Questo protocollo introduce gli strumenti disponibili per la modellazione di ligandi a piccole molecole nelle mappe cryoEM di macromolecole.
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Articolo metodologico
Modellazione di ligandi in mappe derivate dalla criomicroscopia elettronica
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Decifrare le interazioni proteina-ligando in un complesso macromolecolare è fondamentale per comprendere il meccanismo molecolare, i processi biologici sottostanti e lo sviluppo di farmaci. Negli ultimi anni, la microscopia elettronica criogenica su campione (cryoEM) è emersa come una potente tecnica per determinare le strutture delle macromolecole e per studiare la modalità di legame del ligando a risoluzione quasi atomica. L'identificazione e la modellazione di molecole non proteiche nelle mappe cryoEM è spesso impegnativa a causa della risoluzione anisotropa attraverso la molecola di interesse e del rumore intrinseco nei dati. In questo articolo, i lettori vengono introdotti a vari software e metodi attualmente utilizzati per l'identificazione dei ligandi, la costruzione di modelli e il perfezionamento delle coordinate atomiche utilizzando macromolecole selezionate. Uno dei modi più semplici per identificare la presenza di un ligando, come illustrato con l'enzima enolasi, è quello di sottrarre le due mappe ottenute con e senza il ligando. È probabile che la densità extra del ligando risalti nella mappa delle differenze anche a una soglia più alta. Ci sono casi, come mostrato nel caso del recettore metabotropico del glutammato mGlu5, in cui tali semplici mappe di differenza non possono essere generate. Il metodo recentemente introdotto per derivare la mappa di omissione Fo-Fc può servire come strumento per convalidare e dimostrare la presenza del ligando. Infine, utilizzando come esempio la ben studiata β-galattosidasi, viene analizzato l'effetto della risoluzione sulla modellazione dei ligandi e delle molecole di solvente nelle mappe cryoEM e viene presentata una prospettiva su come la cryoEM può essere utilizzata nella scoperta di farmaci.
Introduzione
Le cellule svolgono le loro funzioni eseguendo innumerevoli reazioni chimiche simultaneamente e in modo indipendente, ciascuna meticolosamente regolata per garantire la loro sopravvivenza e adattabilità in risposta a stimoli ambientali. Ciò si ottiene mediante il riconoscimento molecolare, che consente alle biomolecole, in particolare alle proteine, di formare complessi transitori o stabili con altre macromolecole e con piccole molecole o ligandi1. Pertanto, le interazioni proteina-ligando sono fondamentali per tutti i processi in biologia, che includono la regolazione dell'espressione e dell'attività proteica, il riconoscimento di substrati e ....
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Protocollo
1. Modellazione del fosfoenolpiruvato (PEP) nell'enolasi da Mycobacterium tuberculosis
- Identificazione della densità del ligando nella mappa cryoEM del complesso PEP-enolasi
- Scarica le semimappe non nitide (emd_30988_additional_1.map e emd_30988_additional_2.map) dell'apo-enolasi dai dati aggiuntivi in EMDB (vedi Tabella dei materiali).
- Apri ChimeraX (vedi Tabella dei Materiali). Apri le semimappe dell'apo-enolasi facendo clic su Apri dalla barra degli strumenti e selezionando i nomi dei file. Digita vop add #1 #2 nella riga di comando per combinar....
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Risultati
Esempio 1
L'enzima enolasi di M. tuberculosis catalizza il penultimo passaggio della glicolisi e converte il 2-fosfoglicerato in fosfoenolpiruvato (PEP), che è un intermedio essenziale per diverse vie metaboliche44,45. I dati CryoEM per i campioni di apo-enolasi e enolasi legata al PEP sono stati raccolti alla stessa dimensione di pixel di 1,07 Å e l'elaborazione delle immagini è stata eseguita con Relion 3.146,47
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Discussione
I miglioramenti nell'hardware e nel software del microscopio hanno portato a un aumento del numero di strutture cryoEM negli ultimi anni. Sebbene la risoluzione più alta raggiunta al momento nella crioEM a singola particella sia 1,2 Å 57,58,59, la maggior parte delle strutture viene determinata intorno alla risoluzione di 3-4 Å. La modellazione di ligandi in mappe a media e bassa risoluzione può essere complicata e spesso piena .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
SJ è un destinatario della borsa di dottorato DAE-TIFR e il finanziamento è riconosciuto. KRV riconosce la sovvenzione DBT B-Life DBT/PR12422/MED/31/287/2014 e il supporto del Dipartimento dell'Energia Atomica, Governo dell'India, nell'ambito dell'identificazione del progetto n. RTI4006.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| CCP4-8.0 | Consorzio di diversi istituti | https://www.ccp4.ac.uk | gratuito per gli utenti accademici e include Coot e l'elenco degli strumenti sviluppati per la cristallografia a raggi X |
| CCP-EM | Consorzio di diversi istituti | https://www.ccpem.ac.uk/download.php | gratuito per gli utenti accademici e include Coot, Relion e molti altri |
| Coot | Paul Emsley, LMB, Cambridge | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | Software generale per la costruzione di modelli, ma disponibile anche con altre suite sopra descritte |
| DockinMap (Phenix) | Consorzio di diversi istituti | https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html | Software all'interno della suite Phenix per l'aggancio del modello nelle mappe cryoEM |
| dati di microscopia elettronica... | Consorzio di diversi istituti | https://www.ebi.ac.uk/emdb/ | Repository Pubblico per Mappe di Microscopia Elettronica |
| Falcon | Thermo Fisher Scientific" | https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf | Commercial, fotocamera di Thermo Fisher |
| Phenix | Consorzio di diversi istituti | https://phenix-online.org/download | gratuito per utenti accademici e comprende Coot |
| Protein Data | Bank Consorzio di diversi istituti | https://rcsb.org | Database pubblico di strutture macromolecolari |
| Pymol | Schrodinger | https://pymol.org/2/ | Strumento di viusalizzazione molecolare. La versione educativa è gratuita ma ha delle limitazioni. La versione completa può essere ottenuta con una piccola tassa. |
| Relion | MRC-LMB, Cambridge | Software per l'elaborazione delle immagini cryoEM, disponibile anche con CCP-EM | |
| Titan Krios | Thermo Fisher Scientific. | https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& gad_source=1& gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE | Commerciale, crioTEM da Thermo Fisher |
| UCSF Chimera | UCSF, USA | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html | Software generico per la visualizzazione, l'analisi e altro |
| UCSF Chimera X | UCSF, USA | https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/Software generico per la visualizzazione, l'analisi e altro ancora |
Riferimenti
- Steinbrecher, T., Labahn, A. Towards accurate free energy calculations in ligand protein-binding studies. Curr Med Chem. 17, 767-785 (2010).
- Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z.
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Ristampe e permessi
