Articolo metodologico

Un flusso di lavoro per la valutazione quantitativa dei microbiomi batterici endofitici ed epifiti della corteccia di Populus trichocarpa

DOI:

10.3791/66318

⸱

27 giugno 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, 2College of Life Science, Northeast Forestry University, 3College of Forestry, Northeast Forestry University, 4Forest Biotechnology Group, Department of Forestry and Environmental Resources, North Carolina State University, 5Institute of Economic Forest of Xinjiang Academy of Forestry Sciences

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo presenta un flusso di lavoro affidabile ed efficiente dalla raccolta del campione all'analisi dei dati per la profilazione dei microbiomi batterici endofitici ed epifiti presenti nella corteccia di Populus trichocarpa.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I microrganismi che colonizzano le superfici delle piante e i tessuti interni possono possedere funzioni benefiche nel promuovere la crescita e la salute delle piante. Tuttavia, le informazioni sul microbioma dei tessuti corteccari delle piante legnose rimangono limitate, soprattutto per quanto riguarda il microbiota batterico endofitico ed epifita della corteccia di Populus. Per superare questa limitazione, abbiamo stabilito un flusso di lavoro per quantificare la composizione e la diversità del microbiota batterico endofitico ed epifita che colonizza la corteccia di Populus trichocarpa. In breve, l'epidermide del fusto di P. trichocarpa è stata ripetutamente pulita con un batuffolo di cotone imbevuto di Tween 20 allo 0,1% per acquisire campioni batterici epifiti. L'epidermide spogliata è stata sterilizzata e poi ripetutamente congelata e frantumata utilizzando azoto liquido e un battitore di perline, rispettivamente, per raccogliere campioni batterici endofitici. Il DNA genomico è stato estratto dalle comunità batteriche epifite aderenti al cotone e dalla corteccia frantumata di P. trichocarpa, ed è stato sottoposto ad amplificazione della reazione a catena della ploimerasi (PCR) con primer mirati alle regioni ipervariabili V5-V7 e V4 del gene batterico 16S rRNA. Tre repliche dei prodotti di PCR ottenuti da ciascun campione endofitico o epifita sono state mescolate in concentrazioni uguali per costruire la libreria di ampliconi, che è stata poi sequenziata. Le sequenze ottenute sono state analizzate mediante splicing di sequenza, filtraggio di qualità, rimozione della chimera e annotazioni tassonomiche. In sintesi, abbiamo stabilito un flusso di lavoro affidabile ed efficiente dalla raccolta dei campioni all'analisi dei dati per determinare i microbiomi batterici endofitici ed epifiti della corteccia di P. trichocarpa attraverso la profilazione genica dell'rRNA 16S. Insieme ai metodi per esplorare le cortecce colonizzatrici del microbiota stabiliti nello studio precedente, la nostra metodologia può servire come modello per la progettazione di protocolli per studiare il microbioma della corteccia di altre specie di piante legnose, in particolare gli alberi delle foreste economicamente importanti.

Introduzione

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La corteccia è lo strato più esterno dei fusti delle piante legnose, riferendosi a tutti i tessuti al di fuori del cambio vascolare, compreso il floema e il periderma 1,2. Ricerche approfondite hanno dimostrato che la corteccia svolge un ruolo fondamentale nella traslocazione di acqua e carboidrati, nella protezione degli alberi dal fuoco e dai danni meccanici3 e nell'adattamento agli stress abiotici4e biotici5. Ancora più importante, come interfaccia tra un albero e l'aria circostante, la corteccia funge anche da habitat unico per i microrganismi6. In particolare, è stato confermato che i microbi associati alla corteccia possiedono le funzioni di promuovere la crescita dell'ospite7, assistere gli alberi nell'acquisizione di nutrienti8, migliorare la sintesi ormonale delle piante9 e proteggere gli ospiti dall'infezione da fitopatogeni5. Tuttavia, molta meno attenzione è stata prestata alle comunità microbiche che colonizzano la corteccia rispetto alla fillosfera e al microbiota rizopsifero 10,11. Esistono conoscenze limitate sulle caratteristiche biologiche del microbioma della corteccia degli alberi. L'obiettivo del presente documento metodologico è quello di fornire ai ricercatori una serie di protocolli per descrivere la diversità e la composizione del microbioma batterico endofitico ed epifita della corteccia delle piante legnose.

