. Mescolare bene e regolare il pH del terreno a 2-3 con 1:1 H₂SO₄.
      NOTA: BBM⁺ deve essere preparato al momento secondo necessità.
4. Preparazione del terreno solido BBM⁺
   1. Preparare 1 M di soluzioni madre di MgCl₂ e CaCl₂; questi aiuteranno nella solidificazione del mezzo solido BBM. Per 1 M MgCl₂, aggiungere 9,5 g a 100 mL di ddH₂O. Per 1 M CaCl₂, aggiungere 11 g a 100 mL di ddH₂O. Autoclave da sterilizzare.
      ATTENZIONE: La dissoluzione di CaCl₂·2H₂O in acqua è un processo esotermico. Eseguire questo passaggio con cura. Indossare guanti a rischio termico classificati EN407 per proteggersi da lesioni. Non chiudere ermeticamente il recipiente, poiché la pressione potrebbe accumularsi.
   2. Miscelare il 3% (p/v) di gomma di gellano (ad es. 30 g/L) in ddH₂O e sterilizzare in autoclave.
      NOTA: La gomma di gellano (ad es. Gelrite) viene utilizzata come agente gelificante, poiché l'agar batteriologico standard non può solidificare a 75 °C.
   3. Separatamente, preparare BBM⁺ per il terreno solido, che deve essere miscelato in rapporto 1:1 con la gomma di gellano sterile preparata al punto 1.4.1.
      1. Per prima cosa, preparare 1 L BBM⁻ come al punto 1.3.2. Combinare 887 mL di BBM⁻ con 1 mL di soluzione madre di Fe e 20 mL ciascuno di soluzione madre di D-glucosio, peptone dalla soluzione madre di caseina e soluzione madre di uracil.
      2. Aggiungere 40 mL di 1 M di MgCl₂ e 12 mL di 1 M di CaCl₂. Mescolare bene e regolare il pH del terreno a 2-3 con 1:1 H₂SO₄.
         NOTA: I volumi delle soluzioni madre aggiunte qui sono intenzionalmente maggiori rispetto alla preparazione di BBM⁺ liquida nel passaggio 1.3. Questo per tenere conto della miscelazione in un rapporto 1:1 con la gomma di gellano fusa nel passaggio successivo.
   4. Preriscaldare il BBM⁺ per un terreno solido a circa 75 °C e mescolare in un rapporto 1:1 con la gomma di gellano fusa in ddH₂O. Mescolare bene e versare in plastica termostabile (ad es. polipropilene), piastre di Petri di vetro o piastre a sei pozzetti per la crescitadi S. acidocaldarius. Utilizzare l'agar agar immediatamente dopo averlo frullato, poiché si solidificherà rapidamente.
      NOTA: Alcune piastre di Petri in polistirene da 90 mm comunemente utilizzate per la microbiologia si deformano se incubate ad alte temperature per periodi prolungati.
      ATTENZIONE: Adottare le opportune precauzioni di sicurezza quando si ha a che fare con liquidi caldi; indossare guanti a rischio termico classificati EN407 per proteggersi da lesioni.

