Articolo metodologico

MLH1 Espressione genica nel sangue periferico nei pazienti con cancro del colon e loro associazione con il cancro del colon

977 visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/66387

⸱

27 settembre 2024

 ,  , 
1Oncology Department, Affiliated Hospital 2 of Nantong University, Nantong First People's Hospital, 2Department of Emergency, Affiliated Hospital 2 of Nantong University, Nantong First People's Hospital

In questo articolo

Sommario

Questo studio esamina l'associazione tra l'espressione del gene MLH1 nel sangue periferico e nel cancro del colon, utilizzando un approccio caso-controllo per confrontare i livelli di espressione nei pazienti e nei controlli sani abbinati.

Abstract

L'omologo 1 di MutL (MLH1) è un componente del complesso eterodimerico MutLα che rileva e corregge le discrepanze base-base e i loop di inserzione/delezione causati dalla mancata incorporazione di nucleotidi. In assenza della proteina MLH1, la frequenza dei disallineamenti non riparati aumenta, con conseguente cancro d'organo. L'attuale studio ha cercato di quantificare l'espressione del gene MLH1 e la sua relazione con l'invasione tumorale (T) e l'invasione linfonodale (N) in campioni di sangue di pazienti con cancro del colon-retto (CRC). I campioni di sangue sono stati ottenuti da 36 pazienti con CRC. L'RNA è stato estratto e il cDNA è stato sintetizzato utilizzando un kit. I primer sono stati costruiti utilizzando l'approccio della giunzione esone-esone e i geni MLH1 e β-actina sono stati testati 3 volte utilizzando la reazione a catena della polimerasi in tempo reale (Real-Time PCR). Per analizzare i dati è stato utilizzato un software di analisi dell'espressione genica e un t-test è stato utilizzato per esaminare l'espressione di MLH1 e la sua connessione con le variabili T e N. In questo studio sono stati inclusi 36 pazienti con carcinoma colorettale, di cui 15 (41,6%) donne e 21 (58,4%) uomini, con un'età media di 57,35 ± 4,22 anni e nella fascia di età 26-87 anni. I risultati hanno mostrato che il rapporto di espressione del gene MLH1 nei pazienti è diminuito rispetto a quello negli individui sani e la diminuzione dell'espressione genica nelle diverse fasi della malattia è stata significativa. I risultati di questo studio hanno dimostrato che la riduzione dell'espressione genica di MLH1 ha un ruolo efficace nello sviluppo del CRC.

Introduzione

Il cancro del colon (CRC) è uno dei tipi più comuni di cancro. È la quarta causa di morte correlata al cancro in tutto il mondo1. Il CRC è più frequente nei maschi che nelle femmine ed è da tre a quattro volte più comune nei paesi industrializzati che nei paesi in via di sviluppo. Il tasso di incidenza standardizzato per età (globale) per 1 x 105 di incidenza di CRC è di 19,7 in entrambi i sessi, 23,6 negli uomini e 16,3 nelle femmine2. Studi epidemiologici hanno dimostrato forti associazioni ambientali e di stile di vita con il CRC. L'obesità, la carne rossa/lavorata, il tabacco, l'alcol, la terapia di deprivazione androgenica e la colecistectomia sono tutti associati a un modesto aumento dei rischi di CRC 2,3.

L'instabilità cromosomica, l'instabilità dei microsatelliti e il fenotipo metilatore dell'isola CpG (CIMP) svolgono un ruolo importante nella tumorigenesi del CRC4. Secondo studi precedenti, sono state identificate circa 250 diverse mutazioni nei pazienti con CRC, che equivalgono a circa il 55% delle mutazioni note correlate ai geni di riparazione del mismatch del DNA (MMR). I difetti nelle proteine di riparazione del mismatch possono essere causati da mutazioni germinali nei geni MSH6, MLH1, PMS2 e MSH2 e la maggior parte di queste mutazioni si trova nei geni MLH1 e MSH2 4,5. La proteina più importante nel sistema MMR, che di solito è coinvolta nel CRC, è MLH1. Studi recenti hanno dimostrato che qualsiasi cambiamento nell'espressione di MLH1 può aumentare il rischio di CRC. Le mutazioni germinali in MLH1 sono responsabili della sindrome di Lynch, un tipo ereditario di CRC. Inoltre, il 13%-15% dei casi di cancro diffuso del colon è causato da deficit di MLH1 basato sull'ipermetilazione del promotore somatico 6,7,8.

Il gene MLH1 si trova sul braccio corto del cromosoma 3 in posizione 22.2 e contiene 21 esoni9. La proteina codificata dal gene MLH1 può cooperare con un'endonucleasi coinvolta nella riparazione del mismatch, PMS2, per generare MutLα, che fa parte del sistema MMR. MutLα è principalmente coinvolto nella riparazione di disallineamenti base-base e loop di delezione e addizione come risultato di una replicazione incompleta del DNA. Inoltre, la proteina codificata è coinvolta nella segnalazione del danno al DNA e può essere convertita nella forma ɣMutL con la proteina MLH3, che è coinvolta nella riparazione del mismatch del DNA osservata nella meiosi 10,11,12. Gli studi hanno dimostrato che MLH1 è coinvolto in altre importanti attività cellulari, tra cui la regolazione dei checkpoint del ciclo cellulare, l'apoptosi, la ricombinazione crossover e l'incompatibilità mitotica13.

