Descriviamo un metodo per studiare come il pH risponde ai segnali ambientali nei glicosomi della forma del flusso sanguigno dei tripanosomi africani. Questo approccio prevede l'utilizzo di un sensore di proteine ereditarie sensibile al pH in combinazione con la citometria a flusso per misurare la dinamica del pH, sia come saggio del corso temporale che in un formato di schermo ad alto rendimento.
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Articolo metodologico
Misurazione delle variazioni dinamiche del pH glisomiale nel Trypanosoma brucei vivente
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il metabolismo del glucosio è fondamentale per il tripanosoma africano, Trypanosoma brucei, come processo metabolico essenziale e regolatore dello sviluppo del parassita. Poco si sa sulle risposte cellulari generate quando i livelli di glucosio ambientale cambiano. Sia nei parassiti del flusso sanguigno che in forma prociclica (stadio di insetto), i glicosomi ospitano la maggior parte della glicolisi. Questi organelli vengono rapidamente acidificati in risposta alla privazione di glucosio, che probabilmente si traduce nella regolazione allosterica degli enzimi glicolitici come l'esochinasi. Nel lavoro precedente, localizzare la sonda chimica utilizzata per effettuare misurazioni di pH era difficile, limitandone l'utilità in altre applicazioni.
Questo articolo descrive lo sviluppo e l'uso di parassiti che esprimono pHluorin2 glicosomialmente localizzato, un biosensore di pH proteico ereditabile. pHluorin2 è una variante raziometrica della pHluorin che mostra una diminuzione dell'eccitazione dipendente dal pH (acido) a 395 nm e contemporaneamente produce un aumento dell'eccitazione a 475 nm. I parassiti transgenici sono stati generati clonando il frame di lettura aperto di pHluorin2 nel vettore di espressione del tripanosoma pLEW100v5, consentendo l'espressione di proteine inducibili in entrambe le fasi del ciclo di vita. L'immunofluorescenza è stata utilizzata per confermare la localizzazione glicosale del biosensore pHluorin2, confrontando la localizzazione del biosensore con la proteina aldolasi glicosale residente. La risposta del sensore è stata calibrata a diversi livelli di pH incubando le cellule in una serie di tamponi che variavano in pH da 4 a 8, un approccio che abbiamo precedentemente utilizzato per calibrare un sensore di pH a base di fluoresceina. Abbiamo quindi misurato la fluorescenza di pHluorin2 a 405 nm e 488 nm utilizzando la citometria a flusso per determinare il pH glicosomiale. Abbiamo validato le prestazioni dei parassiti transgenici vivi che esprimono pHluorin2, monitorando il pH nel tempo in risposta alla deprivazione di glucosio, un noto fattore scatenante dell'acidificazione glicosale nei parassiti PF. Questo strumento ha una serie di potenziali applicazioni, tra cui il potenziale utilizzo nello screening dei farmaci ad alto rendimento. Oltre al pH glicosomiale, il sensore potrebbe essere adattato ad altri organelli o utilizzato in altri tripanosomatidi per comprendere la dinamica del pH nel contesto delle cellule vive.
Introduzione
I cinetoplastidi parassiti, come la maggior parte degli organismi viventi, si basano sul glucosio come componente fondamentale del metabolismo centrale del carbonio. Questo gruppo comprende organismi importanti dal punto di vista medico, come il tripanosoma africano, Trypanosoma brucei; il tripanosoma americano, T. cruzi; e parassiti del genere Leishmania. Il metabolismo del glucosio è fondamentale per la crescita del parassita nelle fasi del ciclo di vita dei patogeni. Ad esempio, quando viene privato del glucosio, la forma del flusso sanguigno (BSF) del tripanosoma africano muore rapidamente. In particolare, la glicolisi funge da unica fon....
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Protocollo
L'utilizzo di t. brucei brucei 90-13 BSF tripanosomi, una linea di parassiti monomorfi, richiede considerazioni di sicurezza in quanto sono considerati organismi del gruppo di rischio 2 che dovrebbero essere maneggiati in strutture di livello di biosicurezza 2.