2. Rivitalizzare S. acidocaldarius da una coltura di stock congelato

1. Preparazione di tubi di crescita ventilati per garantire una sufficiente aerazione e disponibilità di ossigeno.
   1. In anticipo, preparare provette per microcentrifuga forate da 2 ml per la crescita di Sulfolobus . Scaldare con cura il filo smussato (>0,7 mm, come una graffetta raddrizzata) utilizzando la fiamma di un bruciatore Bunsen e forare il coperchio del tubo, creando un piccolo foro di circa 1 mm.
   2. Posizionare le provette forate in un recipiente autoclavabile (ad es. scatola vuota del puntale della pipetta) e sterilizzarle in autoclave.
      ATTENZIONE: Indossare guanti a rischio termico classificati EN407 per proteggersi da lesioni termiche alle mani dovute al metallo riscaldato. Riscaldare il filo solo per un breve periodo (1-2 s) per evitare il surriscaldamento. Devono essere utilizzati solo metalli con un'elevata temperatura di fusione (acciaio).
2. Inoculare colture starter di S. acidocaldarius.
   1. Riempire le provette forate autoclavate da 2 mL con 1,5 mL di BBM⁺ preriscaldato (come preparato nella sezione 1, pre-incubato a 75 °C per almeno 15 min).
   2. Inoculare le provette riempite con BBM⁺ con un raschiamento (equivalente a 50 - 60 mg) da una riserva di glicerolo (25% v/v di glicerolo, conservato a -80 °C). Qui viene utilizzato il ceppo DSM639 di S. acidocaldarius . Riempire una provetta aggiuntiva con 1,5 mL di BBM+ come controllo negativo.
3. Per evitare che gli aerosol fuoriescano dal coperchio forato della provetta da 2 mL e contaminino l'ambiente di crescita (e qualsiasi altro campione) e per ridurre la variabilità dell'evaporazione della coltura all'interno delle provette, posizionare una membrana permeabile ai gas sulla parte superiore del coperchio in grado di resistere a temperature elevate (65-85 °C) e bloccare la fuga/infiltrazione microbica.
   NOTA: L'utilizzo di membrane permeabili ai gas per la sigillatura dei tubi riduce notevolmente l'evaporazione. Durante un periodo di 48 ore a 75 °C, le provette sigillate mostrano una perdita di volume media dell'8,63% (intervallo: 3,29-16,45%, n = 24 repliche tecniche, ripetute due volte), rispetto al 25,05% (intervallo: 11,92-62,91%, n = 24 repliche tecniche, ripetute due volte) per le provette non sigillate.
4. Incubare le provette inoculate in un termomiscelatore a 75 °C con agitazione costante a 400 giri al minuto (RPM) per 48-72 ore o fino al raggiungimento di_{OD 600nm} di 0,3 - 0,8 misurato dallo spettrofotometro.
   NOTA: Il coperchio forato delle provette da 2 ml e l'agitazione consentono un'aerazione appropriata per una crescita ottimale. Il coperchio del termomiscelatore deve essere in posizione per garantire il mantenimento di una temperatura costante e per ridurre l'evaporazione.
5. Dopo il periodo di incubazione, dare alle colture rianimate una seconda fase di crescita (precondizionamento).
   1. Pellettare le colture facendo girare i tubi a 5000 x g per 2 minuti a RT. Quindi, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in BBM⁺ caldo fresco da 1,5 mL.
      NOTA: Questo esperimento utilizza il ceppo selvatico DSM639 di S. acidocaldarius , ma questi metodi di crescita ed evoluzione sperimentale possono essere applicati a qualsiasi ceppo di Sulfolobus e potenzialmente ad altri termofili.

3. Determinazione della densità di popolazione, del tempo di raddoppio e della fase di crescita esponenziale di S. acidocaldarius

1. Determinare la densità della popolazione e il tempo necessario per la fase di crescita esponenziale per le condizioni di selezione scelte. Per ogni condizione ambientale da testare, preparare tre colture starter seguendo i passaggi 2.1-2.5.
2. Diluire le tre colture in BBM⁺ a un OD_600nm di 0,01. Produrre almeno 20 ml da ciascuna coltura. Queste tre lingue rappresentano repliche tecniche.
3. Esegui la replica delle curve di crescita di OD_600nm nel tempo utilizzando il campionamento distruttivo.
   1. Preparare 24 provette forate da 2 mL dal passaggio 2.1, separarle in tre serie da otto ed etichettare queste repliche tecniche 1, 2 e 3 (ad esempio, otto provette etichettate come replica 1 ecc.).
   2. Da ciascuna delle tre colture diluite della fase 3.2, pipettare 1,5 mL in sette provette preparate. Riempire la provetta rimanente con 1,5 mL di BBM+ come controllo negativo.
4. Incubare tutte le 24 provette in un termomiscelatore a 75 °C e 400 giri/min. Sigillare con una membrana permeabile ai gas. A intervalli regolari (ad esempio 0, 4, 8, 12, 24, 36, 48 ore), rimuovere un tubo da ciascuna delle tre repliche e misurare OD_600nm utilizzando uno spettrofotometro, quindi scartare il tubo. Sostituire la membrana permeabile ai gas dopo aver rimosso un tubo.
5. Parallelamente, determinare la relazione tra OD_600nm e densità di popolazione. Eseguire diluizioni seriali (da 1 x ^10-1 a 1 x ^10-6) in terreno BBM⁺ per almeno tre punti temporali (idealmente, inizio, metà e fine). Inoculare 100 μl di ciascuna diluizione su terreno solido BBM⁺ (preparato come al punto 1.4).
   NOTA: Per ottenere una crescita costante delle colonie e conteggi accurati, è meglio pipettare la coltura diluita su un terreno solido in un punto senza eseguire la diffusione meccanica, ad esempio utilizzando uno spandiconcime a forma di L o perle di vetro. La diffusione meccanica sembra avere un impatto negativo sulla formazione delle colonie.
6. Incubare le piastre in un'incubatrice statica a 75 °C fino alla comparsa delle colonie (5-7 giorni).
   1. Durante questo periodo di tempo, mantenere l'incubatrice umida per evitare un'eccessiva essiccazione delle piastre, altrimenti non si formeranno colonie.
   2. A tale scopo, posizionare le piastre in una scatola di polipropilene chiusa e rivestita con un panno umido. Forare il coperchio della scatola almeno tre volte per consentire l'aerazione.
   3. Metti secchi d'acqua nell'incubatrice per aumentare l'umidità. Riempi i secchi ogni giorno.
7. Una volta raccolte tutte le misurazioni di OD_600nm , determinare il tempo di raddoppio e il tempo per raggiungere la fase di crescita esponenziale adattando una curva logistica alla relazione tra OD_600nm e il tempo, ad esempio, utilizzando SummarizeGrowth dal pacchetto growthcurver in R.
8. Una volta che le colonie visibili si sono formate su terreni solidi, contare le unità formanti colonie (CFU), con l'obiettivo di contare dal fattore di diluizione, producendo 50-100 colonie per la migliore precisione.
9. Calcolare la densità cellulare nel terreno di coltura utilizzando la formula: UFC/mL = numero di colonie/(volume di piattello × fattore di diluizione).
10. Eseguire la regressione lineare log-log per determinare la relazione tra log10 (CFU) e log10 (OD_600nm). Quindi, calcola il CFU/mL previsto per un dato OD dalla pendenza e dall'intercetta del modello di regressione: CFU previsto = 10^{[pendenza × log10(OD600nm) + intercetta]}.
11. (Facoltativo) Inoltre, eseguire i passaggi 3.1-3.10 in un incubatore a scuotimento per determinare se si sta ottenendo una crescita comparabile nei termomiscelatori.