Il gene MLH1 svolge un ruolo chiave nel sistema di riparazione del mismatch del DNA (MMR). Un difetto nella funzione di questo gene può portare all'accumulo di mutazioni genetiche e, di conseguenza, allo sviluppo del cancro del colon-retto14. Studi precedenti hanno dimostrato che circa il 55% delle mutazioni associate ai geni MPR nei pazienti con CRC sono correlate alle mutazioni del gene MLH1. Inoltre, la diminuzione dell'espressione genica di MLH1 può portare alla sindrome di Lynch, che è una forma ereditaria di cancro del colon-retto15,16. Inoltre, il difetto del gene MLH1 basato sull'ipermetilazione del promotore somatico è stato osservato nel 13%-15% dei casi sporadici di cancro del colon-retto17. Queste prove scientifiche dimostrano che il gene MLH1 agisce come un importante biomarcatore nel cancro del colon-retto e la sua analisi dell'espressione può fornire informazioni preziose sulla funzione della via MMR e sul rischio genetico di CRC18. La misurazione dei livelli di espressione di MLH1 nel sangue periferico dei pazienti con cancro del colon può fornire informazioni preziose sulla funzionalità della via MMR, che è spesso interrotta nel cancro del colon. Questo metodo può essere utilizzato a scopo prognostico e per comprendere la suscettibilità genetica al cancro del colon 19,20. Uno studio sulla relazione tra la mutazione MLH1 415 locus G to C e il cancro colorettale sporadico nei pazienti cinesi ha rilevato che la frequenza del genotipo MLH1 C/C era significativamente più alta nei pazienti con CRC sporadico rispetto ai controlli, suggerendo una suscettibilità genetica al CRC sporadico nei pazienti cinesi21. Un altro studio ha confrontato l'espressione genica dei biomarcatori genetici del CRC nel sangue periferico e nei campioni bioptici di pazienti con malattia infiammatoria intestinale (IBD), evidenziando il potenziale dell'analisi dell'espressione genica del sangue periferico per la comprensione dei biomarcatori correlati al cancro del colon22.

Considerando l'importante ruolo del gene MLH1 e gli studi condotti negli ultimi decenni con l'analisi molecolare attraverso il profilo dell'espressione dell'mRNA, i tumori sono stati classificati con maggiore accuratezza. Lo scopo di questo studio è stato quello di studiare quantitativamente l'espressione di MLH1 in campioni di sangue periferico di pazienti con CRC utilizzando la PCR in tempo reale e di indagare la sua relazione con fattori patologici, stadi di progressione del tumore agli strati della parete intestinale (T) e stadi di invasione ai linfonodi (N). Questo studio è stato condotto su 36 pazienti con CRC per stabilire potenzialmente cambiamenti quantitativi nell'espressione genica come biomarcatori per lo screening, la prognosi e la diagnosi del CRC utilizzando campioni di sangue periferico.

Protocollo

Una ricerca caso-controllo è stata condotta presso l'Affiliated Hospital 2 dell'Università di Nantong tra aprile 2021 e maggio 2023. Impegnarsi con il dipartimento amministrativo dell'ospedale per stabilire il quadro di studio. L'approvazione etica è stata ottenuta presentando la proposta di studio al Comitato Etico dell'Università di Nantong. Sono state seguite linee guida etiche per garantire la riservatezza e il consenso informato.

1. Reclutamento dei pazienti e disegno dello studio

  1. Campionamento per l'inclusione dei partecipanti allo studio
    1. Studiare l'espressione del gene MLH1 nel sangue periferico di 36 individui con cancro del colon e di un gruppo di controllo. Sviluppare chiari criteri di inclusione ed esclusione per la selezione dei partecipanti.
    2. Reclutare individui con diagnosi di tipi specifici di cancro del colon (cancro del colon rettosigmoideo, cieco, ascendente, trasverso e discendente che sono stati considerati affetti da tumori del colon-retto) e avere il consenso informato.
    3. Escludere individui con altre diagnosi di cancro o condizioni che potrebbero confondere l'analisi dell'espressione genica. Inoltre, escludere i partecipanti con una storia di trasfusioni di sangue negli ultimi 3 mesi, una storia di chemioterapia o radioterapia negli ultimi 6 mesi, una storia di uso di alcol o droghe e una storia di malattie autoimmuni o malattie infiammatorie intestinali.
  2. Classificare i fattori di rischio clinico in base al sistema di stadiazione TNM (Tumore, Nodi e Metastasi), considerando la massa del cancro, le dimensioni del tumore e l'invasione degli organi adiacenti23,24.
    1. Dividi i diversi stadi del cancro (0-4) in base ai dati del file patologico disponibili.
    2. Segmentare il tasso di crescita e progressione del tumore negli strati della parete intestinale (indice T) in quattro gruppi distinti (T1-4, T0-TX) e l'invasione linfonodale (indice N) in quattro gruppi (N1-3, N0-NX).
  3. Prepara un gruppo di controllo con individui sani.
    1. Abbinare il gruppo di controllo al gruppo di pazienti in termini di età e sesso. Raccogli dati demografici dettagliati per ogni partecipante per garantire la comparabilità.
  4. Processo di consenso informato
    1. Preparare documenti di consenso informato che spieghino lo scopo, le procedure e i potenziali rischi dello studio.
    2. Interagisci con i partecipanti, fornendo loro tutto il tempo per porre domande. Raccogli i moduli di consenso informato firmati prima di procedere con la raccolta del campione.

