Articolo metodologico

Monitoraggio delle oscillazioni circadiane con un reporter di bioluminescenza negli organoidi

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DOI:

10.3791/66381

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16 febbraio 2024

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Systems Physiology, University of Cincinnati College of Medicine

In questo articolo

Sommario

I ritmi circadiani, che esistono nella maggior parte degli organismi, regolano l'organizzazione temporale dei processi biologici. Gli organoidi 3D sono recentemente emersi come modello in vitro fisiologicamente rilevante. Questo protocollo descrive l'uso di reporter bioluminescenti per osservare i ritmi circadiani negli organoidi, consentendo indagini in vitro dei ritmi circadiani nei sistemi multicellulari.

Abstract

La maggior parte degli organismi viventi possiede ritmi circadiani, che sono processi biologici che si verificano entro un periodo di circa 24 ore e regolano un repertorio diversificato di processi cellulari e fisiologici che vanno dai cicli sonno-veglia al metabolismo. Questo meccanismo dell'orologio trascina l'organismo in base ai cambiamenti ambientali e coordina la regolazione temporale degli eventi molecolari e fisiologici. In precedenza, è stato dimostrato che i ritmi circadiani autonomi vengono mantenuti anche a livello di singola cellula utilizzando linee cellulari come i fibroblasti NIH3T3, che sono stati determinanti per scoprire i meccanismi dei ritmi circadiani. Tuttavia, queste linee cellulari sono colture omogenee prive di multicellularità e di robuste comunicazioni intercellulari. Nell'ultimo decennio, è stato svolto un ampio lavoro sullo sviluppo, la caratterizzazione e l'applicazione di organoidi 3D, che sono sistemi multicellulari in vitro che assomigliano a strutture e funzioni morfologiche in vivo . Questo articolo descrive un protocollo per rilevare i ritmi circadiani utilizzando un reporter bioluminescente negli enteroidi intestinali umani, che consente lo studio dei ritmi circadiani nei sistemi multicellulari in vitro.

Introduzione

Orologio circadiano
Tutti gli organismi, dai batteri ai mammiferi, hanno una relazione complessa e dinamica con il loro ambiente. All'interno di questa relazione, l'adattamento ai cambiamenti ambientali è fondamentale per la sopravvivenza degli organismi. La maggior parte degli organismi possiede ritmi circadiani che consentono loro di adattarsi e ottimizzare le proprie funzioni a cicli diurni di circa 24 ore. L'orologio circadiano è una rete gerarchica di orologi centrali e periferici che lavorano in cooperazione per mantenere l'omeostasi fisiologica e mantenere gli organismi sincronizzati con i cambiamenti giornalieri 1,2. Nei mammiferi, l'orologio centrale o master situato nel nucleo soprachiasmatico (SCN) riceve segnali esterni, come la luce, e trasmette le informazioni agli orologi periferici attraverso un'interazione avanzata di vie di segnalazione neurali e umorali3. Oltre all'orologio centrale, i tessuti periferici possiedono un proprio meccanismo di orologio circadiano autonomo dalle cellule, mantenuto da un ciclo di feedback negativo trascrizionale-traduzionale (TTFL) che regola i geni controllati dall'orologio tessuto-specifici (CCGs)4,5. Questo macchinario molecolare produce una ritmicità di circa 24 ore in eventi cellulari e fisiologici, come espressioni geniche, vie di segnalazione, risposte immunitarie e digestione. L'orologio circadiano è presente in quasi tutte le cellule di mammifero ed è stato dimostrato che fino al 50% dei modelli di espressione dei geni mostra una ritmicità circadiana6. Considerando l'abbondanza di CCG, l'interruzione di questo meccanismo di clock può causare problemi fisiologici critici. Pertanto, le indagini sui ritmi circadiani sono necessarie per chiarire i meccanismi biologici essenziali e sviluppare nuove strategie terapeutiche.

