Articolo metodologico

Applicazione della ricerca dell'onda d'urto indotta da laser per lo studio della lesione cocleare indotta da esplosione

DOI:

10.3791/66396

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1 marzo 2024

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1Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, National Defense Medical College, 2Division of Bioinformation and Therapeutic Systems, National Defense Medical College, 3Department of Biochemistry, National Defense Medical College

In questo articolo

Sommario

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Qui, descriviamo i protocolli sperimentali per la creazione di un modello animale di lesione cocleare indotta da esplosione utilizzando onde d'urto indotte da laser (LISW). L'esposizione dell'osso temporale alla LISW consente la riproduzione della fisiopatologia cocleare indotta da blasti. Questo modello animale potrebbe essere una piattaforma per chiarire la patologia cocleare ed esplorare potenziali trattamenti per le lesioni da esplosione.

Abstract

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L'orecchio è l'organo più suscettibile alla sovrapressione da esplosione e le lesioni cocleari si verificano frequentemente dopo l'esposizione all'esplosione. L'esposizione all'esplosione può portare alla perdita dell'udito neurosensoriale (SNHL), che è una perdita dell'udito irreversibile che influisce negativamente sulla qualità della vita. In precedenza sono state documentate patologie cocleari dettagliate indotte da blasti, come la perdita di cellule ciliate, neuroni gangliari spirali, sinapsi cocleari e interruzione delle stereociglia. Tuttavia, determinare il deterioramento neurosensoriale cocleare dopo una lesione da esplosione è difficile perché gli animali esposti alla sovrapressione dell'esplosione di solito sperimentano la perforazione della membrana timpanica (TMP), che causa una concomitante perdita dell'udito conduttiva. Per valutare la disfunzione cocleare neurosensoriale pura, abbiamo sviluppato un modello animale sperimentale di lesione cocleare indotta da blasti utilizzando un'onda d'urto indotta da laser. Questo metodo evita la TMP e le lesioni sistemiche concomitanti e riproduce il declino funzionale della componente SNHL in modo dipendente dall'energia dopo l'esposizione a LISW. Questo modello animale potrebbe essere una piattaforma per chiarire i meccanismi patologici ed esplorare potenziali trattamenti per la disfunzione cocleare indotta da blasti.

Introduzione

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La perdita dell'udito e l'acufene sono tra le disabilità più diffuse, riportate fino al 62% dei veterani1. Diverse complicanze uditive indotte da blasti, tra cui la perdita dell'udito neurosensoriale (SNHL) e la perforazione della membrana timpanica (TMP), sono state riportate in individui esposti a sovrapressione blastica2. Inoltre, la ricerca su individui esposti a esplosioni suggerisce che l'esposizione alle esplosioni provoca spesso difetti nella risoluzione temporale uditiva, anche quando le soglie uditive rientrano nell'intervallo normale, il che è noto come "perdita dell'udito nascosta (HHL)"3. È ben noto che esiste una sostanziale perdita di sinapsi cocleari tra le cellule ciliate interne (IHC) e i neuroni uditivi (AN) nella patologia cocleare blasto-correlata4. La degenerazione sinaptica provoca una compromissione dell'elaborazione uditiva ed è un fattore importante che contribuisce allo sviluppo di HHL5. Pertanto, gli organi uditivi sono componenti fragili contenenti strutture complesse e altamente organizzate. Tuttavia, il meccanismo preciso con cui le onde d'urto influenzano l'orecchio interno a livello cellulare rimane poco chiaro. Ciò è dovuto alle sfide nel replicare le precise complessità cliniche e meccaniche delle lesioni da esplosione in ambienti di laboratorio e alla complessità delle patologie cocleari indotte da esplosione.