2. Estrazione e purificazione dell'RNA

  1. Raccolta di campioni di sangue periferico
    1. Procuratevi provette rivestite in EDTA disponibili in commercio, certificate per uso clinico o di laboratorio. Verificare la data di scadenza delle provette. Verificare l'integrità dell'imballaggio del tubo.
    2. Chiedi al partecipante di sedersi comodamente. Utilizzando una siringa sterile, prelevare 5 mL di sangue dalla vena antecubitale. Assicurarsi che il partecipante sia rilassato, con il braccio teso per esporre la vena. Trasferire immediatamente i campioni di sangue nelle provette preparate, garantendo un'esposizione minima all'aria.
    3. Mantenere i campioni a 4 °C durante il trasporto in laboratorio per preservarne l'integrità.
  2. Utilizzare un mini kit di sangue RNA per l'isolamento dell'RNA seguendo le istruzioni del produttore.
    1. In breve, lisare i globuli rossi incubando l'intero campione di sangue con Buffer EL su ghiaccio. Centrifugare per pellettare i leucociti e scartare il surnatante. Lisi i leucociti con il tampone RLT e omogeneizzare il lisato utilizzando una colonna trituratrice.
    2. Aggiungere etanolo al lisato omogeneizzato e trasferire in una colonna di rotazione. Lavare la colonna con Buffer RW1 e Buffer RPE. Eluire l'RNA purificato aggiungendo acqua priva di RNasi alla colonna e centrifugando.
  3. Valutazione della quantità e della qualità dell'RNA
    1. Quantificazione dell'RNA: utilizzare uno spettrofotometro per misurare la concentrazione e la purezza dell'RNA. Aprire il software sul computer collegato. Seleziona l'opzione Acido nucleico dal menu principale. Applicare 1 μL di campione di RNA sull'area del campione.
    2. Testare la purezza e l'integrità dell'RNA
      NOTA: L'integrità e la distribuzione dimensionale dell'RNA totale purificato con il mini kit di sangue RNA possono essere verificate mediante spettrofotometria ed elettroforesi su gel. Gli RNA ribosomiali dovrebbero apparire come bande o picchi acuti. Il rapporto apparente tra l'rRNA 28S e l'rRNA 18S dovrebbe essere di circa 2:1. Se le bande ribosomiali o i picchi di un campione specifico non sono taglienti ma appaiono come una striscia verso RNA di dimensioni più piccole; è probabile che il campione abbia subito una degradazione maggiore prima o durante la purificazione dell'RNA.
      1. Per la misurazione spettrofotometrica, abbassare il braccio del dispositivo e fare clic su Misura per ottenere il rapporto A260/A280. Valutare la purezza del campione di RNA, puntando a un rapporto A260/A280 compreso tra 1,8 e 2,0.
      2. Eseguire l'elettroforesi su gel di agarosio all'1% come descritto di seguito.
        1. Preparare la soluzione di agarosio all'1% riscaldando la polvere di agarosio nel tampone TAE fino a dissoluzione. Aggiungere bromuro di etidio alla soluzione di agarosio per ottenere una concentrazione finale di 0,5 μg/mL. Versare la soluzione di bromuro di agarosio ed etidio in un vassoio di colata di gel e lasciarla solidificare.
          NOTA: Il bromuro di etidio è un colorante fluorescente che si intercala con l'RNA per consentire la visualizzazione sotto la luce UV.
        2. Mescolare i campioni di RNA con il colorante di caricamento e caricarli con cura nei pozzetti del gel solidificato. Eseguire l'elettroforesi su gel a 100 V per circa 30 minuti per separare i frammenti di RNA in base alle dimensioni. Visualizza le bande di RNA posizionando il gel su un transilluminatore UV o su un sistema di imaging, che provoca la fluorescenza dell'RNA colorato con bromuro di etidio.
  4. Conservazione dell'RNA estratto
    1. Prelevare i campioni di RNA estratti. Aliquotare l'RNA in provette sterili per microcentrifuga, utilizzando volumi di 10 μl per aliquota. Conservare le aliquote di RNA a -80 °C o meno.
  5. Trascrizione inversa dell'RNA in cDNA
    1. Segui il protocollo del kit di trascrizione inversa. Scongelare e preparare i reagenti necessari su ghiaccio e a temperatura ambiente.
    2. Eseguire una reazione di eliminazione del DNA genomico per rimuovere qualsiasi contaminazione del DNA genomico.
    3. Preparare la master mix di trascrizione inversa su ghiaccio, che contiene tutti i componenti tranne l'RNA stampo.
    4. Aggiungere l'RNA stampo dalla fase di eliminazione del DNA al master mix di trascrizione inversa. Incubare la reazione di trascrizione inversa a 42 °C per 15 minuti.
    5. Inattivare l'enzima trascrittasi inversa incubando a 95 °C per 3 minuti. Utilizzare un'aliquota del cDNA finito per la PCR immediata in tempo reale o conservare il cDNA a -20 °C per un uso successivo.

3. Progettazione di primer per la PCR in tempo reale

  1. Selezione dei geni bersaglio e controlli interni
    1. Scegli il gene MLH1 come bersaglio per la quantificazione a causa della sua associazione con il cancro del colon. Selezionare la β-actina come controllo interno per la normalizzazione dei dati di espressione genica.
  2. Processo di progettazione del primer
    1. Avvia il software di progettazione del primer e inserisci la sequenza genica di MLH1 ottenuta dall'Ensemble o dall'UCSC Genome Browser.
    2. Impostare la temperatura di fusione (Tm) per i primer tra 58-60 °C, il contenuto ottimale di GC al 40%-60% e la lunghezza del primer tra 18-24 nucleotidi.
    3. Inserire le sequenze di primer progettate nel database NCBI BLAST per confermare la specificità.
      1. Vai al sito web di BLAST, seleziona Nucleotide BLAST. Incolla le sequenze di primer nella casella di ricerca e fai clic su BLAST.
      2. Analizza i risultati per assicurarti che non sia prevista alcuna amplificazione fuori bersaglio. Vedere la Tabella 1 per i dettagli.