Sistema reporter luciferasi
Negli studi circadiani, il monitoraggio in tempo reale è fondamentale per una migliore comprensione dei comportamenti e delle risposte cellulari perché consente di tracciare i cambiamenti temporali nell'espressione genica e/o nei livelli proteici, fornendo informazioni sui meccanismi molecolari regolati dall'orologio circadiano. Inoltre, il monitoraggio in tempo reale consente ai ricercatori di studiare gli effetti dei cambiamenti ambientali sui meccanismi molecolari 7,8. Esistono numerose tecniche per gli studi di monitoraggio in tempo reale, tra cui il saggio di bioluminescenza, ampiamente utilizzato per monitorare l'espressione genica o i livelli di proteine nel tempo. Il saggio di bioluminescenza è un metodo per rilevare i processi biologici utilizzando la produzione di luce come lettura. In questo saggio, un enzima ossidativo che produce bioluminescenza (ad esempio, luciferasi) viene trasfettato transitoriamente o stabilmente nelle cellule di interesse e la lettura della bioluminescenza viene misurata in presenza di un substrato (ad esempio, luciferina) nel tempo. Ad esempio, l'enzima luciferasi produce bioluminescenza ossidando il substrato luciferina in presenza di ATP9. Grazie alla sua breve emivita, 3-4 oree 10 ore, la luciferasi delle lucciole è uno strumento potente per gli studi circadiani in termini di monitoraggio dinamico in tempo reale con rumore di fondo minimo 11,12,13. Per l'inserimento di DNA con un promotore marcato con luciferasi o un telaio di lettura aperto (ORF), il sistema di consegna genica lentivirale è un metodo affidabile che fornisce un'elevata efficacia di trasduzione, un'integrazione stabile e una bassa immunogenicità. La trasduzione stabile di un reporter bioluminescente fornisce un'espressione robusta nelle cellule in divisione e non in divisione, generando dati coerenti per gli studi circadiani14.

Organoide come modello
Le tradizionali linee cellulari bidimensionali immortalizzate sono state determinanti in studi biologici che vanno dalla scoperta dei meccanismi molecolari fondamentali dei ritmi circadiani allo screening dei farmaci. Nonostante la convenienza dell'utilizzo di linee cellulari omogeneizzate, mancano di strutture multicellulari e interazioni intercellulari. Al contrario, gli organoidi sono strutture multicellulari "organiche" 3D in vitro che imitano la struttura degli organi in un piatto mostrando somiglianza con l'architettura dei tessuti in vivo e la multicellularità, inclusi i tipi di cellule staminali, progenitrici e differenziate15,16. Il possesso di caratteristiche di auto-organizzazione, multicellularità e funzionalità rende gli organoidi un notevole modello in vitro che rappresenta i processi cellulari e fisiologici che avvengono nei tessuti reali17. Diversi tipi di organoidi possono essere derivati da cellule staminali pluripotenti tramite differenziazione diretta o cellule staminali adulte raccolte da vari organi, tra cui l'intestino tenue, il cervello, il fegato, il polmone e il rene18,19. Poiché le strutture degli organoidi possiedono un'architettura e una funzione simile a quella dei tessuti con la multicellularità e l'interazione dinamica cellula-cellula, sono superiori alle linee cellulari omogeneizzate per comprendere gli eventi cellulari che si verificano nei tessuti in vivo. Gli organoidi sono anche facilmente manipolabili e possono essere coltivati in condizioni controllate, il che li rende utili per gli studi circadiani20.

Lo scopo principale di questo lavoro è quello di introdurre un metodo di monitoraggio in tempo reale utilizzando un saggio di bioluminescenza specificamente studiato per lo studio dei ritmi circadiani in organoidi 3D multicellulari. Il monitoraggio in tempo reale degli eventi cellulari utilizzando una tecnica di saggio di bioluminescenza è stato ampiamente eseguito per colture cellulari prive della complessità multicellulare e delle comunicazioni intercellulari esistenti nei tessuti reali. Gli organoidi 3D offrono opportunità uniche per studiare le funzioni dei ritmi circadiani nei sistemi multicellulari in vitro. Ad esempio, si potrebbero studiare i ritmi circadiani negli organoidi con composizioni cellulari alterate o organoidi derivati da tessuti malati dei pazienti. Questo protocollo consente l'utilizzo di un saggio di bioluminescenza per studiare diversi aspetti dei ritmi circadiani in un modello in vitro fisiologicamente più rilevante, gli organoidi, che ci aiuterà a comprendere meglio i ruoli dei ritmi circadiani negli organi periferici.