4. Avvio di lignaggi indipendenti per l'evoluzione sperimentale

1. Giorno 1: Per generare singole colonie, eseguire prima tutti i passaggi della sezione 2 di cui sopra per generare una cultura iniziale.
2. Giorno 3: Misurare OD_600nm della coltura per assicurarsi che abbia raggiunto una densità sufficiente nella fase esponenziale (OD_600nm 0,3-0,8 con spettrofotometro).
3. Creare diluizioni seriali della coltura di S. acidocaldarius DSM639 da 1 x ^10-1-1 x ^10-6 e distribuire 100 μL da ogni diluizione 1 x ^10-5 e 1 x ^10-6 in pozzetti di una piastra a 6 pozzetti contenente terreno solido BBM⁺ (Sezione 1 e Tabella 1) in diverse repliche. Incubare le piastre a 75 °C in un'incubatrice statica come al punto 3.5 per 5-7 giorni per l'emergere di singole colonie.
4. Giorno 8-10 (5-7 giorni dopo l'incubazione):
   1. Stabilisci il numero di lignaggi in evoluzione da singole colonie. Per ogni lignaggio, scegli una colonia a caso dalle piastre usando un ciclo di inoculazione. Risospendere la colonia in una provetta forata da 2 mL contenente 1,5 mL di terreno BBM⁺ preriscaldato. Etichettare adeguatamente il tubo.
   2. Ripetere per il numero desiderato di lignaggi; qui sono stati stabiliti sette lignaggi etichettati SA1-7. Riempire una provetta aggiuntiva con 1,5 mL di BBM+ come controllo negativo.
   3. Sigillare la parte superiore delle provette con una membrana traspirante e incubare in un termomiscelatore a 75 °C, 400 giri/min per 48-72 ore, fino a quando le colture diventano torbide (equivalenti a OD_{600 nm} 0,3-0,8 con spettrofotometro).
5. Giorno 10-12 (7-9 giorni dopo l'inoculazione):
   1. In una centrifuga da banco, centrifugare le colture clonali a 5.000 x g per 1 minuto a RT. Scartare il surnatante e risospendere il pellet con 200 μL di BBM⁺ liquido.
   2. Miscelare le sospensioni cellulari da 200 μl con 200 μl di glicerolo al 50% (25% v/v glicerolo) per creare stock di glicerolo dei sette lignaggi indipendenti e conservare a -80 °C. Queste sono le popolazioni ancestrali per gli esperimenti di evoluzione.

5. Esecuzione dell'esperimento di evoluzione della temperatura

NOTA: Nella Figura 1 è riportato un diagramma concettuale che delinea gli aspetti principali del protocollo dell'esperimento.