4. PCR in tempo reale

  1. Configurazione della reazione PCR in tempo reale. Vedere la Tabella 2 per i dettagli.
    1. Centrifugare i reagenti a 4 °C per 5 minuti a 10.000 x g per raccogliere il contenuto sul fondo delle provette.
    2. Preparare una master mix secondo il protocollo del kit commerciale, che include SYBR Green, tampone, dNTP, MgCl2 e Taq polimerasi.
    3. Allocare la miscela master in provette PCR etichettate, garantendo la coerenza del volume tra i campioni.
    4. Aggiungere il volume appropriato di primer diretti e inversi per MLH1 e β-actina nelle rispettive provette.
    5. Diluire i campioni di RNA a una concentrazione costante di 100 ng/μL prima della trascrizione inversa e trascrivere inversamente in cDNA utilizzando un kit di trascrizione inversa.
  2. Amplificazione e raccolta dati
    1. Posizionare le provette per PCR nel sistema PCR in tempo reale.
    2. Programmare il termociclatore con le condizioni di ciclo ottimizzate: 95 °C per 20 s per la denaturazione, 54 °C per 30 s per la ricottura e 72 °C per 30 s per l'estensione. Vedere la Tabella 3 per i dettagli.
    3. Impostare la macchina in modo che funzioni per 45 cicli.
    4. Monitorare la reazione in tempo reale sull'interfaccia software del sistema, osservando le curve di amplificazione per ogni campione.
    5. Includere un controllo negativo senza cDNA per verificare la presenza di contaminazione. Ripetere l'esecuzione della PCR 3 volte per ogni campione per garantire l'affidabilità dei dati.
  3. Analisi dei dati
    1. Dopo aver completato i cicli, utilizzare il software del sistema per analizzare i valori del ciclo di soglia (Ct). Esporta i valori Ct in un foglio di calcolo per ulteriori analisi.
    2. Calcolare l'espressione genica relativa utilizzando il metodo 25-ΔΔCt, normalizzando i dati al controllo β-actina.

5. Immunoistochimica e analisi genetiche

  1. Condurre immunoistochimica su sezioni di tessuto per correlare l'espressione della proteina MLH1 con i livelli di espressione genica.
    1. Preparare i vetrini di tessuto e applicare l'anticorpo anti-MLH1.
    2. Utilizzare un anticorpo secondario coniugato HRP e un kit di substrati DAB (3,3'-diaminobenzidina). Sviluppare i vetrini secondo le istruzioni del kit e analizzarli con un microscopio ottico.
  2. Eseguire la PCR specifica per la metilazione e i test di instabilità dei microsatelliti per distinguere tra sindrome di Lynch e CRC sporadico.
    1. Usa un kit di estrazione del DNA commerciale. Seguire il protocollo del kit sia per il sangue che per i tessuti tumorali.
    2. Trattare il DNA con un kit di conversione del bisolfito. Utilizzare primer specifici per la metilazione progettati per la regione del promotore MLH1. Eseguire la PCR come da protocollo del kit.
    3. Eseguire l'elettroforesi su gel sui prodotti PCR per visualizzare lo stato di metilazione.
    4. Per i test di instabilità dei microsatelliti (MSI), elettroforesi capillare utilizzando un analizzatore genetico. Confronta le lunghezze dei microsatelliti analizzando i prodotti PCR marcati in fluorescenza.

6. Analisi statistica

  1. Utilizzare software di analisi statistica commerciale per l'analisi dei dati.
    1. Apri il software e crea un nuovo set di dati per l'espressione genica e i dati demografici.
    2. Inserire i valori relativi di espressione genica e i dati demografici corrispondenti nel set di dati.
    3. Utilizzare il test di Kolmogorov-Smirnov per valutare la normalità dei dati.
      1. Selezionare Analizza dal menu in alto, scegliere Test non parametrici, quindi Finestre di dialogo legacy.
      2. Fare clic su Test di Kolmogorov-Smirnov e inserire la variabile per l'espressione genica. Eseguire il test e interpretare l'output per il significato della normalità della distribuzione.
    4. Condurre test T per confrontare l'espressione del gene MLH1 tra i pazienti e i gruppi di controllo.
      1. Selezionare Analizza, quindi Confronta medie e scegliere Test T a campioni indipendenti.
      2. Assegna l'appartenenza al gruppo (paziente o controllo) come variabile di raggruppamento e l'espressione genica come variabile di test. Esegui il test e interpreta il livello di significatività a due code.
    5. Calcolare le variazioni di piegatura nell'espressione genica utilizzando il metodo 2-ΔΔCt 25.

Risultati

In questo studio, 36 pazienti con cancro del colon sono stati esaminati per l'espressione del gene MLH1 nel sangue periferico e la sua relazione con il cancro del colon. L'analisi delle variabili demografiche ha mostrato che 15 pazienti (41,6%) erano donne e 21 pazienti (58,4%) erano uomini. L'età media dei pazienti era di 57,35 ± 4,22 anni e la fascia di età era di 26-87 anni. Lo stato dell'indice di massa corporea (BMI) dei pazienti ha mostrato che 14 pazienti (38,8%) avevano un BMI normale (18,5 e 24,9 kg/m2) e 22 pazienti (61,2%) non avevano un BMI entro l'intervallo normale (inferiore a 18,5 o superiore a 24,9 kg/m2). Le caratteristiche istopatologiche dei casi di cancro del colon-retto sono state le seguenti: il grado del tumore è stato classificato secondo il sistema di classificazione dell'OMS26, con 12 casi (33,3%) ben differenziati, 18 casi (50%) moderatamente differenziati e 6 casi (16,7%) scarsamente differenziati. L'invasione linfovascolare era presente in 14 casi (38,9%) e l'invasione perineurale è stata osservata in 9 casi (25%). Tutti i pazienti avevano margini di resezione chiari. I risultati dell'esame della variabile della posizione del tumore hanno mostrato che 20 tumori (55,5%) erano nel colon e 16 (45,5%) erano nel retto. Di tutti i tumori, 4 tumori (11,1%) erano più piccoli di 10 mm e 32 tumori (88,9%) erano più grandi di 10 mm (Tabella 4).

Abbiamo condotto un'analisi stratificata dell'ipermetilazione del promotore MLH1 e della sindrome di Lynch. Dei 36 pazienti con cancro del colon, 10 (27,8%) avevano ipermetilazione del promotore MLH1, mentre il sequenziamento genetico ha identificato 5 pazienti (13,9%) con mutazioni germinali coerenti con la sindrome di Lynch. I restanti 21 pazienti (58,3%) non presentavano ipermetilazione MLH1 o sindrome di Lynch, suggerendo CRC sporadico (Tabella 5).