Protocollo

Tutti gli esperimenti che utilizzano tessuti umani per la generazione di HIE sono stati approvati da un IRB presso il CCHMC (IRB#2014-0427). Consulta la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali utilizzati in questo protocollo.

NOTA: Per illustrare la procedura descritta in questo protocollo, abbiamo utilizzato enteroidi intestinali umani (HIE) Bmal1-luc . Questi enteroidi sono stati sottoposti a trasduzione lentivirale stabile22 con il plasmide reporter pABpuro-BluF, che contiene il promotore Bmal1 fuso con la luciferasi, mostrando l'attività del promotore Bmal1 21.

1. Trasduzione lentivirale

  1. Effettuare la trasduzione lentivirale22 in condizioni arricchite con cellule staminali per HIE. In particolare, garantire la formazione di sferoidi negli HIE entro 3-4 giorni dal passaggio nei mezzi di crescita intestinale, che crea condizioni arricchite di cellule staminali.
  2. Dopo la trasduzione lentivirale22, effettuare la selezione antibiotica con 2 μg/mL di puromicina, recuperare gli HIE resistenti alla puromicina e farli passare con una densità relativamente alta (cioè 1 pozzetto in 2 pozzetti) per 2-3x. Se il tasso di crescita degli HIE è lento, aggiungere 10 μM di inibitori ROCK (Y-27632) e 10 μM di inibitore GSK-3 (CHIR-99021) al terreno di crescita dell'organoide intestinale.