1. Coltura e trasfezione del tripanosoma
- Coltura di T. brucei brucei 90-13 tripanosomi BSF in terreno HMI-9 integrati con il 10% di FBS inattivato al calore e il 10% di Nu-Serum a 37 °C in 5% di CO210.
NOTA: Per mantenere la coltura sana, mantenere la densità cellulare tra 2 × 104 e 5 × 10
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Risultati
Localizzazione di pHLuorin2-PTS1 nei glicosomi in BSF T. brucei
Per valutare la localizzazione subcellulare della pHluorin2-PTS1, i parassiti sono stati sottoposti a saggi di immunofluorescenza. Segnale dal transgene colocalizzato con anti-sieri sollevato contro una proteina residente nel glicosoma, l'aldolasi (TbAldolasi) (Figura 2A). Il coefficiente medio di correlazione di Pearson di colocalizzazione tra anti-TbAldolasi e pHluorin2-PTS1 era 0,895, indicando ch.......
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Discussione
La percezione ambientale e i meccanismi di risposta nel tripanosoma africano sono poco compresi. È noto che i cambiamenti nella disponibilità di nutrienti innescano diverse risposte nel parassita, inclusa l'acidificazione dei glicosomi. Qui, abbiamo descritto un metodo per studiare la risposta del pH glicosomiale alle perturbazioni ambientali nelle cellule viventi utilizzando un sensore di proteine ereditabili, pHluorin2 e citometria a flusso.
Ci sono diversi passaggi critici nell'uso del sens.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
pHluorin2-PTS1 è stato clonato in pLEW100v5 da Twist Bioscience che ha fornito il costrutto in un vettore di clonazione ad alta copia; pLEW100v5 è stato un regalo del Dr. George Cross. L'antisiero contro l'aldolasi di T. brucei è disponibile presso la Dott.ssa Meredith T. Morris, Clemson University, su richiesta. Il lavoro dei laboratori JCM e KAC è stato parzialmente supportato da un premio del National Institutes of Health (R01AI156382). SSP è stato supportato da NIH 3R01AI156382.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Palloni per colture tissutali da 50 mL (non trattati, sterili) | VWR | 10861-572 | |
| 75 cm2 Palloni per colture tissutali (non trattati, sterili) | Corning | 431464U | |
| 80 &; L piastra a fondo piatto a 384 pozzetti | BrandTech | 781620 | |
| Nucleofemore di cellule T umane Amaxa Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| Citometro a flusso Attune NxT | invitrogen di Thermo Fisher Scientific | A24858 | Software FlowJo |
| BRANDplates 96-Well, piastra a fondo piatto | Millipore Sigma | BR781662 | |
| Coloc 2 plugin di ImageJ | https://imagej.net/plugins/coloc-2 | ||
| CytKick Max Auto Sampler | invitrogen di Thermo Fisher Scientific | A42973 | |
| Citometro a flusso CytoFLEX | Beckman-Coulter | ||
| Microscopia elettronica Scienze 16% paraformaldeide Soluzione acquosa, grado EM, fiala da 10 ml | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| GraphPad Software | statistico | ||
| Nigericina (sale di sodio) | Cayman Chemical | 11437 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | Prodotto fuori produzione | |
| OP2 Liquid Handler | opentrons | OP2 | |
| poli-L-lisina, 0,1% (p/v) in H2O | Sigma Life Science | CAS:25988-63-0 | Robot di pipettaggio per il test HTS |
| Thiazole Red (TO-PRO-3) | biotium | #40087 | Abbiamo lavorato un supporto per piastre in acrilico personalizzato in modo che questa marca di piastre potesse essere rilevata e utilizzata sul nostro CytKick Max Auto Campionatore |
| valinomicina | Cayman Chemical | 10009152 | Robot di pipettaggio per test HTS |
| Per la taratura del pH | |||
| Per la taratura del pH |
Riferimenti
- Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development. Molecular Biology International. 2011, 123702(2011).
- Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J.
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Ristampe e permessi