Nel presente studio, i test genetici e la storia familiare sono stati utilizzati per identificare i casi di deficit ereditario di MLH1 rispetto al deficit somatico di MLH1 . Dei 36 pazienti, 12 avevano una storia familiare di sindrome di Lynch e il sequenziamento genetico ha confermato le mutazioni germinali di MLH1 in 5 di questi pazienti (13,9%). I restanti 7 pazienti con anamnesi familiare non mostravano mutazioni germinali, ma presentavano deficit somatici di MLH1 , probabilmente dovuti a mutazioni acquisite o cambiamenti epigenetici, come l'ipermetilazione. Dei 24 pazienti senza una storia familiare di sindrome di Lynch, 15 (41,7%) avevano deficit somatico di MLH1 dovuto a ipermetilazione o mutazioni somatiche. I restanti 9 pazienti senza storia familiare avevano livelli di espressione di MLH1 normali, suggerendo altri meccanismi che guidano il CRC.

Il gruppo con deficit ereditario di MLH1 ha mostrato la riduzione più significativa dell'espressione di MLH1 , con una variazione media di 0,4, che era statisticamente significativa (p <0,01). Anche il gruppo con deficit somatico di MLH1 ha mostrato una significativa riduzione dell'espressione con una variazione media della piega di 0,6 (p <0,001). Il gruppo con livelli di espressione normali di MLH1 non ha mostrato una differenza statisticamente significativa rispetto al gruppo di controllo sano (Tabella 6).

La Figura 1 confronta i livelli di espressione genica di MLH1 tra i due gruppi. In particolare, i pazienti con CRC hanno mostrato livelli significativamente più bassi di espressione genica MLH1 rispetto agli individui sani (p ≤ 0,001; Figura 1).

Il livello di espressione genica in ogni stadio della malattia rispetto a quello delle persone sane è mostrato nella Tabella 7. Il livello di espressione genica di MLH1 era significativo nello stadio II (p ≤ 0,02), nello stadio III (p ≤ 0,01) e nello stadio IV (p ≤ 0,03). Ciò indica una diminuzione dell'espressione genica in queste fasi della malattia nelle persone malate rispetto alle persone sane.

figure-results-1
Figura 1: Espressione genica di MLH1 . Confronto dell'espressione del gene MLH1 in campioni di sangue di due gruppi di pazienti con cancro del colon-retto e persone sane. La differenza è significativa (p ≤ 0,001). Il test statistico utilizzato è il t-test indipendente. Le barre di errore indicano l'errore standard della media (SEM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

AbbecedarioSequenza di primerLunghezzaTa (°C)
MLH1 Primer in avantiTCAGGTCATCGGAGCAAGCAC2360
MLH1 Innesco inversoCGATCTTCCTCTCTGTCAAGCCAC2058

Tabella 1: Primer utilizzati nello studio. La sequenza dei primer progettati e la lunghezza del prodotto PCR per il gene bersaglio MLH1 . Viene fornita anche la temperatura di ricottura (Ta).

ReagenteVolume (μL)Concentrazione finale
2x PCR Master Mix101x (come da istruzioni del kit)
Primer in avanti (10 μM)10,5 μM
Primer inverso (10 μM)10,5 μM
Modello di cDNA2100 ng/μL ipotizzati
Acqua priva di nucleasi6per regolare il volume

Tabella 2: Configurazione della reazione.

45 cicli
FaseTemperaturaDurata
Denaturazione95 °C20 minuti
Ricottura54 °C30 secondi
Estensione72 °C30 secondi

Tabella 3: Ciclo di temperatura e tempo trascorso nella tecnica di PCR in tempo reale.

PazienteStato
Età4,22 ± 57,35 (26-86) anno
GenereMaschio(58.4%) 21
Femmina(41.6%) 15
BMInormale(38.8%) 14
Anormale(61.2%) 22
Storia familiare di cancro del colon(33.3%) 12
Diagnosi istopatologicaBen differenziato(33.3%) 12
Moderatamente differenziato(50%) 18
Scarsamente differenziato(16.7%) 6
InvasioneLinfovascolare(38.9%) 14
Perineural(25%) 9
Altro(36.1%) 13
Margini di resezionechiaro(100) 36
UbicazioneColon(55.5%) 20
Retto(45.5%) 16
Grandezza< 10 mm(11.1%) 4
> 10 mm(88.9%) 32

Tabella 4: Caratteristiche demografiche e cliniche dei pazienti.

GruppoNumero di pazientiPercentuale
Ipermetilazione MLH11027.80%
Sindrome di Lynch513.90%
Né2158.30%

Tabella 5: Dati sull'ipermetilazione del promotore MLH1 e sullo stato della sindrome di Lynch.

GruppoNumero di pazientiPercentualeCambio di piega medioValore P
Deficit ereditario di MLH1513.90%0.4<0,01
Deficit somatico di MLH12261.10%0.6<0,001
Espressione normale di MLH1925%0.9>0,05

Tabella 6: Livelli di espressione genica MLH1 nei pazienti con CRC. La variazione media del fold indica il livello di espressione del gene MLH1 rispetto al gruppo di controllo. Un cambio di piega inferiore a 1 indica una riduzione dell'espressione.

PalcoCambio piegaValore P
DecrescereAumento
Tappa 01.8-0.33
Fase I1.7-0.12
Fase II2.2-0.02
Fase III5.2-0.01
Fase IV7.3-0.03

Tabella 7: Espressione genica in diversi stadi. Il livello relativo di espressione genica in ciascuno dei diversi stadi della malattia rispetto alle persone sane.

Discussione

Questo studio è stato condotto con l'obiettivo di indagare l'espressione del gene MLH1 . In questo studio, è stato dimostrato che il livello di espressione del gene MLH1 era diminuito nelle persone malate rispetto alle persone sane. Sulla base di studi sul cambiamento di piega, è stato dimostrato che l'espressione del gene MLH1 in stadio II, stadio III e stadio IV nelle persone malate rispetto alle persone sane ha avuto una diminuzione significativa.

