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Articolo metodologico

Un attrezzo per esercizi di zebrafish indotto dal nuoto per approcci di allenamento versatili

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DOI:

10.3791/66382

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18 ottobre 2024

 ,  ,  , 
1Exercise Genetics and Metabolism Laboratory, Molecular Biology Program, Department of Biophysics, Federal University of São Paulo, 2Exercise Genetics and Metabolism Laboratory, Nephrology Program, Department of Biophysics, University Federal of Sao Paulo

In questo articolo

Sommario

L'attrezzo per esercizi progettato per i pesci meno fortunati facilita l'implementazione di diversi protocolli di esercizio con intensità variabili manipolando la velocità del flusso d'acqua, ottenibile attraverso la reotassi.

Abstract

Per studiare in modo completo gli effetti dell'esercizio fisico sulla salute e sulla malattia, i modelli animali svolgono un ruolo fondamentale. Il pesce zebra, un organismo modello di vertebrato ampiamente utilizzato, offre una piattaforma unica per tali studi. Questo studio ha introdotto lo sviluppo di un apparato economico su misura per gli studi di esercizio del pesce zebra utilizzando materiali prontamente disponibili. Il dispositivo si basa sui principi di un tunnel natatorio e comprende una rete di tubi e valvole collegati a una pompa sommersa. Il flusso d'acqua è meticolosamente monitorato da un sensore e regolato tramite valvole. Per valutare l'efficacia dell'attrezzo, sono stati implementati due protocolli di allenamento: l'allenamento continuo a intensità moderata (MICT) e l'allenamento a intervalli ad alta intensità (HIIT). I pesci sono stati addestrati collettivamente e le loro prestazioni di nuoto sono state valutate attraverso un test di resistenza. Entrambi i protocolli di allenamento hanno portato a miglioramenti delle prestazioni di nuoto dopo 30 giorni di allenamento e hanno indotto alterazioni nella risposta molecolare all'esercizio rispetto a un gruppo di controllo sedentario. In particolare, l'HIIT ha dimostrato un'efficienza superiore rispetto al MICT. Il sistema di addestramento del pesce zebra si è rivelato uno strumento prezioso per le indagini sulla fisiologia dell'esercizio e fa progredire ulteriormente l'utilità del modello del pesce zebra in questo campo.

Introduzione

L'esercizio fisico comprende qualsiasi movimento corporeo eseguito dai muscoli scheletrici che provoca un aumento del dispendio energetico, con l'esercizio che è un sottoinsieme strutturato e ripetitivo delle attività fisiche1. L'esercizio fisico, un'attività multifattoriale ed economica che coinvolge tutto l'organismo, apporta numerosi benefici per la salute, come la prevenzione della sindrome metabolica e della sarcopenia2. Di conseguenza, il campo della fisiologia dell'esercizio ha un interesse significativo in quanto cerca di chiarire come il corpo si adatta allo stress acuto dell'esercizio, allo stress cronico dell'allenamento fisico e all'impatto complessivo dell'esercizio sulla salute1.

Condurre studi di fisiologia dell'esercizio nell'uomo può essere costoso e dispendioso in termini di tempo a causa delle sfide nella progettazione sperimentale e nel monitoraggio dei partecipanti3. Pertanto, l'uso di modelli animali in ambito di laboratorio è stato altamente raccomandato a causa della loro uniformità genetica e fisiologica. Inoltre, in condizioni di laboratorio controllate, gli animali hanno tipicamente uno stile di vita sedentario e un'assunzione di cibo regolata4. Tra i modelli animali, i roditori sono stati i più utilizzati nella ricerca che coinvolge l'esercizio fisico1. Tuttavia, il pesce zebra (Danio rerio; Hamilton, 1822) è un modello complementare alle specie murine e ad altre specie per gli studi sull'eserciziofisico 5,6,7,8.