Sulla base dei metodi pubblicati per studiare il microbiota della corteccia12,13 in questo lavoro, abbiamo progettato e testato un elaborato flusso di lavoro basato sull'analisi del sequenziamento dell'amplicone del gene 16S rRNA per esplorare il microbioma batterico che si deposita nei tessuti interni o sulle superfici della corteccia del fusto di Populus trichocarpa, un importante organismo modello utilizzato nella biologia delle piante legnose14. P. trichocarpa ha le caratteristiche di crescita rapida15, relativa facilità di manipolazione sperimentale16 e facile trasformazione genetica, e anche noto per la sua ampia applicazione nella produzione di legname17. In particolare, il metodo proposto in questo lavoro inizia con una descrizione dettagliata del campionamento del microbiota endofitico ed epifita della corteccia del fusto di P. trichocarpa. Con l'inclusione di una fase per la sterilizzazione superficiale della corteccia con alcol e ipoclorito di sodio dopo la raccolta del microbioma che colonizza la superficie, questo studio ha stabilito una procedura per la raccolta simultanea e separata dei microrganismi che risiedono nella struttura interna della corteccia (endofiti) e di quelli che vivono sulla superficie esterna della corteccia (epifite). Per quanto ne sappiamo, tra gli studi pubblicati sul microbioma della corteccia delle piante legnose, non sono stati eseguiti saggi sulle comunità microbiche endofitiche ed epifite raccolte dallo stesso campione di corteccia sulla base di una chiara distinzione tra le nicchie interne ed esterne della corteccia 18,19,20. Pertanto, il metodo sviluppato in questa ricerca consentirà ai ricercatori di esaminare la diversità e la composizione delle comunità batteriche che abitano la corteccia in modo preciso e completo. Inoltre, questo studio fornisce descrizioni dettagliate delle procedure per l'estrazione del DNA genomico, l'amplificazione della reazione a catena della polimerasi (PCR), la preparazione della libreria di sequenziamento dell'amplicone genico 16S rRNA21 e l'analisi dei dati di sequenziamento. In particolare, questo studio ha impiegato una coppia di primer che hanno come bersaglio le regioni ipervariabili V5-V7 del gene batterico 16S rRNA per ridurre l'amplificazione aspecifica delle sequenze mitocondriali e cloroplasthe delle piante ospiti22, che hanno prodotto profili imparziali del microbioma associato alla corteccia. Le diversità α sono state valutate utilizzando l'indice di Shannon23, un indice di diversità popolare ampiamente utilizzato nella ricerca sull'ecologia, e la composizione tassonomica a livello di phylum è stata calcolata e visualizzata nel software Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) 24e R25. Insieme ai metodi per esplorare le cortecce colonizzatrici del microbiota stabiliti nel precedente studio 1,6, la nostra metodologia può servire come modello per la progettazione di protocolli per lo studio del microbioma della corteccia di altre specie di piante legnose, in particolare gli alberi forestali economicamente importanti.

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Protocollo

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1. Raccolta del campione

  1. Coltiva P di 3 mesi. alberelli di trichocarpa in una camera di crescita (21-25°C; ciclo 16 ore di luce/8 ore di buio con luce supplementare di circa 300 μEm−2 s−1 da una lampada fluorescente lineare a tre bande [T5 28 W 6400 K]; e 60-80% di umidità)26.
  2. Tagliare i segmenti di gambo lunghi 10 cm di P. trichocarpa da 2 a 12 cm sopra la superficie del terreno sterilizzato (Figura 1A) utilizzando un potatore sterilizzato. Mettere i segmenti del gambo in una capsula di Petri quadrata sterilizzata (13 cm x 13 cm).
    NOTA: Per questo studio sono stati selezionati sei alberi della stessa dimensione, di cui tre sono stati utilizzati per l'amplificazione PCR con ciascun set di primer.