Il cancro del colon-retto è un problema importante nella gestione del cancro nel mondo a causa della sua prevalenza e del tasso di sopravvivenza 3,27. Considerando che l'aspettativa di vita di alcuni pazienti con tumore del colon-retto non raggiunge nemmeno i 5 anni e anche perché le esigenze dei pazienti con tumore sono diverse nei diversi anni dopo la diagnosi, un'indagine completa sul cancro del colon-retto è un'esigenza essenziale28,29.

Nel frattempo, l'avvio di test diagnostici molecolari completamente specifici insieme ai sintomi clinici può essere un aiuto efficace per diagnosticare le persone a rischio e anche le persone senza sintomi clinici di cancro del colon-retto30,31. I difetti nelle proteine di riparazione del mismatch possono derivare da mutazioni in geni come MLH1. La proteina più importante della riparazione del mismatch del DNA coinvolta nel cancro del colon è MLH132,33.

Secondo gli studi, il gene MLH1 è correlato a molti tumori, tra cui il colon-retto, lo stomaco, l'esofago e la cervice34. Il gene MLH1 svolge un ruolo essenziale nella riparazione del DNA e questa proteina aiuta a correggere gli errori che si verificano durante la replicazione del DNA in preparazione alla divisione cellulare35. Pertanto, una migliore identificazione del meccanismo e dell'espressione del gene MLH1 può determinare come si verifica il cancro del colon-retto e, identificando questo meccanismo, è possibile adottare misure appropriate per prevenire e trattare il cancro del colon-retto36.

Guo et al. hanno condotto uno studio in Cina con l'obiettivo di indagare l'espressione genica di MLH1 e MSH2 con caratteristiche clinicopatologiche nel cancro del colon-retto. In questo studio sono stati raccolti dati clinici e patologici di 88 pazienti sottoposti a trattamento oncologico. La variazione di piega di MLH1 e MSH2 nei tessuti è stata misurata mediante qRT-PCR e la relazione tra MLH1 e MSH2 è stata analizzata utilizzando i dati patologici dei pazienti. I risultati di questo studio hanno confermato i risultati del nostro studio e hanno dimostrato che l'espressione dei geni MLH1 e MSH2 è inferiore nei tessuti tumorali rispetto ad altri tessuti37.

In un altro studio condotto da Liu et al., è stata indagata l'analisi dell'espressione dei geni MLH1 e PMS2 in pazienti anziani con cancro del colon-retto e la sua relazione con le caratteristiche della patologia clinica. In questo studio di coorte retrospettivo, i pazienti anziani con cancro del colon-retto da gennaio 2014 a dicembre 2018 che sono stati ricoverati in un ospedale di Pechino sono stati divisi in due gruppi, MLH1 e PMS. Le caratteristiche patologiche e l'espressione genica sono state confrontate in due gruppi. I risultati hanno mostrato che l'espressione genica di MLH1 è diminuita nei pazienti e questa diminuzione dell'espressione genica è evidente anche in diversi stadi del cancro e la diminuzione dell'espressione genica nei pazienti è correlata all'età di insorgenza, alla rapida progressione del tumore, alla scarsa differenziazione e alla stadiazione patologica38.

Questa diminuzione dell'espressione genica è stata dimostrata in altri studi in altri paesi. In studi condotti negli Stati Uniti39, in Iran40 e in Irlanda41, è stata dimostrata una diminuzione dell'espressione del gene MLH1 nei pazienti con cancro del colon-retto.

Lo standard attuale prevede l'analisi universale dei tumori di campioni di CRC resecati utilizzando IHC e tecniche molecolari. I pazienti con risultati anomali dell'IHC vengono successivamente indirizzati al test mutazionale definitivo. Tuttavia, i recenti sviluppi nella nostra comprensione della genetica molecolare hanno trasformato lo screening e le pratiche diagnostiche per la sindrome di Lynch42. Uno studio di Alipoor et al. ha analizzato quantitativamente l'espressione del gene MLH1 e la sua associazione con la profondità dell'invasione tumorale (T) e l'invasione linfonodale (N) in campioni di sangue di pazienti iraniani con CRC. Lo studio ha rilevato che l'espressione genica MLH1 era significativamente associata agli stadi T e N, suggerendo che l'analisi dell'espressione genica MLH1 potrebbe fornire informazioni aggiuntive oltre alle tecniche IHC43. Inoltre, uno studio di Halil et al. ha analizzato l'impatto di ogni specifica perdita genica MMR e le caratteristiche cliniche dei pazienti con dMMR CRC che hanno ricevuto inibitori del checkpoint immunitario (ICI). Lo studio ha rilevato che i tassi di risposta globale (ORR) nei gruppi MLH1 ± PMS2 e MSH2 ±MSH6 erano rispettivamente del 68% e del 57,1%, senza differenze statistiche. Ciò suggerisce che l'analisi dell'espressione genica MLH1 potrebbe essere uno strumento prezioso per prevedere la risposta alla terapia ICI nei pazienti con CRC dMMR44. Sono necessarie ulteriori ricerche per convalidare il ruolo dell'analisi dell'espressione genica MLH1 nella gestione del CRC e per integrarla nella pratica clinica.

Considerando l'importanza e il ruolo chiave del gene MLH1 nella riparazione delle incongruenze del DNA e in accordo con i risultati di studi precedenti, si può concludere che il cancro del colon-retto è correlato alla diminuzione dell'espressione del gene MLH1 . Pertanto, con la riduzione dell'espressione genica, non c'è possibilità di correggere il ciclo difettoso di replicazione e il rischio di creare una mutazione aumenterà; Pertanto, questa diminuzione dell'espressione genica svolgerà un ruolo importante nel processo di sviluppo della malattia, nel trattamento e nell'esito finale della malattia per le persone.