1. Usa le sette popolazioni ancestrali generate nella sezione 4 per l'esperimento di evoluzione.
   1. Eseguire tutti i saggi di evoluzione sperimentale in provette sterili da 2 mL perforate e sigillate con una membrana permeabile (descritto sopra, sezione 2).
   2. Accanto a queste popolazioni, mantenere separate provette forate da 2 mL con 1,5 mL di BBM⁺ come controlli negativi privi di coltura per monitorare la contaminazione (crociata) e impostare una soglia per OD che indichi l'assenza di crescita della coltura.
2. Stabilire i trattamenti di temperatura: l'uso di termomiscelatori consente di stabilire più trattamenti di temperatura. In questo caso, utilizzare i seguenti trattamenti di temperatura: costante 75 °C, costante 65 °C e scendendo gradualmente da 75 a 65 °C diminuendo la temperatura di 1 °C ogni 4 giorni ("trattamento a goccia di temperatura").
   NOTA: Questi trattamenti possono essere adattati a specifiche esigenze sperimentali. Per ogni trattamento di temperatura è necessario un termomiscelatore separato.
3. Giorno 1: Risvegliare le popolazioni ancestrali dalle loro scorte di glicerolo (preparato al punto 4.5) seguendo i passaggi descritti nella sezione 2.
4. Giorno 3:
   1. Diluire queste colture a un OD_600nm di 0,01 (misurato dallo spettrofotometro) fino a un volume totale di almeno 6 mL di BBM⁺ preriscaldato. Aliquotare 1,5 mL da ciascuna delle sette colture di popolazione ancestrale diluite in tre provette forate separate da 2mL, una per ogni trattamento termico stabilito nella fase 5.2.
      NOTA: Questa fase di aliquotazione assicura che qualsiasi variazione genetica presente in ogni popolazione ancestrale sia presente in tutti i trattamenti di temperatura all'inizio dell'esperimento di evoluzione. Queste colture fungeranno da trasferimento 0 (Tx0) per iniziare l'esperimento di evoluzione della temperatura.
   2. Sigillare i tubi con la membrana traspirante e posizionare ogni serie di sette popolazioni ancestrali in termomiscelatori separati. Impostare ogni termomiscelatore alla temperatura richiesta e a 400 giri/min per iniziare l'esperimento di evoluzione.
5. Giorno 5:
   1. Dopo 48 ore, eseguire il trasferimento 1 (Tx1) inoculando 1,5 mL di terreno BBM⁺ riscaldato in una provetta forata da 2 mL con 15 μL di coltura da ciascuna delle colture Tx0 (diluizione 1:100). Per una maggiore velocità, eseguire questo passaggio con una pipetta multicanale a larghezza variabile per completare all'unisono più trasferimenti da un singolo esperimento, riducendo il tempo in cui le colture sono fuori dal termomiscelatore.
   2. Come in precedenza, sigillare le provette prima di rimetterle in posizioni casuali nei rispettivi termomiscelatori. Effettuare la randomizzazione manualmente o tramite i randomizzatori a 96 pozzetti iMetaLab.
6. Misura il diametro esterno_{di 600 nm} di Tx0 in uno spettrofotometro a piastra (200 μl in piastre a 96 pozzetti; lo stesso volume di BBM⁺ viene utilizzato come bianco) per monitorare la crescita dei lignaggi indipendenti.
   NOTA: Il diametro esterno_{di 600 nm} deve essere misurato dopo aver eseguito il trasferimento su un mezzo nuovo per evitare contaminazioni. La densità ottica può essere misurata anche con altri mezzi, ad esempio con uno spettrofotometro standard. L'uso di uno spettrofotometro a piastre consente la misurazione simultanea di più colture, semplificando il processo.
7. Ripetere i passaggi 5.5 e 5.6 nei giorni 7, 9, 11, ecc., corrispondenti a Tx2, Tx3, Tx4, ecc. Mantenere la temperatura costante per i trattamenti a 75 °C e 65 °C. Per il trattamento di caduta di temperatura, diminuire la temperatura di 1 °C ogni secondo trasferimento (ad esempio, su Tx2, Tx4, Tx6, ecc.).
8. Preparare le scorte di glicerolo (passaggio 3.2.3) delle popolazioni dopo ogni 10^{° trasferimento (} ad esempio, Tx10, Tx20, ecc.), etichettando la provetta con l'identificatore della popolazione ancestrale (ad esempio, SA1 per la prima^{popolazione indipendente)} e il numero di trasferimento (ad esempio, Tx10 per il 10^{° trasferimento).} Utilizzare queste scorte di glicerolo in un secondo momento per rianimare le popolazioni per studiare come le popolazioni sono cambiate nel tempo o per riavviare l'esperimento, se necessario (ad esempio, a causa di contaminazione o incidenti imprevisti con conseguente perdita di colture).
9. Lasciamo che l'esperimento proceda o per un numero predeterminato di trasferimenti o fino a quando non sia trascorso un numero predeterminato di generazioni. Durante il trasferimento finale, preparare le scorte di glicerolo di tutti i lignaggi discendenti.
   NOTA: Qui, l'esperimento è proseguito fino a quando il trattamento di caduta di temperatura ha raggiunto i 65 °C, che si è verificato su Tx22. Ciò corrisponde a circa 150 generazioni (calcolato sulla base del fattore di diluizione di 100 in 4,6: log₂(100) = 6,64 generazioni per trasferimento). La durata degli esperimenti di evoluzione può essere regolata in base alle esigenze sperimentali.