2. Preparazione di organoidi per saggi di bioluminescenza

  1. Giorno 1: Passaggio HIE a piatti rotondi da 35 mm.
    1. In breve, per l'espansione degli HIE, mescolare gli HIE con la matrice di coltura 3D a fattore di crescita ridotto (GFR) e seminarli su piastre a 24 pozzetti con tre goccioline da 10 μL di matrice di coltura 3D per pozzetto. Aggiungere 350 μl di terreno di coltura HIE e sostituirlo a giorni alterni.
      NOTA: La densità di HIE nella matrice di coltura 3D è fondamentale per la crescita degli enteroidi. Approssimativamente, il numero di sferoidi dovrebbe superare più di 50 in ogni gocciolina. Se il numero è basso, il tasso di crescita dell'HIE è influenzato negativamente.
    2. Quando gli HIE crescono a sufficienza (circa 7 giorni dopo il post-passaggio), raccoglierli da quattro pozzetti in provette per microcentrifuga da 1,5 mL.
    3. Lavare gli HIE con il PBS freddo utilizzando una mini centrifuga da banco (2.000 × g) per una centrifuga rapida di 40 secondi per rimuovere i detriti e l'eccessiva matrice di coltura 3D mediante pipetta.
    4. Aggiungere 0,5 ml di PBS freddo nel pellet e applicare la turbolenza fisica siringando fino a 10 volte con una siringa da insulina da 1 ml per dissociare gli HIE.
    5. Centrifugare gli HIE dissociati con una mini centrifuga da banco come al punto 2.1.3 e rimuovere delicatamente il surnatante con una pipetta. Quindi, posizionare la provetta da microcentrifuga con il pellet HIE sul ghiaccio per farla raffreddare per circa 3 minuti.
    6. Aggiungere la matrice di coltura GFR 3D alla provetta della microcentrifuga e mescolarla con il pellet HIE.
      NOTA: Calcola la quantità della matrice di coltura 3D in base al numero di piatti rotondi da 35 mm che verranno utilizzati per l'esperimento. Generalmente seminiamo 30 μl di goccioline di matrice di coltura 3D per piatto rotondo.
    7. Seminare la miscela di HIE e la matrice di coltura 3D al centro della piastra rotonda da 35 mm e incubare la piastra a 37 °C per 20 minuti per solidificare la matrice di coltura 3D.
      NOTA: La densità degli HIE di semina deve essere determinata sperimentalmente. Sulla base dell'intensità della bioluminescenza, è possibile determinare il numero di HIE durante questo processo.
    8. Aggiungere 2 mL di terreno di crescita organoide intestinale preriscaldato a ciascuna piastra e incubare le piastre in un incubatore di CO2 fino alla fase successiva.
  2. Giorno 3: Inizio della differenziazione
    1. Per avviare la differenziazione degli HIE, rimuovere il terreno di coltura e aggiungere 2 mL di terreno di differenziazione preriscaldato.
      NOTA: Vedere la Tabella 1 per le ricette dei mezzi di differenziazione HIE23.
  3. Giorno 4: Non è richiesto alcun processo aggiuntivo.
  4. Giorno 5: Sostituire il terreno degli enteroidi con 2 mL di terreno di differenziazione preriscaldato.
  5. Giorno 6: Sincronizzazione dell'orologio e registrazione della bioluminescenza
    1. Per sincronizzare l'orologio molecolare degli enteroidi, aggiungere 2 μL di 100 μM di desametasone (Dex) per ottenere la concentrazione finale di 100 nM in ciascuna piastra e quindi incubare le piastre in un incubatore di CO2 (37 °C, 5% CO2) per 1 orae 24.
    2. Durante il ripristino Dex, preparare il luminometro in incubazione. Controllare la CO2 e la temperatura del luminometro in incubazione e impostarla rispettivamente al 5% e a 37 °C.
      NOTA: Si consiglia di pulire l'interno del luminometro in incubazione con alcol al 70% prima e dopo ogni utilizzo della macchina per mantenerla sterile.
    3. Dopo la sincronizzazione dell'orologio, ricaricare gli enteroidi con 3 mL di terreno di differenziazione preriscaldato contenente 200 μM di D-luciferina.
      NOTA: Poiché la luciferina è sensibile alla luce, il terreno contenente luciferina deve essere avvolto con un foglio e preriscaldato in un bagno di calore a 37 °C prima di applicarlo sul piatto.
    4. Posizionare le piastre in un tavolo a 8 pozzetti del luminometro in incubazione e coprire il tavolo della piastra campione con il coperchio. Posizionare due camere di umidificazione con fazzoletto umido o spugna sulla parte superiore del tavolo del piatto del campione. Si tratta di un processo una tantum.
      NOTA: Dopo l'inizio dell'esperimento, il coperchio del luminometro in incubazione deve essere tenuto chiuso fino al termine dell'esperimento. Assicurati di bagnare a sufficienza i fazzoletti/spugne.
    5. Chiudere il coperchio della macchina e avviare il programma per misurare la bioluminescenza per il numero di giorni e la risoluzione desiderati.
      1. Sul software, selezionare le impostazioni delle condizioni facendo clic sulla scheda Condizione e regolare le impostazioni su questo pannello: numero di piatti, tempo di misurazione, elaborazione in background e tipo di filtro.
        NOTA: Per questa dimostrazione, abbiamo selezionato tutte le parabole da A a H; tempo di misurazione predefinito, che è determinato dal software in base al numero di parabole; tempo di attesa per l'elaborazione in background e tipo di filtro F0. Poiché ci sono tre opzioni di filtro, tre colori luminescenti possono essere misurati contemporaneamente.
      2. Dopo aver immesso tutte le impostazioni appropriate in base all'esperimento, salvare le impostazioni facendo clic su OK.
      3. Per avviare l'esecuzione dell'esperimento, fare clic sulla scheda Esegui | Pulsante di avvio (icona a forma di triangolo verde). Osserva i dati come grezzi, filtrati dal rumore o detrendati effettuando le selezioni appropriate nella parte superiore dello schermo del software durante l'esecuzione degli esperimenti. Fare clic sulle schede Raw, Noise Filtered o Detrended per osservare i dati selezionati.
      4. Osservare i segnali per un massimo di 5 giorni.
        NOTA: Dopo 5 giorni di monitoraggio in un luminometro in incubazione, gli enteroidi possono iniziare a morire a causa dell'esaurimento del terreno. Per prevenire ogni possibile interruzione circadiana durante l'esperimento, non eseguiamo il cambio dei media per tutta la durata dell'esperimento.
      5. Al termine dell'esperimento, interrompi l'esecuzione facendo clic sul pulsante Interrompi (icona quadrata blu), vai alla scheda File e fai clic su Salva con nome. Salvare i dati in formato Kronos; esportare i dati in un foglio di calcolo nella sezione File facendo clic sull'opzione File e quindi selezionando Esporta in formato Excel sotto File per ulteriori analisi.