I risultati hanno mostrato che la riduzione dell'espressione genica di MLH1 ha un ruolo efficace nello sviluppo del cancro del colon-retto. Ma il punto dell'importanza di questo gene è il suo ruolo negli stadi del cancro, che riduce l'espressione genica in ogni stadio della malattia. Pertanto, questo gene può essere considerato maggiormente in studi futuri; Perché c'è la possibilità che in futuro possa svolgere un ruolo efficace nel migliorare lo stato di trattamento del cancro del colon-retto. Inoltre, sembra necessario condurre ulteriori studi per scoprire altri aspetti.

I passaggi critici all'interno del protocollo includono il rigoroso rispetto delle procedure di estrazione e purificazione dell'RNA, poiché la qualità dell'RNA è fondamentale per un'analisi accurata dell'espressione genica. Inoltre, la configurazione della PCR in tempo reale e le condizioni specifiche del ciclo sono fondamentali per un'amplificazione e una quantificazione affidabili del gene MLH1 . Le modifiche e la risoluzione dei problemi della tecnica sono state affrontate durante lo studio. Ad esempio, quando inizialmente è stata riscontrata una purezza dell'RNA non ottimale, come indicato dalle misurazioni dello spettrofotometro, il protocollo di estrazione è stato perfezionato per includere ulteriori fasi di lavaggio per rimuovere potenziali contaminanti. I limiti della tecnica includono la dipendenza dal sangue periferico, che potrebbe non rappresentare completamente i livelli di espressione di MLH1 all'interno del microambiente tumorale.

In questo studio, abbiamo analizzato l'espressione del gene MLH1 in campioni di sangue periferico di 36 pazienti con cancro del colon-retto. Riconosciamo che questa dimensione del campione è limitata, il che potrebbe influenzare la potenza statistica dei nostri risultati. Studi futuri con coorti più ampie sono garantiti per convalidare i nostri risultati e per comprendere meglio il ruolo dell'espressione di MLH1 nel cancro del colon-retto. Inoltre, il metodo di campionamento per convenienza può introdurre bias di selezione, influenzando potenzialmente la generalizzabilità dei risultati.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Vorremmo esprimere la nostra gratitudine e il nostro apprezzamento a tutti coloro che ci hanno aiutato a completare questa impresa di ricerca.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Attrezzatura per elettroforesi su gel di agarosioBio-RadMini-Sub Cell GTUtilizzato per controllare la qualità dell'RNA
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)Sigma-AldrichE9884Utilizzato come anticoagulante per campioni di sangue
Spettrofotometro NanoDropThermoFisher ScientificND-2000utilizzato per determinare la purezza dell'RNA
Macchina per PCR in tempo realeApplicata BiosystemsA34322Utilizzato per reazioni RT-PCR
Kit di estrazione dell'RNAIntron Biotechnology Co#Cat 17061Utilizzato per l'estrazione di RNA da campioni di sangue
Kit SYBR Green PCRThermo Fisher Scientific4309155Reagenti utilizzati per esperimenti RT-PCR
Sistemi