Nella ricerca sul pesce zebra, l'esercizio fisico può essere condotto utilizzando tunnel natatori disponibili in commercio o costruiti su misura. Tra le opzioni disponibili in commercio, il tunnel di tipo Blazka, sviluppato da Loligo System, è il 7,9,10 più utilizzato. Questo sistema induce il nuoto forzato attraverso un'elica accoppiata ad un motore elettrico, generando un flusso d'acqua continuo all'interno del tunnel. Questa capacità di nuoto è radicata nel principio della reotassi, un comportamento innato nei pesci che li spinge a nuotare contro le correnti d'acqua e a mantenere la loro posizione11. La reotassi consente la misurazione della velocità critica di nuoto (Ucrit), che rappresenta la velocità massima che un pesce può sostenere per una durata specifica. Tuttavia, vale la pena notare che questa attrezzatura, sebbene preziosa per valutare il comportamento di nuoto e il consumo di ossigeno, ha un costo significativo12.

I ricercatori hanno sviluppato un apparato alternativo per l'esercizio del pesce zebra, spesso basato sul meccanismo di tipo Blazka10,13,14 o su meccanismi più semplici 8,15,16. Tuttavia, questi metodi possono essere limitati dalle esigenze tecniche del protocollo, tra cui durate prolungate, spese sostanziali per le apparecchiature e limitazioni in termini di produttività e precisione. Di conseguenza, l'obiettivo principale dello studio era quello di progettare un sistema di esercizio per pesci zebra economico e facile da usare utilizzando materiali prontamente disponibili, fornendo un nuovo apparato alternativo per l'esercizio fisico nei pesci. Un obiettivo secondario era quello di implementare regimi di esercizio aerobico e anaerobico in zebrafish, facendo avanzare ulteriormente l'utilizzo del modello zebrafish come strategia di intervento nella ricerca sull'esercizio.

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Protocollo

Le procedure hanno ricevuto l'approvazione preventiva del Comitato Etico per l'Uso degli Animali dell'Università Federale di San Paolo (CEUA/UNIFESP n. 9206260521). In questo studio sono state impiegate solo femmine adulte di Danio rerio wild-type, di età pari a 6 mesi e del peso di 2,5-3 g. L'attrezzatura e i reagenti necessari per lo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Attrezzo per esercizi Zebrafish su misura

NOTA: L'attrezzo per esercizi è stato costruito su misura. Per informazioni dettagliate, vedere Figura 1, Tabella supplementare 1, File supplementare 1 e File supplementare 2.

  1. Posizionare una pompa sommersa (N) all'interno di un serbatoio dell'acqua (O) (≥30 L). Assicurarsi che l'acqua soddisfi le seguenti condizioni: pH di 7,2 ± 0,5 e 400 ± 50 μS, 28 ± 1 °C.
  2. Flusso Tabella supplementare 1 e Figura 1, collegare il tubo (I) al punto Tee Pipe (B) e collegare un piccolo tubo (G) al lato di B. Da G, stabilire i collegamenti alla valvola a globo (F), quindi a un'altra G e in sequenza al gomito del tubo (A) e I, completando così il segmento responsabile della regolazione della pressione dell'acqua all'interno del sistema. Questa regolazione si ottiene attraverso un flusso di ritorno al serbatoio dell'acqua (O).
  3. Nella sezione alternata di B, collegarlo a un tubo (J), seguito dai collegamenti ad A e G. Utilizzare il raccordo per tubo a presa (D) per collegare la valvola dell'acqua a saracinesca (E) a G.
  4. Integrare una porta di ingresso per i pesci nel sistema collegando B a G a un'estremità e collegando un altro G all'estremità opposta. Successivamente, collegare il raccordo del tubo della presa (C) a questo secondo G, stabilendo una sequenza che si collega al tubo acrilico (K), che è fondamentale per visualizzare il comportamento del nuoto.
    1. Per collegare K al sensore di flusso dell'acqua (M), utilizzare i tubi C, G e D. Procedere con il collegamento da M a G utilizzando D, quindi integrare A, G e H per facilitare il ritorno dell'acqua al serbatoio.
      NOTA: Inserire una zanzariera nel segmento corto del tubo tra la saracinesca e la valvola a globo (F2) per impedire ai pesci di accedere ad altre sezioni dell'apparecchio. La valvola a globo (F) ha un duplice scopo. La prima valvola a globo (F1) controlla il flusso d'acqua che ritorna al serbatoio prima di entrare nel resto dell'apparato, fungendo da valvola di controllo della pressione del sistema. La valvola a globo (F2) è un punto di ingresso e di uscita per il pesce zebra all'interno del sistema.
  5. Collegare un sensore di flusso d'acqua a valle del tubo acrilico.
    NOTA: Il sensore di flusso deve essere collegato a un display LCD e programmato utilizzando un Arduino (Figura 1). I dettagli della configurazione di Arduino sono forniti nel file supplementare 2.