Risultati

La registrazione della bioluminescenza è stata condotta per valutare la ritmicità circadiana degli enteroidi intestinali umani (HIE) in due condizioni distinte: condizioni arricchite con cellule staminali utilizzando il terreno di crescita degli organoidi intestinali (Figura 3) rispetto alle condizioni che inducono la differenziazione, che è stata ottenuta sostituendo il mezzo di crescita degli organoidi intestinali con un mezzo di differenziazione. Il giorno dell'esperimento, abbiamo sincronizzato gli orologi circadiani eseguendo un trattamento di 1 ora con 100 nM di desametasone. Successivamente, abbiamo sostituito il terreno con 3 mL di terreno di crescita di organoidi intestinali o di terreno di differenziazione integrato con 200 μM di D-luciferina e abbiamo avviato il monitoraggio dell'attività di bioluminescenza. Dopo un periodo di registrazione di 4-5 giorni, abbiamo condotto un'analisi Fast Fourier Transform (FFT) per determinare il periodo dei ritmi circadiani osservati. La Figura 3 mostra la dinamica temporale dell'attività del promotore di Bmal1 nelle condizioni sopra menzionate. In condizioni differenzianti, la bioluminescenza di Bmal1-luc ha mostrato robuste oscillazioni circadiane con una periodicità media di 22,92 ore. Al contrario, gli HIE hanno dimostrato ritmi circadiani interrotti in condizioni arricchite con cellule staminali (Figura 3). Questi dati mostrano che gli HIE in condizioni arricchite con cellule staminali non mostrano robuste oscillazioni circadiane. In altre parole, sarebbe necessario valutare l'impatto delle condizioni di crescita rispetto ai ritmi circadiani prima di studiare le funzioni circadiane dipendenti dall'orologio negli organoidi.

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Figura 1: Disegno schematico del protocollo. Gli HIE vengono fatti passare in piastre da 35 mm il giorno 1 e coltivati con 2 mL di terreno di crescita fino al giorno 3. Il terzo giorno dopo il passaggio, il terreno viene sostituito con 2 mL di terreno di differenziazione preriscaldato per avviare la differenziazione degli enteroidi. Il cambio del terreno viene ripetuto con 2 ml di terreno preriscaldato il giorno 5 per prevenire l'esaurimento della nutrizione. Il giorno 6, gli enteroidi vengono trattati con 100 nM di desametasone per 1 ora per la sincronizzazione dell'orologio circadiano. Dopo un'ora, il terreno viene sostituito con 3 mL di terreno contenente D-luciferina da 200 μM e le piastre vengono installate nel luminometro in incubazione. Dopo aver registrato l'espressione di bioluminescenza per 4-5 giorni, l'esperimento viene terminato e i dati generati vengono esportati come fogli di calcolo per ulteriori analisi. Abbreviazione: HIE = enteroide intestinale umano. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Un'immagine rappresentativa degli HIE in terreno di coltura. L'immagine è stata scattata da un microscopio a campo largo con un obiettivo 25x. Barra della scala = 1 mm. Abbreviazione: HIE = enteroide intestinale umano. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Registrazioni di bioluminescenza da HIE da condizioni di differenziazione e arricchite con cellule staminali. (A) Dati di registrazione della bioluminescenza grezza e (B) detrended di HIE Bmal1-luc in condizioni arricchite con cellule staminali (rosso) e di differenziazione (nero). (C) Periodo delle oscillazioni di Bmal1-luc negli HIE in condizioni di differenziazione. Il periodo è calcolato con l'analisi FFT; n = 3 per gli HIE Bmal1-luc in condizioni arricchite con cellule staminali e n = 4 per gli HIE Bmal1-luc in condizione di differenziazione. Le barre di errore indicano SD. Abbreviazioni: HIE = enteroide intestinale umano; FFT = Trasformata di Fourier veloce. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Ricette di media di differenziazione
Nome del reagenteSocietàNumero di catalogoConcentrazione finaleCommenti
DMEM/F12 avanzatoTecnologie per la vita12634-028Aggiungi come ultimo componente. Se si preparano terreni da 50 mL, dopo aver aggiunto tutti gli altri componenti, riempire il resto fino a 50 mL con Advanced DMEM/F12 alla fine.
A 83-01Sigma AldrichSML0788500 nM
Supplemento B-27 (50x)Gibco17504-0441x
Gastrin I UmanoSigma AldrichG902010 nM
GlutaMAXGibco350500611x
HEPESGibco1563008010 mM
Supplemento N-2 (100x)Gibco17502-0481x
N-acetil-L-cisteinaSigma AldrichCodice: A91651 mM
NOGGIN Condizionato Medium5%Realizzato in laboratorio
Penicillina-StreptomicinaGibco15140122100 U/mL
EGF murino ricombinantePeproTech315-0950 ng/mL
R-SPONDIN Fluido condizionato10%Realizzato in laboratorio