Riferimenti

  1. Favoriti, P., et al. Worldwide burden of colorectal cancer: a review. Updates Surg. 68 (1), 7-11 (2016).
  2. Lotfollahzadeh, S., Recio-Boiles, A., Cagir, B. Colon cancer. StatPearls. , (2024).
  3. Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Prz Gastroenterol. 14 (2), 89-103 (2019).
  4. Woischke, C., Michl, M., Neumann, J. Molecular pathology of colorectal cancer. Pathologie. 44 (5), 279-286 (2023).
  5. Lachit, K., Vinita, P. Study of mismatch repair protein expression by using immunohistochemistry in various carcinomas with special reference to colorectal adenocarcinomas-at a tertiary referral laboratory in India. Asian Pacific J Cancer Biol. 7 (4), 341-347 (2022).
  6. Cerretelli, G., Ager, A., Arends, M. J., Frayling, I. M. Molecular pathology of Lynch syndrome. J Pathol. 250 (5), 518-531 (2020).
  7. Tiwari, A. K., Roy, H. K., Lynch, H. T. Lynch syndrome in the 21st century: clinical perspectives. QJM. 109 (3), 151-158 (2016).
  8. Hinrichsen, I., et al. Reduced migration of MLH1 deficient colon cancer cells depends on SPTAN1. Mol Cancer. 13 (1), 1-12 (2014).
  9. Nissar, B., Shah, I. A., ul Afshan, F., Ganai, B. A. A decade in unravelling the etiology of gastric carcinogenesis in Kashmir, India - A high risk region. Gene Rep. 21 (1), 100832(2020).
  10. Reyes, G. X., Schmidt, T. T., Kolodner, R. D., Hombauer, H. New insights into the mechanism of DNA mismatch repair. Chromosoma. 124 (4), 443-462 (2015).
  11. Rogacheva, M. V., et al. Mlh1-Mlh3, a meiotic crossover and DNA mismatch repair factor, is a Msh2-Msh3-stimulated endonuclease. J Biol Chem. 289 (9), 5664-5673 (2014).
  12. Martin, S. A. The DNA mismatch repair pathway. DNA Repair Cancer Ther. , 151-177 (2016).
  13. Fukuhara, S., et al. DNA mismatch repair gene MLH1 induces apoptosis in prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (22), 11297-11307 (2014).
  14. Boland, C. R., Goel, A., Patel, S. G. The genetic and epigenetic landscape of early-onset colorectal cancer. Colorectal Cancer. 9 (3), CRC23 (2020).
  15. Özdemir, Z., et al. Uncommon variants detected via hereditary cancer panel and suggestions for genetic counseling. Mutat Res. 827, 111831(2023).
  16. Sinicrope, F. A. Lynch syndrome-associated colorectal cancer. New Engl J Med. 379 (8), 764-773 (2018).
  17. Westwood, A., et al. Additional loss of MSH2 and MSH6 expression in sporadic deficient mismatch repair colorectal cancer due to MLH1 promoter hypermethylation. J Clin Pathol. 72 (6), 443-447 (2019).
  18. Chung, C. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in colorectal cancer: A 2021 update on current development, evidence, and recommendation. J Oncol Pharm Pract. 28 (4), 850-869 (2022).
  19. Yu, H., et al. The mRNA level of MLH1 in peripheral blood is a biomarker for the diagnosis of hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Am J Cancer Res. 6 (5), 1135-1140 (2016).
  20. Kasprzak, A. Prognostic biomarkers of cell proliferation in colorectal cancer (CRC): From immunohistochemistry to molecular biology techniques. Cancers. 15 (18), 4570(2023).
  21. Tao, W., Xie, Y. Study on relationship between NILH1 gene 415 locus G→G mutation and sporadic colorectal cancer in Chinese patients. Chinese J Exp Surg. 26 (6), 752-754 (2009).
  22. Martinez, E. C., Zevallos-Delgado, C., Joseph, M. Analysis of the genetic expression of colon cancer genetic biomarkers on inflammatory bowel disease on blood and biopsy samples. Genomics Gene Func. 164, 4 Supplement S49(2023).
  23. Rahiminejad, S., Maurya, M. R., Mukund, K., Subramaniam, S. Modular and mechanistic changes across stages of colorectal cancer. BMC cancer. 22 (1), 436(2022).
  24. Alrushaid, N., Khan, F. A., Al-Suhaimi, E., Elaissari, A. Progress and perspectives in colon cancer pathology, diagnosis, and treatments. Diseases. 11 (4), 148(2023).
  25. Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2ˆ(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostat Bioinfo Biomath. 3 (3), 71-85 (2013).
  26. Jurescu, A., et al. Colorectal carcinomas: Searching for new histological parameters associated with lymph node metastases. Medicina. 59 (10), 1761(2023).
  27. Sawicki, T., et al. A review of colorectal cancer in terms of epidemiology, risk factors, development, symptoms and diagnosis. Cancers. 13 (9), 2025(2021).
  28. Cardoso, R., et al. Overall and stage-specific survival of patients with screen-detected colorectal cancer in European countries: A population-based study in 9 countries. Lancet Reg Health Eur. 21 (1), 100458(2022).
  29. Dekker, E., Tanis, P. J., Vleugels, J. L. A., Kasi, P. M., Wallace, M. B. Colorectal cancer. Lancet. 394 (10207), 1467-1480 (2019).
  30. Hull, M. A., Rees, C. J., Sharp, L., Koo, S. A risk-stratified approach to colorectal cancer prevention and diagnosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 17 (12), 773-780 (2020).
  31. Hossain, M. S., et al. Colorectal cancer: A review of carcinogenesis, global epidemiology, current challenges, risk factors, preventive and treatment strategies. Cancers. 14 (7), 1732(2022).
  32. Guyot D'Asnières De Salins, A., et al. Discordance between immunochemistry of mismatch repair proteins and molecular testing of microsatellite instability in colorectal cancer. ESMO open. 6 (3), 100120(2021).
  33. Chen, W., Swanson, B. J., Frankel, W. L. Molecular genetics of microsatellite-unstable colorectal cancer for pathologists. Diagn Pathol. 12 (1), 24(2017).
  34. Li, J., et al. Role of MLH1 methylation in esophageal cancer carcinogenesis and its clinical significance. Onco Targets Ther. 11 (1), 651-663 (2018).
  35. Iyer, R. R., Pluciennik, A. DNA mismatch repair and its role in Huntington's disease. J Huntingtons Dis. 10 (1), 75-94 (2021).
  36. Rebuzzi, F., Ulivi, P., Tedaldi, G. Genetic predisposition to colorectal cancer: How many and which genes to test. Int J Mol Sci. 24 (3), 2137(2023).
  37. Guo, L., Yu, Z., Li, Q., Liang, X., Yang, L. Correlation of MLH1 and MSH2 levels with clinicopathologic characteristics in colorectal cancer. Am J Transl Res. 15 (2), 1107-1116 (2023).
  38. Liu, Y., Yang, C., Li, W., Zhang, S., Li, L. Analysis of association of MLH1 and PMS2 gene expression with clinicopathological features in elderly patients with colorectal cancer. Chinese J Geriatrics. 1 (12), 927-930 (2020).
  39. Salem, M. E., et al. Molecular analyses of left- and right-sided tumors in adolescents and young adults with colorectal cancer. Oncologist. 25 (5), 404-413 (2020).
  40. Goshayeshi, L., et al. Prevalence and clinicopathological characteristics of mismatch repair-deficient colorectal carcinoma in early onset cases as compared with late-onset cases: a retrospective cross-sectional study in Northeastern Iran. BMJ open. 8 (8), e023102(2018).
  41. Zaborowski, A. M., et al. Clinicopathological features and oncological outcomes of patients with young-onset rectal cancer. Br J Surg. 107 (5), 606-612 (2020).
  42. Paredes, S. R., Chan, C., Rickard, M. Immunohistochemistry in screening for heritable colorectal cancer: what to do with an abnormal result. ANZ J Surg. 90 (5), 702-707 (2020).
  43. Anvari, A. H., Ganji, S. M., Movahhed, T. K. Cellular MLH1 gene expression and pathologic factors in Iranian patients with colorectal cancer. Qom Univ Med Sci J. 14 (8), 62-70 (2020).
  44. Sahin, I. H., et al. Analysis of age, tumor-sidedness, and mismatch repair (MMR) genes with response to immune checkpoint inhibitors (ICIs) in MMR-deficient (dMMR) colorectal cancer (CRC) patients (pts): A multi-institutional study. J Clinl Oncol. 37 (15), e15029(2019).

Ristampe e permessi

Tag

Cancro colorettalePCR in tempo realeAnalisi dell'espressione genicaInvasione tumoraleInvasione linfonodaleEstrazione di RNASintesi del cDNA

Questo articolo è stato pubblicato

Video in arrivo

Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.