2. Elaborazione del campione

  1. Strofinare ripetutamente l'epidermide dello stelo sulla capsula di Petri quadrata sterilizzata utilizzando un batuffolo di cotone sterile imbevuto di Tween 20 allo 0,1% per raccogliere in modo più efficiente i microrganismi che colonizzano le superfici della corteccia (Figura 1B).
    NOTA: I cotoni sterili sub-umidi vengono utilizzati per raccogliere i microrganismi che aderiscono alla superficie dello stelo. Non utilizzare cotone troppo asciutto o troppo bagnato quando si pulisce la superficie dello stelo. Tween 20 è un tensioattivo in grado di ridurre la tensione superficiale, una proprietà vantaggiosa per ottenere più campioni microbici dalle superfici delle piante27,28.
  2. Tagliare la punta di cotone dal tampone utilizzando una lama sterile e posizionare ogni punta di cotone contenente campioni microbici epifiti in una provetta da centrifuga sterile da 1,5 ml. Conservare i campioni a -80 °C.
  3. Dopo aver pulito la superficie dello stelo, tagliare la corteccia da cui sono stati prelevati i microrganismi epifiti utilizzando un bisturi sterile, staccare la corteccia e metterla in una capsula di Petri quadrata.
  4. Tagliare la corteccia strappata dal gambo al punto 2.3 in segmenti di circa 1 cm (Figura 1C) con un bisturi sterile.
  5. Sterilizzare gli spicchi immergendoli in alcol al 70% (v/v) per 2 minuti. Successivamente, immergere gli spicchi in ipoclorito di sodio (2,5% di cloro effettivo) integrato con Tween 80 allo 0,1% per 5 minuti.
  6. Sterilizzare i segmenti ottenuti al punto 2.5 per 30 s in alcool al 70% (v/v)29. Quindi, lavare tutti i campioni tre volte con acqua distillata sterile e posizionarli su un banco pulito per l'asciugatura all'aria.
    NOTA: I campioni di corteccia vengono mescolati avanti e indietro utilizzando una pinzetta sterile per garantire una sufficiente sterilizzazione della superficie.
  7. Conservare ogni segmento di corteccia dello stelo sterilizzato in superficie (campioni endofitici) in una provetta da centrifuga sterile da 2 ml a -80 °C.

3. Estrazione genomica del DNA

  1. Eseguire i seguenti passaggi per pretrattare i campioni per l'estrazione del DNA.
    1. Posizionare i segmenti di corteccia dello stelo sterilizzati in superficie ottenuti al punto 2.7 in provette rigide sterili da 5 mL e aggiungere tre perle di acciaio sterilizzate (4 mm) in ciascuna provetta.
      NOTA: Eseguire questo passaggio su un banco pulito per prevenire la contaminazione microbica. I batuffoli di cotone preparati nella fase 2.2 (campioni epifiti) non devono essere pre-processati e vengono utilizzati direttamente per l'estrazione del DNA genomico.
    2. Congelare le provette dure contenenti i campioni in azoto liquido per 10 minuti.
    3. Frantumare i campioni di corteccia per 5 minuti con un battitore di perline. Quindi, congelare nuovamente il tubo duro in azoto liquido per 1 minuto e ripetere la fase di battitura delle perle per 5 minuti.
  2. Estrarre il DNA genomico.
    NOTA: Utilizzare un kit di estrazione del DNA commerciale per isolare il DNA genomico dai campioni endofitici ed epifiti.
    1. Aggiungere la corteccia del gambo schiacciata di P. Trichocarpa e le comunità batteriche epifite aderenti al cotone (0,25 g ciascuna) a ciascuno dei tubi di perline. Quindi aggiungere 60 μL di soluzione C1 fornita da un kit commerciale e mescolare delicatamente per inversione.
    2. Successivamente, omogeneizzare i campioni endofitici ed epifiti utilizzando un frultore a microsfere in quattro esecuzioni di 1 minuto. Dopo ogni corsa, posizionare i campioni sul ghiaccio per 30 s.
    3. Centrifugare le provette a 10.000 x g per 1 minuto.
    4. Estrarre i campioni endofitici ed epifiti utilizzando un kit (vedi Tabella dei Materiali) seguendo le istruzioni del produttore.
    5. Aggiungere 30 μl di soluzione C6 al centro della membrana filtrante bianca e incubare a 25 °C per 5 minuti.
    6. Centrifugare a 10.000 x g a temperatura ambiente per 1 min.