6. Saggi di crescita dell'esperimento post-evoluzione: lignaggi ancestrali vs. evoluti

NOTA: Nella Figura 2 è riportato un diagramma concettuale che delinea il protocollo del test di crescita/idoneità.

1. Preparare provette forate da 2 mL con BBM⁺ da 1,5 mL. Prepara abbastanza tubi per far crescere tutti i lignaggi discendenti più ciascuno dei ceppi ancestrali.
2. Rianimare le popolazioni ancestrali, e ogni popolazione discendente conservata nel passaggio 5.9 dopo il trasferimento finale dell'esperimento di evoluzione utilizzando il metodo descritto nei passaggi 2.2-2.5, ma con l'incubazione alla temperatura che ogni popolazione ha sperimentato per gli ultimi due trasferimenti dell'esperimento di evoluzione, cioè 75 °C per il trattamento costante a 75 °C e 65 °C per gli esperimenti di costante e caduta di temperatura a 65 °C. Per ottenere densità di popolazione comparabili, condurre l'incubazione a 75 °C per 72 ore e l'incubazione a 65 °C per 120 ore.
3. Misura OD_600nm delle colture coltivate tramite uno spettrofotometro a piastra.
4. Eseguire saggi di crescita di ogni popolazione discendente e di ogni ceppo ancestrale a entrambe le temperature (ad esempio, 75 °C e 65 °C) in tre repliche. Preparare provette da centrifuga forate da 2 ml con 1,5 ml di BBM⁺. Prepara sei tubi per ogni lignaggio evoluto e ogni ceppo ancestrale. Etichettare le provette con il nome del lignaggio (SA1-7 o antenato), la temperatura di crescita (75 °C o 65 °C) e l'ID della replica (1, 2 o 3).
   NOTA: Se sono disponibili meno di sei termomiscelatori, il test di crescita può essere replicato per più giorni su diversi blocchi sperimentali. In questo caso, è importante misurare ogni lignaggio e antenato in ogni blocco sperimentale in modo che gli effetti del blocco possano essere stimati e contabilizzati statisticamente.
5. Inoculare il terreno fresco nelle sei provette preparate con 15 μL di coltura di ogni lignaggio discendente e ceppo ancestrale.
6. Impostare tre termomiscelatori a 75 °C e tre termomiscelatori a 65 °C, designando ciascun termomiscelatore con un ID replicato. Posizionare i tubi nel termomiscelatore corrispondenti alla temperatura e replicare l'ID. All'interno di ciascun termomiscelatore, assicurarsi che i lignaggi e gli antenati siano posizionati in modo casuale per controllare l'eterogeneità.
7. Sigillare ogni set di 24 provette con una membrana permeabile. Incubare per 48 h.
8. Trasferire 200 μl da ciascuna coltura in una piastra a 96 pozzetti. Misura OD_600nm utilizzando uno spettrofotometro.
   NOTA: È possibile utilizzare una pipetta multicanale a larghezza variabile per facilitare il trasferimento tra le provette per microcentrifuga e le piastre a 96 pozzetti.
9. Tracciare e analizzare i dati utilizzando software statistici (ad esempio, R).

