I ritmi circadiani, che esistono nella maggior parte degli organismi, regolano l'organizzazione temporale dei processi biologici. Gli organoidi 3D sono recentemente emersi come modello in vitro fisiologicamente rilevante. Questo protocollo descrive l'uso di reporter bioluminescenti per osservare i ritmi circadiani negli organoidi, consentendo indagini in vitro dei ritmi circadiani nei sistemi multicellulari.
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Articolo metodologico
Monitoraggio delle oscillazioni circadiane con un reporter di bioluminescenza negli organoidi
In questo articolo
Sommario
Abstract
La maggior parte degli organismi viventi possiede ritmi circadiani, che sono processi biologici che si verificano entro un periodo di circa 24 ore e regolano un repertorio diversificato di processi cellulari e fisiologici che vanno dai cicli sonno-veglia al metabolismo. Questo meccanismo dell'orologio trascina l'organismo in base ai cambiamenti ambientali e coordina la regolazione temporale degli eventi molecolari e fisiologici. In precedenza, è stato dimostrato che i ritmi circadiani autonomi vengono mantenuti anche a livello di singola cellula utilizzando linee cellulari come i fibroblasti NIH3T3, che sono stati determinanti per scoprire i meccanismi dei ritmi circadiani. Tuttavia, queste linee cellulari sono colture omogenee prive di multicellularità e di robuste comunicazioni intercellulari. Nell'ultimo decennio, è stato svolto un ampio lavoro sullo sviluppo, la caratterizzazione e l'applicazione di organoidi 3D, che sono sistemi multicellulari in vitro che assomigliano a strutture e funzioni morfologiche in vivo . Questo articolo descrive un protocollo per rilevare i ritmi circadiani utilizzando un reporter bioluminescente negli enteroidi intestinali umani, che consente lo studio dei ritmi circadiani nei sistemi multicellulari in vitro.
Introduzione
Orologio circadiano
Tutti gli organismi, dai batteri ai mammiferi, hanno una relazione complessa e dinamica con il loro ambiente. All'interno di questa relazione, l'adattamento ai cambiamenti ambientali è fondamentale per la sopravvivenza degli organismi. La maggior parte degli organismi possiede ritmi circadiani che consentono loro di adattarsi e ottimizzare le proprie funzioni a cicli diurni di circa 24 ore. L'orologio circadiano è una rete gerarchica di orologi centrali e periferici che lavorano in cooperazione per mantenere l'omeostasi fisiologica e mantenere gli organismi sincronizzati con i cambiamenti giornalieri
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Protocollo
Tutti gli esperimenti che utilizzano tessuti umani per la generazione di HIE sono stati approvati da un IRB presso il CCHMC (IRB#2014-0427). Consulta la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali utilizzati in questo protocollo.
NOTA: Per illustrare la procedura descritta in questo protocollo, abbiamo utilizzato enteroidi intestinali umani (HIE) Bmal1-luc . Questi enteroidi sono stati sottoposti a trasduzione lentivirale stabile22 con il plasmide reporter pABpuro-BluF, che contiene il promotore Bmal1 fuso con la luciferasi, mostrando l'attività del promotore Bmal1<....
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Risultati
La registrazione della bioluminescenza è stata condotta per valutare la ritmicità circadiana degli enteroidi intestinali umani (HIE) in due condizioni distinte: condizioni arricchite con cellule staminali utilizzando il terreno di crescita degli organoidi intestinali (Figura 3) rispetto alle condizioni che inducono la differenziazione, che è stata ottenuta sostituendo il mezzo di crescita degli organoidi intestinali con un mezzo di differenziazione. Il giorno dell'esperimento, abbiamo sincro.......
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Discussione
Il saggio di bioluminescenza offre diversi vantaggi per lo studio dei ritmi circadiani, che richiede la raccolta di dati da esperimenti a lungo termine. In primo luogo, consente ai ricercatori di monitorare l'espressione genica o la proteina di interesse mentre le cellule si muovono e proliferano. Senza apportare modifiche inutili o interrompere le funzioni delle cellule, gli eventi cellulari interessati o l'espressione genica possono essere registrati utilizzando la lettura della bioluminescenza, che fornisce dati affid.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Gli enteroidi intestinali umani sono stati ottenuti dal laboratorio del Dr. Michael Helmrath presso il Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC). Questo lavoro è stato supportato da R01 DK11005 (CIH) e dal finanziamento pilota del Cancer Center dell'Università di Cincinnati. Siamo grati per il supporto all'imaging da parte del Live Microscopy Core (NIH S10OD030402) dell'Università di Cincinnati.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 35 x 10 piastre per coltura tissutale Falcon | Fisher Scientific | 08-772A | |
| 83-01 | Sigma Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-028 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| BD Micro-Fine IV Siringhe per insulina | Fisher Scientific | 14-829-1Bb | Mfrn: BD 329424 |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | GSK-3 inibitore |
| desametasone | Sigma Aldrich | D4902-500MG | |
| D-luciferina (sale di potassio) | Cayman Chemical | 14681 | |
| gastrina I umano | Sigma Aldrich | G9020 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| fattore di crescita ridotto (GFR) Matrigel | Corning | CB-40230C | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stemcell Technologies | 06010 | è costituito da IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL e integratore di organoidi, 50 mL. Mescolare entrambi in rapporto 1:1 da utilizzare come mezzo di crescita dell'organoide intestinale |
| Kronos Dio Luminometro Macchina | ATTO Corporation | AB-2550 | |
| N-2 Integratore (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| N-Acetil-L-cisteina | Sigma Aldrich | A9165 | |
| pABpuro-BluF reporter plasmide | Addgene | 46824 | |
| PBS senza calcio e magnesio | Corning | 21-040-CV | |
| Penicillina-Streptomicina | Gibco | 15140122 | |
| Murina ricombinante EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Y-27632 | R& D Systems | 1254/10 | Inibitore ROCK |
Riferimenti
- Cox, K. H., Takahashi, J. S. Circadian clock genes and the transcriptional architecture of the clock mechanism. J Mol Endocrinol. 63 (4), R93-R102 (2019).
- Ayyar, V. S., Sukumaran, S. Circadian rhythms: Influence on physiolog....
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Ristampe e permessi