La componente principale di una lesione da esplosione è l'onda d'urto (SW), caratterizzata da un rapido ed elevato aumento della pressione di picco6. La complessità delle lesioni da esplosione è stata ampiamente studiata in numerosi studi retrospettivi 7,8,9. Esistono vari dispositivi per la generazione di esplosioni, come il gas compresso10, i tubi d'urto11 e gli esplosivi di piccola magnitudo12, a diversi livelli di pressione. La forma d'onda della pressione del SW generata da dispositivi di recente sviluppo assomigliava molto a quella di una vera esplosione. Un concetto importante nella creazione di un modello animale di ipoacusia neurosensoriale indotta da blasti è quello di ridurre al minimo le lesioni concomitanti, diverse dal danno uditivo, per ridurre la morte degli animali. Pertanto, sono stati sviluppati studi sulle lesioni da esplosione in cui i tubi d'urto sono stati miniaturizzati e l'uscita può essere controllata con precisione in modo che gli animali esposti muoiano raramente. Tuttavia, sebbene questi modelli animali di solito sviluppino complicanze, come la TMP, la valutazione della funzione cocleare è difficile a causa della concomitante perdita dell'udito conduttiva2. In precedenza abbiamo condotto uno studio su animali protetti per l'udito sulle lesioni da esplosione utilizzando tappi per le orecchie e non abbiamo riscontrato alcuna incidenza di TMP13. I tappi per le orecchie potrebbero attenuare parzialmente il grave danno cocleare, ma non la neurodegenerazione uditiva centrale o lo sviluppo dell'acufene. Pertanto, i tappi per le orecchie proteggono le coclee e la membrana timpanica. Tuttavia, per studiare la fisiopatologia cocleare causata dalle lesioni da esplosione è necessario un modello animale di danno cocleare puro indotto da blast senza TMP.

In precedenza abbiamo sviluppato un modello topico di lesione da esplosione dell'orecchio interno in ratti e topi utilizzando un'onda d'urto indotta da laser (LISW)14,15. Questo metodo può essere eseguito in modo sicuro e semplice a livello di laboratorio standard ed è stato utilizzato per generare modelli di lesioni da esplosione polmonare e alla testa16,17. L'energia del LISW può essere regolata modificando il tipo e la potenza del laser, consentendo il controllo del grado di danno cocleare. Il modello di lesione cocleare indotta da LISW è prezioso per studiare i meccanismi della SNHL causata da lesioni da esplosione e per studiare potenziali trattamenti. In questo studio, descriviamo protocolli sperimentali dettagliati per la creazione di un modello murino di danno cocleare indotto da blasti utilizzando LISW e dimostriamo la degenerazione cocleare, inclusa la perdita di cellule ciliate (HC), sinapsi cocleari e neuroni gangliari spirali (SGN), in modo dipendente dall'energia nei topi dopo l'esposizione a LISW.

Protocollo

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Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali del National Defense Medical College (approvazione #18050) ed eseguite in conformità con le linee guida del National Institutes of Health e del Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia del Giappone. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo il numero di animali e la loro sofferenza.

1. Animali

  1. Usa topi maschi CBA/J di 8 settimane per seguire questo protocollo. Prima dell'esperimento, sottoporre i topi a un test di funzionalità uditiva e all'osservazione endoscopica della membrana timpanica per garantire la normalità.
  2. Dividere 27 topi CBA/J in tre gruppi: (1) 2,0 J/cm2 gruppo esposto (n = 9 topi); (2) 2,25 J/cm2 gruppo esposto (n = 9 topi); e (3) 2,5 J/cm2 gruppo esposto (n = 9 topi). Rimuovere tutte le orecchie per la valutazione 1 mese dopo l'esposizione alla LISW.

2. Impostazioni sperimentali dell'esposizione a LISW

  1. Il bersaglio laser è un disco di gomma naturale nera, di 10 mm di diametro e 0,5 mm di spessore. Per aumentare l'impulso LISW, utilizzare un adesivo per saldatura a base di resina acrilica per incollare un foglio di polietilene tereftalato (PET) trasparente di 1,0 mm di spessore alla parte superiore dell'area target. Irradiare un laser Nd:YAG Q-switched da 532 nm per generare il LISW dietro il bersaglio (Figura 1A).
  2. Focalizzare l'impulso laser con una lente piano-convessa su un punto di 3,0 mm di diametro sul bersaglio laser.
  3. Utilizzare l'irradiazione LISW per generare plasma sulla superficie di legame dei due materiali e vaporizzare la gomma (ablazione mediata dal plasma), lasciando la gomma vaporizzata nella cavità.
  4. Utilizzare un idrofono per misurare l'onda di pressione di LISW a 1,0 mm sott'acqua, non nei tessuti viventi. Posizionare un idrofono a fibra ottica di 0,25 mm di diametro sotto la gomma nera 1,0 mm sotto la superficie dell'acqua per registrare le forme d'onda della pressione LISW e misurarle utilizzando un oscilloscopio digitale.
    NOTA: Le forme d'onda della pressione hanno mostrato caratteristiche stabili con pressione massima e impulso simili a quelli mostrati nella Figura 1B.
  5. Eseguire tutte le procedure sugli animali in anestesia generale utilizzando iniezioni intraperitoneali di 1 mg/kg di medetomidina cloridrato e 75 mg/kg di ketamina. Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi del topo per prevenire l'essiccazione e fornire supporto al calore.
  6. Radere accuratamente le regioni postauricolari per evitare di trattenere l'aria intrappolata nel pelo. Fissare i topi su una piastra e posizionare le regioni postauricolari nell'area focale del LISW in direzione verticale verso l'alto.
  7. Fissare un bersaglio di gomma nera per via percutanea alla regione postauricolare dell'orecchio del topo. Per garantire l'adattamento dell'impedenza acustica, utilizzare un gel conduttivo a ultrasuoni tra il bersaglio laser e la superficie della pelle.
  8. Applicare un singolo impulso LISW alla coclea attraverso l'osso temporale. Impostare le uscite degli impulsi laser su tre densità di energia: 2,0 J/cm2 , 2,25 J/cm2 e 2,5 J/cm2.