4. Amplificazione PCR

  1. Standardizzare la concentrazione di DNA estratto.
    1. Misurare le concentrazioni del DNA genomico estratto da campioni epifiti ed endofitici utilizzando uno spettrofotometro a microvolume.
    2. Diluire ogni campione di DNA con ddH sterile da2O a 2 ng/μL per ottenere il modello di DNA per l'amplificazione PCR.
  2. Amplifica questi campioni di DNA.
    1. Amplificare la regione V5-V7 del gene batterico 16S rRNA utilizzando il primer diretto 799F (5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3') e il primer inverso 1193R (5'-ACGTCATCCCCACCTTCC-3') 10. Amplificare la regione V4 del gene batterico 16S rRNA utilizzando il primer diretto 515F (5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') e il primer inverso 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 30.
      NOTA: Il DNA genomico estratto da ciascun campione viene utilizzato come modello per ciascuna delle reazioni di amplificazione PCR triplicate e una reazione aggiuntiva che non contiene DNA viene impostata come controllo negativo. Per ogni campione, il volume della miscela di reazione PCR è di 25 μl. Per la coppia di primer 799F/1193R, ogni reazione contiene 12 μL di acqua PCR, 1 μL di ciascuno dei primer F/R (10 μM), 1 μL di DNA stampo e 10 μL di soluzione di miscela. Per la coppia di primer 515F/806R, ogni reazione contiene 12 μL di acqua PCR, 1 μL di ciascuno dei primer F/R (10 μM), 1 μL di DNA stampo e 10 μL di soluzione di miscela. Le reazioni di PCR con la coppia di primer 799F/1193R vengono eseguite con le seguenti condizioni di ciclo: denaturazione iniziale a 98 °C per 5 min, 25 cicli a 98 °C per 30 s, 53 °C per 30 s e 72 °C per 45 s e un'estensione finale a 72 °C per 5 min. Le reazioni di PCR con la coppia di primer 515F/806R vengono condotte con le seguenti condizioni di ciclo: denaturazione iniziale a 94 °C per 3 min, 35 cicli di 94 °C per 45 s, 50 °C per 60 s e 72 °C per 90 s e un'estensione finale per 10 min a 72 °C.
    2. Miscelare accuratamente ogni campione e centrifugare per eliminare le bolle.
    3. Eseguire l'amplificazione della regione V5-V7 o V4 dei geni batterici 16S rRNA su un termociclatore.
  3. Rileva i prodotti amplificati.
    1. Caricare 5 μL di ciascun amplicone su un gel di agarosio all'1% ed eseguire l'elettroforesi a 120 V per 30 minuti.
    2. Visualizza il gel sotto la luce UV per convalidare il successo dell'amplificazione PCR. Le dimensioni dei prodotti PCR ottenuti con le coppie di primer 799F/1193R e 515F/806R dovrebbero essere rispettivamente di circa 430 bp e 400 bp.