2. Funzionamento dell'apparecchio

  1. Per introdurre in sicurezza i pesci nel sistema, è fondamentale interrompere il flusso dell'acqua. Per ottenere ciò, chiudere la valvola a saracinesca (E) mantenendo aperta la valvola a globo (F1). Successivamente, aprire la valvola a globo (F2), che funge da ingresso al sistema, introdurre delicatamente il pesce e chiudere prontamente la valvola F2. Infine, aprire la valvola E per riempire d'acqua l'area di esercizio.
  2. Utilizzare la valvola a globo per controllare la velocità del flusso, deviando l'acqua verso il serbatoio quando necessario.
  3. Utilizzare la valvola a saracinesca (F2) per una regolazione precisa del flusso e per gestire l'accesso dei pesci.
  4. Per rimuovere il pesce al termine della prova, chiudere la valvola (E) rispettando i criteri di esaurimento. Quindi, aprire la valvola F e ruotarla di 180° rispetto all'asse del tubo acrilico; Questo faciliterà il drenaggio dell'acqua portando con sé il pesce esausto.
  5. Eseguire il monitoraggio del flusso.
    NOTA: È necessario monitorare la velocità del flusso d'acqua attraverso un sistema che incorpora un Arduino Nano, uno schermo LCD 16 x 2, una resistenza a foro passante da 10 kΩ, 0,25 W e un potenziometro da 10 kΩ. Il sensore di flusso monitora continuamente la velocità del flusso d'acqua basato sulla tecnologia ad effetto Hall17. Ogni impulso di corrente corrisponde a un giro del flopper del sensore, risultando in una frequenza (Hz) di 6,6 x Q (portata in L/min).
    1. Collegare i fili appropriati del sensore di flusso ai pin 5 V, GND e D2 di Arduino Nano (Tabella supplementare 1). Caricare lo schizzo fornito (file supplementare 1) in Arduino utilizzando l'IDE di Arduino. Alimenta il sistema tramite la porta USB di Arduino.
      NOTA: Le misurazioni della portata vengono visualizzate sullo schermo LCD 16 x 2. La calibrazione del sensore di flusso d'acqua è illustrata nella Figura 2. Gli schemi dei collegamenti di Arduino all'LCD sono illustrati nella Figura 3.

3. Test di resistenza

NOTA: Questo passaggio descrive la procedura per il test di resistenza per determinare la velocità massima di nuoto (Umax) del pesce zebra.

  1. Per prima cosa, lasciare che i pesci si adattino per 60 minuti al giorno a una bassa velocità del flusso d'acqua (0,06 m/s) all'interno del tunnel di nuoto per due settimane.
    NOTA: Dopo un periodo di precondizionamento di 24 ore, i singoli pesci zebra saranno sottoposti al test delle prestazioni di nuoto sostenuto. Lo scopo di questo test è quello di stabilire l'Umax di ogni pesce.
  2. Posizionare il pesce zebra singolarmente nell'apparecchiatura.
  3. Condizioni di prova: Posizionare il pesce contro un flusso d'acqua con una velocità iniziale di 0,06 m/s per 10 minuti.
  4. Incrementi di velocità: Aumentare il flusso d'acqua in fasi discrete, con incrementi di velocità di 0,02 m/s che si verificano ogni minuto per 40-50 minuti.
  5. Determinazione Umax: Recpod la velocità massima di nuoto (Umax) quando i pesci soddisfano i criteri di esaurimento.
    NOTA: L'esaurimento è definito quando si osserva la prima delle seguenti situazioni: (1) Incapacità di mantenere la posizione contro il flusso d'acqua per più di tre volte, o (2) Incapacità di mantenere la posizione per più di 5 s.
  6. Chiudere la valvola (E) dopo aver rispettato i criteri di esaurimento. Quindi, aprire la valvola F e ruotarla di 180° rispetto all'asse del tubo acrilico. Questo faciliterà il drenaggio dell'acqua, trasportando il pesce esausto.