3. Test di funzionalità cocleare

NOTA: I test di risposta uditiva del tronco encefalico (ABR) sono stati eseguiti come precedentemente riportato14,15.

  1. Eseguire la misurazione ABR 1 giorno prima e 1 giorno e 1 mese dopo l'esposizione a LISW.
  2. L'ABR è un potenziale evocato uditivo in risposta a stimoli uditivi ed è comunemente usato per valutare le soglie uditive a quattro frequenze (12,0 kHz, 16,0 kHz, 20,0 kHz e 24,0 kHz).
  3. Presenta il suono di stimolazione su un piccolo auricolare e misura il livello di pressione sonora vicino alla membrana timpanica del mouse utilizzando un piccolo microfono posizionato vicino all'auricolare. Emette stimoli di raffica da un generatore di suoni a 37 cicli/s e amplifica la pressione sonora da un livello di pressione sonora (SPL) di 20 dB a 80 dB SPL in incrementi di 5 dB SPL.
  4. Inserire un elettrodo ad ago in acciaio inossidabile per la registrazione dell'elettroencefalogramma sotto il condotto uditivo e la regione frontale dell'orecchio e inserire un elettrodo di terra sotto la regione caudale della coda.
  5. Valutare le funzioni cocleari misurando l'ampiezza del picco ABR I (P1). Analizza automaticamente le forme d'onda ABR rispetto alle soglie uditive e all'ampiezza ABR P1 utilizzando il software di analisi dei picchi ABR come precedentemente riportato18.
  6. Calcola gli spostamenti della soglia ABR sottraendo le soglie ottenute prima dell'esposizione. Confrontare gli spostamenti della soglia ABR nei tre gruppi esposti con quelli delle orecchie controlaterali non esposte (controllo). Misurare le ampiezze ABR utilizzando la forma d'onda ABR durante la stimolazione SPL di 80 dB.

4. Valutazione istologica

NOTA: La valutazione istologica è stata eseguita come precedentemente descritto14,15.