5. Preparazione della libreria di sequenziamento degli ampliconi

  1. Mescolare i prodotti amplificati e determinarne le concentrazioni.
    1. Mescolare i prodotti generati dalle tre repliche dell'amplificazione PCR per ciascun campione in una provetta PCR.
    2. Aggiungere 5 μl di prodotti PCR e 195 μl di soluzione di lavoro in un pozzetto di una micropiastra a 96 pozzetti secondo le istruzioni del produttore per il kit (vedere la tabella dei materiali). Quindi, aggiungere 10 μl di DNA standard (reagenti di DNA con concentrazioni di 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 e 100 ng/μl dal kit) e 190 μl di soluzione di lavoro in un pozzetto della stessa micropiastra. Seguendo questo passaggio, determinare l'intensità di fluorescenza dei prodotti PCR e del DNA standard.
    3. Misura la fluorescenza utilizzando un lettore di micropiastre.
      NOTA: L'eccitazione/emissione delle lunghezze d'onda standard della fluoresceina è impostata a 480/530 nm per misurare la quantità di DNA a doppio filamento in ciascun campione.
    4. Stabilire la curva standard delle concentrazioni di DNA e delle intensità di fluorescenza utilizzando le concentrazioni standard di DNA delle soluzioni standard di DNA (0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 e 100 ng/μL) e l'intensità di fluorescenza di ciascuna soluzione standard di DNA. Sostituire il valore dell'intensità della fluorescenza di ciascuno dei prodotti PCR nella curva standard per calcolare le concentrazioni di DNA dei prodotti PCR.
  2. Crea librerie di sequenziamento degli ampliconi.
    1. In base alle concentrazioni rilevate al punto 5.1.4, miscelare i restanti prodotti PCR amplificati dalla stessa coppia di primer in concentrazioni uguali per costruire la libreria di sequenziamento degli ampliconi.
      NOTA: La frazione dei prodotti PCR di ciascun campione utilizzata per quantificare la concentrazione del DNA a doppio filamento misurando l'intensità della fluorescenza non è inclusa nella libreria di sequenziamento degli ampliconi, che è costituita dai restanti prodotti PCR dello stesso campione.
  3. Eseguire l'estrazione del gel.
    1. Condurre l'elettroforesi su gel di agarosio utilizzando un apparecchio per elettroforesi. Brevemente, preparare un gel di agarosio all'1,3% (cioè 1,3 g di polvere di agarosio in 100 ml di 1 tampone TAE).
      NOTA: Si presta attenzione a garantire che la quantità dei pozzetti nel gel sia sufficiente a contenere ogni prodotto PCR e la scala del DNA; in questo studio, il gel di agarosio all'1,3% viene preparato sciogliendo 1,3 g di polvere di agarosio in 100 ml di 1 tampone TAE.
    2. Rimuovere i pettini dopo la solidificazione del gel e posizionare il gel in una vasca di elettroforesi con 1 tampone TAE. Quindi, aggiungere 1 unità di volume di 6 tamponi di caricamento arancioni a 5 unità di volume di ciascun prodotto PCR, con 100 μl di quest'ultimo caricati in ciascun pozzetto. Aggiungere 30 μl della scala del DNA in un pozzetto. Dopo aver collegato i fili positivo e negativo, eseguire l'elettroforesi a 80 V per 50 min.
      NOTA: In questo studio, l'estrazione del gel viene impiegata per purificare la libreria di sequenziamento degli ampliconi rappresentata dalla banda di 400 bp o 430 bp amplificata con la coppia di primer 515F/806R o 799F/1193R, rispettivamente.
    3. Asportare i frammenti di DNA dal gel di agarosio utilizzando un bisturi pulito e affilato.
    4. Pesare la fetta di gel e trasferirla in un tubo incolore. Aggiungere il tampone per immergere la fetta di gel.
      NOTA: La quantità massima di gel per colonna centrifuga è di 400 mg. Tre unità di volume di tampone vengono aggiunte a un'unità di volume di una data fetta di gel.
    5. Eseguire l'estrazione del gel utilizzando il kit di estrazione del gel (vedere la tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore.
      NOTA: La libreria di ampliconi costruita dai prodotti della PCR che ha come bersaglio il gene batterico 16S rRNA utilizzato per il sequenziamento delle comunità batteriche endofite ed epifite è ottenuta utilizzando questo metodo.
  4. Confermare la qualità della libreria di sequenziamento dell'amplicone purificato.
    1. Determinare la concentrazione di DNA a doppio filamento nella libreria di sequenziamento di ampliconi purificati ottenuta al punto 5.3.5 con un fluorimetro utilizzando un kit commerciale (cfr. tabella dei materiali) seguendo il protocollo del produttore (figura 2).
    2. Determinare la dimensione del frammento di DNA target della libreria di sequenziamento degli ampliconi ottenuta al punto 5.3.5 utilizzando un sistema di analisi del controllo della qualità degli acidi nucleici con chip e kit commerciali (vedere la tabella dei materiali) seguendo il protocollo del produttore.
      NOTA: Assicurarsi che la dimensione del frammento rientri nell'intervallo previsto e che non ci siano dimeri di primer nella libreria di sequenziamento degli ampliconi.
    3. Determinare la concentrazione efficace della libreria di sequenziamento ottenuta al punto 5.3.5 utilizzando la reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale (qRT-PCR) con un kit commerciale (vedere la Tabella dei Materiali) seguendo il protocollo del produttore.
    4. Diluire la libreria di sequenziamento dell'amplicone per soddisfare la concentrazione di carico consigliata per la piattaforma di sequenziamento.