Tabella 1: Composizione dei mezzi di differenziazione HIE23.

Discussione

Il saggio di bioluminescenza offre diversi vantaggi per lo studio dei ritmi circadiani, che richiede la raccolta di dati da esperimenti a lungo termine. In primo luogo, consente ai ricercatori di monitorare l'espressione genica o la proteina di interesse mentre le cellule si muovono e proliferano. Senza apportare modifiche inutili o interrompere le funzioni delle cellule, gli eventi cellulari interessati o l'espressione genica possono essere registrati utilizzando la lettura della bioluminescenza, che fornisce dati affidabili in tempo reale. È importante sottolineare che il test di bioluminescenza genera un rumore di fondo minimo rispetto ai test di fluorescenza perché viene eseguito in condizioni di oscurità costante25. Inoltre, il saggio di bioluminescenza è preferibile per il monitoraggio a lungo termine perché l'eccitazione continua per il saggio di fluorescenza per diversi giorni può causare un'elevata fototossicità e fotosbiancamento. Tuttavia, a causa dell'assenza di eccitazione della luce, il saggio di bioluminescenza fornisce un segnale più debole rispetto alle proteine di fluorescenza26. La breve emivita della luciferasi la rende preferibile per gli studi circadiani e può essere ulteriormente accorciata aggiungendo ulteriori sequenze destabilizzanti12.

Nonostante offrano diversi vantaggi per il monitoraggio di cellule vive, i saggi di bioluminescenza presentano alcune limitazioni. Sebbene il saggio di bioluminescenza fornisca una lettura robusta per l'espressione genica temporale o il monitoraggio delle proteine da una popolazione di cellule, la sua risoluzione spaziale è limitata, il che lo rende meno fattibile per gli esperimenti che raccolgono dati di localizzazione delle proteine da singole cellule. Considerando i suoi vantaggi e svantaggi, il saggio di bioluminescenza è superiore ad altri metodi, soprattutto per gli studi circadiani; Offre meno tossicità e un'elevata sensibilità, il che lo rende ideale per il monitoraggio a lungo termine.

Durante la fase di preparazione sperimentale devono essere considerati diversi fattori critici. In primo luogo, l'implementazione di un'adeguata strategia di selezione per la trasduzione lentivirale è fondamentale; nel nostro caso, abbiamo eseguito la selezione di 2 μg/mL di puromicina per 2 settimane. Un'esecuzione inadeguata della selezione può comportare un numero insufficiente di enteroidi che ospitano il plasmide reporter, producendo livelli di espressione della luciferasi incoerenti. Altrettanto importante è la densità di semina ottimale; Una densità eccessiva può indurre una deplezione prematura dei nutrienti durante l'esperimento, poiché non vi è alcuna sostituzione del mezzo dopo l'inizio della registrazione della bioluminescenza. Al contrario, una bassa densità di HIE può comportare una riduzione dell'output di bioluminescenza, influenzando così la robustezza della lettura. Garantire un ambiente adatto per gli enteroidi durante il monitoraggio è fondamentale per l'affidabilità dei risultati sperimentali. Il mantenimento di condizioni ottimali, tra cui i livelli di CO2, temperatura e umidità, è fondamentale per il mantenimento degli HIE, promuovendo la robustezza dei processi cellulari all'interno degli enteroidi. Le deviazioni dalla temperatura ottimale e dai livelli di CO2 possono influenzare il metabolismo cellulare e le vie di segnalazione, influenzando potenzialmente i ritmi circadiani. Livelli di umidità adeguati sono altrettanto importanti, prevenendo l'essiccazione e mantenendo l'integrità strutturale degli enteroidi. Pertanto, un'attenzione meticolosa alle condizioni ambientali è fondamentale per l'accuratezza del modello sperimentale e degli studi circadiani che coinvolgono gli enteroidi.