4. Gruppi di esercizi e procedura

NOTA: Per stabilire protocolli di esercizio distinti, è essenziale includere un gruppo sedentario esposto a condizioni sperimentali identiche per confrontare gli effetti dei protocolli di esercizio, anche se senza sottoporsi a esercizio ad alta intensità. È inoltre essenziale stabilire l'Umax perché le frazioni del valore Umax sono necessarie per determinare l'intensità dei protocolli di esercizio.

  1. Gruppo sedentario (SED): Sottoporre il pesce a nuoto forzato contro il flusso d'acqua a 0,06 m/s per 60 minuti.
    NOTA: L'apparecchio genera un flusso d'acqua continuo, costringendo i pesci a nuotare contro questa corrente in base al principio della reotassi11.
  2. Gruppo di allenamento continuo a intensità moderata (MICT): sottoporre il pesce a nuoto forzato contro il flusso d'acqua al 60% di Umax, come determinato nel test di capacità massima, per 35 minuti.
    NOTA: Questo protocollo è stato adattato da Húngaro et al.18. Durante i primi 10 minuti, il pesce è stato acclimatato alla stessa velocità del gruppo sedentario (0,05 m/s).
  3. Gruppo HIIT (High-Intensity Interval Training): Sottoporre il pesce a nuoto forzato alternando le velocità di nuoto: 2 minuti al 90% di Umax seguiti da 2 minuti al 30% di Umax, ripetuti per 18 minuti (9 cicli). Questo protocollo è stato adattato da Marcinko et al.19.
    NOTA: Durante i primi 10 minuti del periodo di esercizio, è necessario acclimatare il pesce alla stessa velocità del gruppo sedentario (0,06 m/s).
  4. Implementa tutti i protocolli di allenamento per 5 giorni alla settimana per un periodo di quattro settimane.
    NOTA: I pesci devono essere alloggiati in acquari che offrono condizioni adeguate e devono essere introdotti nell'attrezzo per esercizi solo durante i periodi di esercizio designati. I pesci dovrebbero essere forniti di cibo tropicale in fiocchi tre volte al giorno e l'acqua negli acquari di manutenzione dovrebbe subire un cambio parziale ogni 2 giorni.
  5. Ripetere il test di resistenza alla fine di ogni settimana, con i dati di latenza e velocità nel punto di affaticamento come indicatori dei parametri di condizionamento fisico.
  6. Per indurre gli effetti del sovrallenamento, aumentare settimanalmente la velocità del flusso d'acqua in base ai risultati del test di resistenza condotto dopo ogni ciclo di allenamento di 4 giorni. La durata dell'allenamento deve essere regolata per tenere conto della distanza percorsa (velocità × tempo) e queste durate devono rimanere coerenti tra i gruppi allenati.
  7. Regola il tempo di nuoto in risposta all'aumento del flusso d'acqua, standardizzando così il carico di allenamento tra i gruppi allenati.

5. Misure del corpo

  1. Anestetizzare il pesce con tricaina (p/v) allo 0,0075% per immersione per effettuare misurazioni del corpo (peso e dimensioni)20.
  2. Fotografa e pesa i pesci per determinare le dimensioni del corpo utilizzando il software ImageJ.
  3. Esprimere i dati in termini di indici di condizione corporea (peso [g]/lunghezza standard [mm]2; BMI) e punteggio della condizione corporea (BCS)20.
  4. Per eliminare le variazioni di dimensioni e peso causate dalla formazione delle uova, sottoporre il pesce alla riproduzione standard20, seguita da misurazioni e pesatura.