6. Elaborazione di sequenze e analisi statistica

  1. Dopo il sequenziamento, la libreria di ampliconi ottenuta al punto 5.4.4 utilizzando una piattaforma di sequenziamento (vedi Tabella dei materiali)31. Creare una cartella denominata emp-paired-end-sequences nella directory di lavoro, quindi salvare il file di sequenziazione compresso in formato fastq in questa cartella. Quindi apri Ubuntu e attiva l'ambiente conda e Quantitative Insights into Microbial Ecology 2 (QIIME2)(v2021.2)32.
  2. Scrivi un file di mappatura e salvalo come file di testo. Il contenuto del file è mostrato nella Tabella 2.
  3. Suddividere i dati di sequenziamento ottenuti con la libreria di sequenziamento degli ampliconi e rimuovere i primer dai dati di sequenziamento utilizzando il file di mappatura.
    1. Utilizzare il seguente comando per dividere i dati di sequenziamento: time qiime demux emp-paired --m-barcodes-file Mapping_file.txt --m-barcodes-column BarcodeSequence --p-rev-comp-mapping-barcodes --i-seqs emp-paired-end-sequences.qza --o-per-sample-sequences demux.qza --o-error-correction-details demux-details.qza
    2. Utilizzare il seguente comando per rimuovere i primer: time qiime cutadapt trim-paired --i-demultiplexed-sequences paired-demux.qza --p-front-f 799F o 515F --p-front-r 1193R o 806R --o-trimmed-sequences paired-end-demux.qza
  4. Schermare e rimuovere eventuali chimere utilizzando la tubazione DADA233. Raggruppare le sequenze filtrate in varianti di sequenza di ampliconi (ASV) con una somiglianza del 99%.
    1. Utilizzare il seguente comando per selezionare e rimuovere le sequenze chimera e cluster in ASV: time qiime dada2 denoise-paired --i-demultiplexed-seqs paired-end-demux.qza --p-trim-left-f 0 --p-trim-left-r 0 --p-trunc-len-f 220 --p-trunc-len-r 220 --o-table table.qza -o-representative-sequences rep-seqs.qza --o-denoising-stats denoising-stats.qza --p-n-threads 0
  5. Effettuare annotazioni tassonomiche utilizzando il database SILVA (v138) in base alle sequenze di riferimento34.
    1. Utilizzare il seguente comando per annotare gli ASV ottenuti nel passaggio 6.4: time qiime feature-classifier classify-sklearn --i-classifier gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza --i-reads rep-seqs.qza --o-classification taxonomy.qza
  6. Creare una tabella ASV in QIIME2 (v2021.2) utilizzando i seguenti comandi:
    qiime tools export --input-path table.qza --output-path exported-feature-table
    qiime tools export --input-path taxonomy.qza --output-path exported-feature_table
    biom add-metadata -i feature-table.biom -o table.womd.biom --observation-metadata-fp taxonomy.tsv --observation-header OTUID, tassonomia --sc-separated taxonomy
    biom convert -i table.womd.biom -o ASV-table.txt --to-tsv --header-key taxonomy
    NOTA: questi comandi generano una tabella contenente il numero di letture di tutti gli ASV per ciascun campione.
  7. Calcolare il numero di ASV e le letture delle comunità batteriche endofite ed epifite generate con le coppie di primer 799F/1193R e 515F/806R, rispettivamente.
    1. Calcolare il numero totale di ASV con ≥ 1 lette rispettivamente a livello di phylum, classe, ordine, famiglia e genere, in ciascun campione nella tabella ASV ottenuta al punto 6.6 mediante conteggio.
    2. Calcolare il numero totale di letture in ciascun campione in base alla somma del numero di letture di tutti gli ASV nella tabella ASV ottenuta nel passaggio 6.6 mediante conteggio.
    3. Calcolare il numero di letture delle piante in ciascun campione utilizzando il numero di letture di ASV annotate come cloroplasti o mitocondri nella tabella ASV ottenuta al punto 6.6 mediante conteggio.
    4. Calcolare il numero di letture batteriche in ciascun campione utilizzando la seguente formula:
      Numero di letture batteriche = Numero di letture totali − Numero di letture di piante.
    5. Calcola e visualizza il numero medio di ASV (rispettivamente a livello di phylum, classe, ordine, famiglia e genere) o le letture (in totale o di piante e batteri, rispettivamente) delle comunità batteriche endofite ed epifite generate dalle coppie di primer 799F/1193R e 515F/806R utilizzando i software Excel (2019) e Prism (v8.0).
    6. Valutare la significatività delle differenze tra il numero di ASV (a livello di phylum, classe, ordine, famiglia e genere, rispettivamente) o le letture (in totale o di piante e batteri, rispettivamente) generate con le coppie di primer 799F/1193R e 515F/806R utilizzando il t-test di Student nel software Prism (v8.0).
  8. Filtra le letture annotate come cloroplasti e mitocondri utilizzando il seguente comando: time qiime taxa filter-table --i-table table.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --p-exclude mitochondri, chloroplast --o-filtered-table ASV-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza
  9. Crea un albero filogenetico utilizzando il seguente comando: time qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree --i-sequences rep-seqs.qza --o-alignment aligned-rep-seqs.qza --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza --o-tree unrooted-tree.qza --o-rooted-tree rooted-tree.qza
  10. Calcola e visualizza le diversità alfa rappresentate dall'indice di Shannon delle comunità batteriche endofite ed epifite utilizzando il QIIME2 (v2021.2) e il pacchetto 'ggplot2' in R (v4.0.5)35.
    1. Usa il seguente comando per calcolare le diversità alfa: tempo qiime diversità core-metrics-phylogenetic --i-filogenesi rooted-tree.qza --i-table ASV-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --p-sampling-depth il valore letto più basso tra tutti i campioni --m-metadata-file Mapping_file.txt --output-dir core-metrics-result
  11. Calcolare le abbondanze relative delle popolazioni a livello di phylum delle comunità batteriche endofite ed epifite. Genera un file in formato qzv denominato "taxa-bar-plots" utilizzando il seguente comando di QIIME2 (v2021.2): time qiime taxa barplot --i-table ASVs-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --m-metadata-file Mapping_file.txt --o-visualization taxa-bar-plots.qzv
    1. Apri il file taxa-bar-plots.qzv online all'indirizzo https://view.qiime2.org/. Scarica e salva il file appena generato dal livello 2. Calcola l'abbondanza relativa con la seguente formula con R (v4.0.5):
      Abbondanza relativa di ciascun phylum batterico (%) = (numero di letture di ciascun phylum batterico in ciascun campione / numero di letture totali di ciascun campione) x 100 %.
      Visualizzare i dati utilizzando i pacchetti ggplot2, RColorBrewer, reshape e ggalluvial in R (v4.0.5).
  12. Analizzare la significatività della differenza tra l'abbondanza relativa di ciascuno dei phyla dominanti (definiti come un phylum che possiede un'abbondanza relativa di > 0,5%) nelle comunità batteriche endofite ed epifite sequenziate con la coppia di primer 799F/1193R utilizzando l'analisi della varianza a una via (ANOVA) con il test post-hoc di Tukey a un livello di significatività di 0,05 nel software STAMP36.

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Risultati

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DNA genomico di alta qualità dei microbiomi batterici endofitici ed epifiti della corteccia di P. trichocarpa è stato ottenuto utilizzando il protocollo ottimizzato (Tabella 1). L'amplificazione PCR di tutti i 12 campioni ha prodotto singole bande forti con la dimensione corretta (Figura 3). Entrambe le coppie di primer 799F/1193R e 515F/806R hanno amplificato con successo i prodotti target da campioni di tessuto di corteccia endo...