La sincronizzazione dell'orologio è essenziale per gli studi circadiani in quanto allinea l'orologio circadiano interno delle singole cellule, assicurando che siano in uno stato unificato e coordinato. Questa sincronizzazione è necessaria per l'osservazione e l'analisi precisa della ritmicità circadiana a livello di un'intera cultura. In questo protocollo, abbiamo eseguito la sincronizzazione dell'orologio con 100 nM di desametasone (Dex). Potrebbero esserci alcune preoccupazioni sull'effetto di Dex sulla struttura o sulla funzione cellulare. Ricerche precedenti suggeriscono che i corticosteroidi migliorano la funzione della barriera epiteliale negli enteroidi27. Tuttavia, è importante sottolineare che questo fenotipo si osserva dopo aver trattato gli enteroidi con 10 μM di prednisolone per 12 ore. Ci aspettiamo che un breve trattamento di 1 ora con desametasone non induca cambiamenti significativi rispetto alla struttura e alla funzione delle cellule all'interno degli enteroidi.

Il monitoraggio dell'attività di bioluminescenza della coltura di organoidi invece della coltura omologa di una singola cellula possiede punti di forza unici. In primo luogo, più tipi di cellule interagiscono tra loro in una coltura di organoidi come in un tessuto in vivo , mentre una tipica coltura cellulare 2D monitora l'espressione genica interessata in una sorta di ambiente isolato costituito da un singolo tipo di cellula. La coltura di organoidi fornisce risultati più realistici con interazioni multicellulari e vie di segnalazione. L'interazione cellula-cellula è fondamentale, soprattutto per gli studi sulla differenziazione e sulla via intercellulare, che richiedono una coltura cellulare eterogenea28. I nostri risultati indicano che gli HIE nella condizione differenziata mostrano robuste oscillazioni circadiane ma ritmi circadiani interrotti nella condizione arricchita di cellule staminali. Questi dati suggeriscono un potenziale rimodellamento del meccanismo dell'orologio circadiano da cellule staminali adulte a cellule differenziate. In sintesi, gli organoidi con un reporter bioluminescente circadiano consentono di studiare i ritmi circadiani in un sistema multicellulare in vitro, scoprendo le funzioni dei ritmi circadiani in modo più fisiologicamente rilevante.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Gli enteroidi intestinali umani sono stati ottenuti dal laboratorio del Dr. Michael Helmrath presso il Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC). Questo lavoro è stato supportato da R01 DK11005 (CIH) e dal finanziamento pilota del Cancer Center dell'Università di Cincinnati. Siamo grati per il supporto all'imaging da parte del Live Microscopy Core (NIH S10OD030402) dell'Università di Cincinnati.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
35 x 10 piastre per coltura tissutale FalconFisher Scientific08-772A
83-01Sigma AldrichSML0788
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-028
B-27 Supplement (50x)Gibco17504-044
BD Micro-Fine IV Siringhe per insulinaFisher Scientific14-829-1BbMfrn: BD 329424
CHIR99021Cayman Chemical13122GSK-3 inibitore
desametasoneSigma AldrichD4902-500MG
D-luciferina (sale di potassio)Cayman Chemical14681
gastrina I umanoSigma AldrichG9020
GlutaMAXGibco35050061
fattore di crescita ridotto (GFR) MatrigelCorningCB-40230C
HEPESGibco15630080
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)Stemcell Technologies06010è costituito da IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL e integratore di organoidi, 50 mL. Mescolare entrambi in rapporto 1:1 da utilizzare come mezzo di crescita dell'organoide intestinale
Kronos Dio Luminometro MacchinaATTO CorporationAB-2550
N-2 Integratore (100x)Gibco17502-048
N-Acetil-L-cisteinaSigma AldrichA9165
pABpuro-BluF reporter plasmideAddgene46824
PBS senza calcio e magnesioCorning21-040-CV
Penicillina-StreptomicinaGibco15140122
Murina ricombinante EGFPeproTech315-09
Y-27632R& D Systems1254/10Inibitore ROCK

Riferimenti

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