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Risultati

L'apparecchio per esercizi ha dimostrato una notevole efficienza nella regolazione della velocità del flusso. Per migliorare gradualmente la velocità di nuoto, il flusso d'acqua è stato aumentato settimanalmente in modo incrementale per tutti i gruppi, ad eccezione del gruppo SED, che è stato mantenuto a una velocità di flusso costante di 0,06 m/s. In particolare, l'apparato ha consentito un notevole livello di precisione, raggiungendo regolazioni della velocità del flusso fino a 0,001 m/s. Tuttavia, il tasso di errore e...

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Discussione

In questo studio, è stato sviluppato un sistema di esercizi innovativo ed economico ispirato al respirometro a tunnel natatorio di Loligo Systems21 e al sistema di canali22 per l'esame completo delle prestazioni di nuoto del pesce zebra. L'Umax è stato determinato aumentando sistematicamente il flusso d'acqua in fasi discrete, con incrementi di velocità che si verificano a brevi intervalli (20-30 minuti) fino a quando il pesce raggiunge l'e...

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Dichiarazioni

È essenziale chiarire che non vi sono interessi finanziari concorrenti associati alla ricerca presentata in questo manoscritto. Non sono state stabilite partnership finanziarie o affiliazioni con organizzazioni o entità che potrebbero potenzialmente influenzare o influenzare i risultati di questo lavoro. Questa affermazione serve a garantire che il processo di ricerca sia stato semplice e onesto, senza conflitti finanziari che hanno influenzato i risultati. La presentazione di questo lavoro è motivata da un'autentica passione per l'argomento, guidata esclusivamente dall'amore per il mondo accademico e dalla ricerca della conoscenza scientifica.

Ringraziamenti

La gratitudine va al Dr. Omar Mertins per aver generosamente fornito l'accesso al laboratorio per il mantenimento dei pesci e l'esecuzione dei test. Inoltre, vengono riconosciuti FAPESP, CNPq e CAPES per l'assegnazione di borse di studio a sostegno di questa ricerca.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Gomito femmina a 90 gradi CPVC per impianto idraulicoTigre221502603/4 di pollice 
24AWG WireSky Cablo StoreCollegamento tra i componenti nel circuito perforato (1 m)
Tubo acrilicoThe Clear Plastic Shop411384083/4 di pollice 
Acquario sommergibileAqua Tank300w
CPVC tubotigre101217873/4 di pollice 
Valvola dell'acqua a saracinesca filettata femminaTigre279503103/4 di pollice
Valvola dell'acqua a globo filettata femminaTigre279405103/4 di pollice 
resistenza a foro passanteBXV10 kΩ, 0,25 W t
Supporto da laboratorio con morsetto con asta da 30 pollici Masiye LabsRSC0001Supporta lo
schermo LCDEichip16 x 2, modello JHD162A
Ponticelli Dupont Maschio x MaschioChyanConnessione tra arduino e sensore di flusso (30 cm)
Circuito Stampato Forato monofaccialeKY WIN ROBOT5 x 10 cm
PotenziometroLUSYADL-ALPSA0110KΩ
Rotolo di nastro di blocco dell'acquaOne World5603131000Per evitare perdite Tubo
in siliconeTigre142112502 cm interno
Stazione di saldaturaQHTITECEU / US PLUGArduine system welding 
Bobina di filo di saldaturaBEEYIHFI001-A001-SetArduine sistema di saldatura 
Presa maschio filettata e presa femmina non filettata Raccordo per tubi CPVC354478493/4 di pollice
Tricaina (MS-222)Sigma-AldrichE10521Scheda anestetica
UNO-R3 UNO R3 CH340G+MEGA328P Chip 16Mhz FSXSEMIper Arduino UNO R3 Scheda di sviluppo Raccordo
T CPVC non filettato,Tigre222002673/4 di pollice 
Raccordo per tubo femmina CPVC non filettatoTigre 221702603/4 di pollice 
Sensore di flusso d'acqua  modello YF-B5 Siqma RoboticsSQ86591-25 L/min
 SunsunModello HJ-2041, 3000L/h, 65W
Serbatoio acquaCustom30 L
acquario acquario dei tubi orizzontali a femmina Pompa dell'acqua

Riferimenti

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