7. Sequenziamento dell'intero genoma di linee evoluti e identificazione di mutazioni

1. Ravvivare i lignaggi discendenti conservati nella fase 5.9 in BBM⁺ preriscaldato a 75 °C di 48-72 ore inoculando un raschietto di ghiaccio da ciascuna popolazione congelata in BBM⁺ come nella sezione 2, fasi 2.2-2.5. Preparare tra 1 e 10 ml di volume di coltura per ottenere una quantità sufficiente di DNA genomico. Il volume esatto richiesto dipende dall'opzione scelta per il sequenziamento nei passaggi 7.2 o 7.3 (di seguito).
   NOTA: È buona norma sequenziare anche il ceppo utilizzato per avviare le popolazioni ancestrali. Questo per determinare correttamente se le mutazioni rilevate nelle linee discendenti sono sorte durante l'esperimento di evoluzione e non prima.
2. (Opzione 1) Estrai il DNA genomico e prepara le librerie di sequenziamento Illumina per il sequenziamento Illumina.
   1. Estrai e purifica il DNA genomico utilizzando un kit commerciale per l'estrazione del DNA genomico per batteri.
   2. Assicurati che il DNA genomico estratto soddisfi i requisiti di quantità e qualità del fornitore di sequenziamento utilizzando kit commerciali raccomandati dal fornitore.
   3. Eseguire la preparazione della libreria di DNA genomico utilizzando un kit commerciale secondo il protocollo del produttore. Si consiglia un protocollo paired-end da 250 bp. Conservare il DNA genomico estratto a -20 °C fino al momento dell'invio dei campioni al fornitore di sequenziamento.
3. (Opzione 2) In alternativa, è possibile inviare i campioni a un fornitore commerciale che esegue l'estrazione del DNA, i controlli di qualità del DNA genomico, la preparazione della libreria Illumina e il sequenziamento Illumina come servizio combinato.
4. Analizza i genomi sequenziati per identificare le mutazioni.
   1. Ricevere i file FASTQ e, se non già eseguito dal fornitore di sequenziamento, eseguire il taglio dell'adattatore utilizzando Trimmomatic con un cutoff di qualità a finestra scorrevole di Q15.
   2. Utilizzando i file FASTQ tagliati, eseguire la pipeline breseq (versione 0.38.1) per rilevare le mutazioni, confrontando le letture del DNA genomico con la sequenza di riferimento per il ceppo scelto. Per S. acidocaldarius DSM639, questo è l'ID RefSeq NC_007181.

8. (Facoltativo) Valutazione del consumo energetico del termomiscelatore rispetto al consumo energetico dell'incubatore

1. Per confrontare il consumo energetico dell'utilizzo di un incubatore rispetto a un termomiscelatore per la crescita, misurare il consumo energetico di ciascun dispositivo nell'arco di 24 ore utilizzando una spina di monitoraggio dell'energia.
2. Utilizzare due prese per misurare il consumo energetico di entrambi i dispositivi contemporaneamente. In alternativa, misurare il consumo di energia in giorni successivi.
3. Scollegare l'incubatrice o il termomiscelatore dalla presa elettrica. Collegare la spina di monitoraggio dell'energia alla presa e inizializzarla secondo le istruzioni del produttore, inclusa l'installazione del software di monitoraggio e controllo.
4. Collegare l'incubatrice o il termomiscelatore alla spina di monitoraggio dell'energia e lasciarlo funzionare per un minimo di 2 ore (ma idealmente per 24 ore o più) per ottenere una buona stima del consumo energetico tipico. Registra il consumo energetico di ciascun dispositivo.

Misure della curva di crescita
Le curve di crescita per S. acidocaldarius DSM639 sono mostrate nella Figura 3A. La crescita è risultata simile quando si confronta l'incubazione con termomiscelatori con quella negli incubatori convenzionali. I parametri del tasso di crescita medio sono stati stimati adattando una curva logistica a ciascuna curva di crescita replicata e calcolando la media e l'errore standard. I tempi per la fase esponenziale media sul termomiscelatore e sull'incubatore sono stati rispettivamente di 27,2 ore ± 1,1 ore e 31,1 ore ± 1,9 ore. I tempi di raddoppio iniziali stimati per il termomiscelatore e l'incubatore a 75 °C erano rispettivamente di 4,29 ore ± 0,28 ore e 4,19 ore ± 0,44 ore, il che è coerente con i valori precedentemente pubblicati24. La relazione tra log10 (OD600nm) e log10 (CFU) è stata ben caratterizzata da un modello lineare (aggiustato R2 = 0.82, F(1,22) = 104, p < 0.00001, pendenza = 1.73 ± 0.17, intercetta = 9.73 ± 0.14). La relazione tra OD600nm e CFU è quindi data dalla formula CFU = 10(1.73 × log10(OD600nm) + 9.73). Un OD600nm di 0,3 corrisponde quindi a circa 6,7 × 108 CFU/mL (Figura 3B).