  1. HC e sinapsi cocleare
    1. Eseguire l'esame patologico della coclea 1 mese dopo l'esposizione a LISW.
    2. Confermare la profondità dell'anestesia pizzicando le dita dei piedi prima della perfusione. Dopo emoperfusione con soluzione di Ringer lattato, eseguire la perfusione transcardiaca con 1 mL/g di paraformaldeide al 4% (PFA). Dopo la decapitazione, rimuovere la coclea e perfondere direttamente con PFA al 4%, quindi fissare a 4 °C per una notte.
    3. Dopo la fissazione, decalcificare la coclea agitando in una soluzione di acido etilendiamminetraacetico (EDTA) 0,5 mol/L per 2 giorni.
    4. Dividete la coclea demineralizzata in quattro pezzi. Dopo aver congelato ogni pezzo di coclea su ghiaccio secco per 10 minuti, eseguire il blocco a temperatura ambiente per 1 ora in siero di cavallo normale al 5% semplicemente coniugato con Triton X allo 0,3% per la permeabilizzazione.
    5. Utilizzare anticorpi anti-miosina 7a (Myo7A), proteina legante anti-C-terminale (CtBP2) e anti-neurofilamenti (NF) come anticorpi primari e incubati a 37 °C durante la notte. Utilizzare gli anticorpi Myo7A, CtBP2 e NF per valutare rispettivamente HC, nastri presinaptici e fibre nervose cocleari.
    6. Lavare via l'anticorpo primario non legato con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 5 x 3 minuti. Incubare i campioni con gli anticorpi secondari appropriati a 37 °C per 2 ore. Dopo la colorazione, lavare i campioni per 3 x 5 minuti con PBS e incapsulare i campioni sul vetrino con un incapsulante solubile in acqua utilizzando un vetro di copertura.
    7. Per la valutazione, acquisire l'intera immagine della coclea (divisa in quattro parti) con un ingrandimento di 10x e calcolare la mappa delle frequenze cocleari utilizzando il plug-in software ImageJ di riferimento per localizzare con precisione le specifiche regioni cocleari a 12,0 kHz, 16,0 kHz, 20,0 kHz e 24,0 kHz.
    8. Calcola i tassi di sopravvivenza dell'HC e il numero di sinapsi ad ogni frequenza.
      1. Per calcolare i tassi di sopravvivenza dell'HC, contare il numero di HC sopravvissuti e mancanti per 200 μm di lunghezza a ciascuna frequenza e calcolare il tasso di sopravvivenza degli HC utilizzando l'equazione (1) mostrata di seguito:
        Tasso di sopravvivenza dell'HC (%) = (Numero di HC sopravvissuti / Numero di HC sopravvissuti e mancanti) × 100 (1)
      2. Per calcolare il numero di sinapsi, ottenere immagini z-stack ad alta risoluzione dell'area HC interna utilizzando un obiettivo a immersione in olio (63×) con zoom digitale 3,1x e passo di 0,25 μm al microscopio a fluorescenza confocale. Importa le pile di immagini in ImageJ e conta automaticamente i punti CtBP2 per IHC entro un intervallo di 50 μm in ogni pila di immagini. Calcola il tasso di sopravvivenza dei nastri sinaptici utilizzando l'equazione (2):
        Tasso di sopravvivenza dei nastri sinaptici (%) = (Numero di nastri sinaptici nelle orecchie esposte a LISW / Numero di nastri sinaptici nelle orecchie di controllo) × 100 (2)
    9. Per la microscopia elettronica a scansione (SEM), rimuovere la coclea, come descritto in precedenza, e quindi fissare con PFA al 2% e glutaraldeide al 2,5% insieme a 4 °C durante la notte. Dopo la decalcificazione della coclea mediante agitazione in una soluzione di EDTA 0,5 mol/L a 4 °C per 7 giorni, sezionare la coclea in quattro pezzi per la preparazione a montatura intera.
    10. Fissare i tessuti con tetrossido di osmio all'1% a 4 °C per 30 minuti, disidratare in etanolo al 50% a temperatura ambiente per 10 minuti, ripetere con etanolo al 70%, 80%, 95% e poi al 100%, rivestire con osmio ed esaminare al microscopio elettronico a 5,0 kV, come riportato in precedenza14.
    11. Condurre un'analisi quantitativa della rottura del fascio stereociliare nelle cellule ciliate esterne (OHC) calcolando il rapporto tra stereociglia interrotte (numero di stereociglia OHC interrotte/numero totale di stereociglia OHC) in ciascun gruppo energetico utilizzando le immagini SEM14. Conta il numero di stereociglia per 100 μm al centro delle regioni di 16,0 e 24,0 kHz. Designare una o più file di fasci OHC piegati verso il lato laterale, aggrovigliati o privi della base come interrotti.
  2. Reti SGN
    1. Per valutare quantitativamente il numero di SGN a 1 mese dall'esposizione a LISW, eseguire la perfusione transcardiaca con PBS al 4%, decapitare, rimuovere la coclea ed eseguire la fissazione posteriore nelle stesse condizioni sopra descritte. Decalcificare la coclea in EDTA 0,5 M per 1 settimana.
    2. Dopo la decalcificazione, immergere le coclee in saccarosio al 30% per una notte, incorporarle nel composto di criosezione, congelarle in azoto liquido per preparare sezioni vicino al canale di Rosenthal a uno spessore di 15 μm, colorare con ematossilina ed eosina e visualizzarle al microscopio ottico14.
    3. Per la misurazione della densità SGN, contare il numero di SGN nella curva centrale del canale di Rosenthal e calcolare la sopravvivenza SGN per controllo.

5. Analisi statistica

  1. Esegui analisi statistiche utilizzando il software che preferisci.
  2. Analizza le differenze statistiche nello spostamento della soglia ABR, HC, SGN e conta sinaptica utilizzando l'ANOVA a due vie a misure ripetute ["frequenza o parti cocleari (apicali/medie/base)" × "gruppi animali"], l'analisi bidirezionale della varianza (ANOVA), seguita dal test di confronto multiplo post-hoc di Tukey.
  3. Presenta tutti i dati come media ± errore standard e imposta il livello di significatività statistica a p < 0,05.