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Discussione

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Sviluppato a partire dalla metodologia pubblicata per l'esame del microbiota della corteccia 7,18, il flusso di lavoro da noi proposto fornisce una guida generale per l'identificazione e la caratterizzazione dei microbiomi endofitici ed epifiti della corteccia delle piante legnose. Questo metodo comprende protocolli per la raccolta e l'elaborazione dei campioni, l'estrazione del DNA genomico, l'amplificazione PCR, la preparazione...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo il signor David Anthony Atherton per aver fornito la narrazione video e i membri del laboratorio B.N. per i preziosi consigli. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation of China (numero di sovvenzione 32071741 [a BN]), dai progetti chiave del piano di ricerca e sviluppo nella regione autonoma uigura dello Xinjiang (numero di sovvenzione 2022B02014), dal piano di introduzione "Tianchi Talents" (a BN), dal programma nazionale di ricerca e sviluppo chiave della Cina (numero di sovvenzione 2021YFD2200203 [a GQ]) e dal progetto di innovazione dello State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding (Northeast Forestry University) (numero di sovvenzione 2019A01 [a BN]).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Attrezzatura:
Battitore di perlineDHS Life Science401265
Centrifuga per provette da 1,5 mLThermo Scientific75002440
Centrifuga per provette
Lettore di micropiastreBioTek8040528
Nanodrop DHS Life Science & Fornitore verificato - Technology Co., Ltd.2010/2020 spettrofotometro per microvolumi
Fluorimetro Qubit 3.0 fluorimetro invitrogenQ33216nbsp;
Frigorifero(-80)Panasonic Healthcare Co., Ltd17060107
Termociclatore T100Bio-Rad1861096termociclatore
Tanon EPS-600 TanonA-179047-2313Per elettroforesi
LabChip GX Touch HTPerkinElmer CLS138625Library Rilevamento della distribuzione dei frammenti di DNA, analisi del controllo di qualità degli acidi nucleici
Applied Biosystems QuantStudio 12KApplied Biosystems4485694Libreria di quantificazione
Illumina Novaseq6000Illumina Sequenziamento della libreria
Materiali:
GuantiQualsiasi
10 μ LAxygenTF-300-R-S
punta barriera per aerosol 20μ LAxygenTF-20-R-S
punta barriera per aerosol 200μ LAxygenTF-200-R-S
barriera per aerosol tipr 1000μ LAxygenTF-1000-R-S
provetta da centrifuga 1,5 mlAxygenMCT-150-C
Corning 96 pozzetti Nero/Trasparente Fondo piatto MicropiastraCorning3631
bastoncino di cotoneZHENDE MEDICAL76606
DNeasy PowerSoil KitQIAGEN 12888-100Per l'estrazione del DNA
provetta da centrifuga senza enzimi 1,5 mlUSA SCIENTIFIC1415-2600
etanoloTianjin Yongda Chemical Reagent Company Limited64-17-5
provette dure (5 ml)DHS Life Science0401261-17
Hot Master Mix Quanta Bio2200400
provetta per microcentrifuga 2,0 mlAxygenMCT-200-C-S
PCR WaterQIAGEN 17000-10
QIAquickQIAGEN28704Per
Kit di saggi Quant-iT dsDNA,InvitrogenQ33130Per la determinazione della concentrazione dei prodotti amplificati e delle librerie di ampliconi purificati
Capsula di Petri quadrataChangde Bkman Biotechnology Co., Ltd110301014
perline d'acciaioShangyu Yixin Ball Industry Co., Ltd.
soluzione di ipoclorito di sodioTianjin Beilian Fine Chemicals Development Co., Ltd 7681-52-9
Tween 20Nachuan Biotechnology Studio9005-64-5
Kit di reagenti DNA ad alto senso a doppio protocolloPerkinElmerCLS760672Rilevamento della libreria di DNA
Kit di quantificazione della libreria VAHTS per IlluminaVazyme Biotech Co., LtdLibreria di quantificazioneNQ104
PCR& punta barriera per aerosol NA Kit di estrazione del gel l'estrazione di gel ad ampia gamma YXB36985

Riferimenti

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