Esperimento di evoluzione della temperatura
Tre condizioni di temperatura, costante 75 °C, costante 65 °C e calo di temperatura (75-65 °C, decrescente di 1 °C ogni due trasferimenti), sono state avviate utilizzando sette linee indipendenti derivate da S. acidocaldarius DSM639. Le misure OD600nm sono state effettuate dopo ogni trasferimento nei 45 giorni dell'esperimento (circa 150 generazioni a 75 °C) e sono mostrate nella Figura 4. Le misurazioni OD600nm effettuate nell'arco di un giorno sono intrinsecamente rumorose, in quanto possono essere soggette a sottili differenze, ad esempio, nel periodo di crescita, nella temperatura, ecc. Tuttavia, le misurazioni effettuate nell'arco dei giorni possono ancora essere utili per valutare la vitalità della popolazione, oltre a fornire un'indicazione se la forma fisica sta migliorando nel tempo. I lignaggi dalla condizione costante di 75 °C sono aumentati in OD600nm da un intervallo iniziale di 0,125-0,3 a un intervallo di 0,248-0,471 entro la fine dell'esperimento. Ciò suggerisce che la forma fisica è migliorata con questo trattamento. Al contrario, i lignaggi del trattamento costante a 65 °C hanno mostrato un calo di OD600 nm, da un intervallo iniziale di 0,018-0,087 a 0,008-0,04 al punto temporale finale. Ciò suggerisce che le popolazioni non sono state in grado di adattarsi alla temperatura costante di 65 °C, anche se il fatto che gli organismi vitali siano stati recuperati dimostra che le popolazioni non sono state lavate via attraverso diluizioni successive, suggerendo un certo grado di adattamento. Infine, le popolazioni nel trattamento con caduta di temperatura sono aumentate dall'intervallo iniziale diOD 600nm di 0,099-0,279 a 0,3-0,39 a Tx6 (corrispondente a 288 ore e 73 °C in questo trattamento), seguito da una diminuzione costante a un intervallo di 0,003-0,024 al punto temporale finale.

Saggi di crescita/fitness
Sono stati eseguiti saggi di fitness per ogni popolazione discendente dopo gli esperimenti di evoluzione. OD600nm è stato analizzato dopo una crescita di 48 ore per tutti e sette i lignaggi indipendenti, seguito dall'adattamento di modelli lineari in R per ciascuna temperatura di analisi, con "ambiente di selezione" come effetto principale e "replica/termomiscelatore" come effetto blocco. La crescita del ceppo ancestrale è stata utilizzata come livello di riferimento per i contrasti terapeutici. I dati sono mostrati nella Figura 5.

Quando analizzato a 75 °C, ci sono stati in media aumenti significativi della fitness rispetto alla tensione ancestrale per i trattamenti a partire dai trattamenti costanti di 75 °C (t-test: t210=3,64, p=0,0003) e costanti 65 °C (t-test: t210=2,8, p=0,005), ma non dal trattamento con caduta di temperatura (t-test: t210=-0,87, p=0,38). Quando sono stati analizzati a 65 °C, in media, i lignaggi di tutti i trattamenti hanno mostrato un aumento della fitness (lignaggi costanti a 75 °C; t-test: t210=4,68, p<0,0001, linee costanti a 65 °C; T-test: T210,=4.24, p<0.0001, linee di caduta di temperatura; test t: t210=3,15, p=0,002). Tuttavia, per entrambe le temperature del saggio, c'erano notevoli differenze tra i lignaggi nella loro idoneità (Figura 5). Alcuni lignaggi non differivano considerevolmente dal ceppo ancestrale o erano diminuiti nella forma fisica; Ciò era particolarmente evidente per i lignaggi derivanti dal trattamento con caduta di temperatura.

Vale la pena notare che la relazione tra OD600nm e CFU/mL potrebbe essere cambiata durante l'esperimento di evoluzione. Questo può essere valutato determinando i parametri di crescita per i lignaggi evoluti (seguendo i passaggi 3.1-3.10).

Risultati del sequenziamento dell'intero genoma
L'analisi dell'intero genoma è stata effettuata utilizzando breseq (versione 0.38.1)25 sui sette lignaggi dalla condizione costante di 75 °C utilizzando il genoma di riferimento di S. acidocaldarius DSM639 (adesione RefSeq NC_007181.1). È stata rivelata una varietà di mutazioni che coinvolgono inserzioni, delezioni e polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) nei genomi di tutte le linee discendenti (Tabella 2). Inserimenti multipli e mutazioni non sinonime erano presenti nei geni codificanti proteine, così come nelle regioni intergeniche che possono influenzare l'espressione genica a causa di frameshift nelle regioni promotrici dei geni. Alcune delle mutazioni erano coerenti in più linee discendenti in geni coinvolti in varie funzioni come la biosintesi della parete cellulare, la trascrizione, il metabolismo, il trasporto cellulare e l'attività catalitica (Tabella 2). Tra queste mutazioni c'era una grande delezione di 54.667 coppie di basi in cinque dei sette lignaggi; Ciò è stato confermato da un grafico delle prove di copertura mancanti per ciascuna popolazione (frequenza variabile dal 93,2% al 100%). La regione eliminata equivale a una perdita di 53 geni; I ruoli di questi geni nell'adattamento saranno studiati in studi futuri. Sono state notate alcune differenze tra l'isolato utilizzato di DSM639 e la sequenza di riferimento pubblicata (mostrata nella Tabella supplementare 1).

Consumo energetico dell'incubatore a scuotimento rispetto al termomiscelatore
Il consumo energetico di un incubatore ad agitazione è stato confrontato con quello di un termomiscelatore utilizzando una presa intelligente per il monitoraggio dell'energia disponibile in commercio in una gamma di temperature di incubazione comuni e alla temperatura di 75 °C qui utilizzata. A 75 °C, il termomiscelatore ha consumato circa 1/40dell'energia di un incubatore a scuotimento tradizionale (Figura 6), suggerendo che i termomiscelatori sono un potenziale mezzo per ridurre l'impronta di carbonio associata all'evoluzione sperimentale.

Figura 1: Diagramma di flusso che illustra il protocollo dell'esperimento evolutivo attraverso tre trattamenti di temperatura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Diagramma di flusso che illustra le fasi del protocollo del saggio di crescita/fitness. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Determinazione dei parametri chiave di crescita e confronto dei dispositivi di incubazione per S. acidocaldarius DSM639. Tre colture replicate sono state coltivate a 75 °C in 7 provette separate. Il campionamento distruttivo è stato utilizzato per misurare (A) OD600nm (significa ±errore standard di n=3 repliche tecniche; alcune barre di errore sono più piccole dei simboli di tracciamento); le curve rappresentano modelli logistici di crescita adattati e (B) unità formanti colonie (CFU); rappresentano modelli di regressione lineare log-log adattati). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Risultati rappresentativi per le densità ottiche (OD600nm) ottenuti durante gli esperimenti di evoluzione. Densità ottiche di lignaggi indipendenti misurate durante gli esperimenti di evoluzione sotto tre trattamenti di temperatura (costante 65 °C, costante 75 °C, goccia 75 °C-65 °C) condotti su circa 150 generazioni. Le curve rappresentano l'attenuazione del Loess nel tempo per ogni lignaggio indipendente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Risultati rappresentativi per i saggi di crescita. Saggi di crescita per lignaggi indipendenti derivati da S. acidocaldarius DSM639 a seguito di esperimenti di evoluzione della temperatura (costante 65 °C, costante 75 °C, calo 75 °C-65 °C) rispetto al ceppo antenato. Per tutti i lignaggi, la crescita è stata dosata a 65 °C e 75 °C. I punti colorati mostrano la media ± l'errore standard delle repliche tecniche (mostrato in grigio, n = 12 per l'antenato e n = 3 per ogni lignaggio evoluto). La barra grigia denota l'errore medio ± standard dell'idoneità ancestrale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Consumo energetico degli incubatori tradizionali rispetto ai dispositivi termomiscelatori. Il consumo di energia è stato registrato utilizzando una presa intelligente per il monitoraggio dell'energia disponibile in commercio per 2 ore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Tabella 1: Ricette dei terreni e soluzioni madre necessarie per coltivare S. acidocaldarius. Tutti i terreni e le soluzioni madre devono essere prodotti con H2O a doppia distillazione (ddH2O) e quindi sterilizzati in autoclave o sterilizzati con filtro attraverso un filtro da 0,22 μm, come indicato. Fare riferimento alla sezione 1 del protocollo per una descrizione dettagliata di come preparare tutti i terreni e le soluzioni stock. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Risultati rappresentativi per il sequenziamento dell'intero genoma delle linee discendenti . Mutazioni riscontrate in linee discendenti discendenti da S. acidocaldarius DSM639 da trattamento costante a 75 °C. Le mutazioni indicano cambiamenti relativi all'antenato diretto del lignaggio, che possiede diversi cambiamenti rispetto alla sequenza di riferimento per S. acidocaldarius DSM639 (RefSeq NC_007181; le mutazioni nell'antenato sono mostrate nella Tabella supplementare 1). n indica il numero di lignaggi in cui è stata trovata una mutazione. → gene sul 'frame di lettura in avanti'; ← gene sul "frame di lettura inversa". †Questi cambiamenti sono relativi a un frameshift (A)10→11 presente nell'isolato di S. acidocaldarius DSM639 (Tabella supplementare 1). Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 1: Mutazioni presenti nell'isolato di S. acidocaldarius DSM639 rispetto alla sequenza di riferimento (adesione RefSeq NC_007181.1). → gene sul "frame di lettura in avanti"; ← gene sul "frame di lettura inversa". ‡SACI_RS04020 è annotato come pseudogene in NC_007181.1, ma la mutazione frameshift Δ1 bp osservata qui ripristina putativamente la sua funzione poiché con la mutazione, codifica una proteina con identità del 100% al gene della girasi inversa rgy (adesione RefSeq WP_176586667.1). Clicca qui per scaricare questo file.

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.