Risultati

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Forma d'onda LISW
La riproducibilità della forma d'onda della pressione LISW è stata misurata 5x a 2,0 J/cm2 come segue. Le forme d'onda erano generalmente simili e stabili e mostravano un forte aumento con l'ampiezza del tempo, la pressione di picco e l'impulso di 0,43±0,4 μs, 92,1 ± 6,8 MPa e 14,1 ± 1,9 Pa's (mediana ± SD), che corrisponde alle caratteristiche SW (Figura 1B). I LISW sono caratterizzati da un tempo di salita rapido, un'elevata pressione di picco, una breve durata e una dominanza della pressione positiva. Quando applicato al tessuto biologico, il bersaglio viene posizionato direttamente sul tessuto vivente attraverso la gelatina e si può considerare che il SW abbia quasi le stesse caratteristiche del SW misurato applicato al tessuto. Dopo l'esposizione a LISW, l'insorgenza di TMP è stata valutata utilizzando un piccolo endoscopio digitale. Nessuno dei topi nel gruppo energetico LISW ha mostrato TMP dopo l'esposizione (Figura 1C).

Valutazione uditiva
È stato eseguito un esame ABR per determinare la funzione uditiva. ABR è una misura del potenziale evocato dal suono nella via uditiva e ABR P1 rappresenta l'attività neurale accumulata nel nervo cocleare. Un giorno dopo l'esposizione alla LISW, l'orecchio esposto ha mostrato una differenza significativa nello spostamento della soglia ABR tra i diversi gruppi LISW (ANOVA a due vie, p < 0,0001; Figura 2A). Questo aumento dello spostamento della soglia ABR è persistito fino a 1 mese dopo l'esposizione a LISW nei gruppi 2,25 e 2,5 J/cm2 (ANOVA a due vie, 2,25 J/cm2, p < 0,0001; 2,5 J/cm2, p < 0,0001). In particolare, la regione ad alta frequenza ha mostrato un notevole aumento dello spostamento della soglia ABR. Tuttavia, le soglie ABR hanno recuperato a un livello che non era significativamente diverso dalla preirradiazione nel gruppo 2,0 J (ANOVA a due vie, 2,0 J/cm2, p = 0,76), indicando che l'elevazione della soglia era dipendente dall'energia. Per quanto riguarda le ampiezze ABR P1, tutti i gruppi irradiati con LISW hanno mostrato una diminuzione significativa delle ampiezze ABR P1 a tutte le frequenze 1 giorno e 1 mese dopo l'esposizione a LISW (ANOVA a due vie, p < 0,0001; Figura 2B). L'orecchio non esposto (controllo; orecchio sinistro) non ha mostrato alterazioni evidenti nella soglia uditiva ABR dopo l'esposizione a LISW (dati non mostrati).

Sopravvivenza di HC e SGN
L'osservazione microscopica delle orecchie esposte a LISW non ha rivelato danni meccanici alle coclee, come frattura e lussazione degli ossicini, rottura della membrana della finestra rotonda o emorragia intracocleare, a seguito di esposizione a LISW (dati non mostrati), il che è coerente con i risultati precedenti 6,14.

L'immunocolorazione fluorescente di HC con Myo7A, nastri sinaptici con CtBP2 e nervo cocleare con NF è mostrata nella Figura 3A. In nessuno dei gruppi è stato osservato alcun danno cocleare grave, come la perdita di HC o fibre nervose. Tuttavia, la valutazione quantitativa della sopravvivenza delle OHC positive per Myo7A differiva significativamente tra i gruppi (ANOVA a due vie, p = 0,002; Figura 3B). Il gruppo 2,5 J/cm2 ha mostrato tassi di sopravvivenza significativamente più bassi di OHC rispetto al gruppo di controllo, specialmente nella regione ad alta frequenza (ANOVA a due vie, 2,5 J/cm2, p = 0,0002). Tuttavia, i tassi di sopravvivenza delle IHC erano comparabili tra i gruppi, indicando che le OHC sono vulnerabili alla LISW ad alta energia (ANOVA a due vie, p = 0,76). Una valutazione quantitativa della sopravvivenza del nastro sinaptico è mostrata nella Figura 3C. I nastri sinaptici erano significativamente ridotti in entrambi i gruppi 2,25 e 2,5 J/cm2 rispetto al controllo (ANOVA a due vie, 2,25 J/cm2, p < 0,0001; 2,5 J/cm2, p < 0,0001), e le frequenze più alte mostravano una tendenza più forte a diminuire, simile a quella dello spostamento della soglia ABR e della sopravvivenza OHC.

Successivamente, è stata valutata la densità SGN, come mostrato nella Figura 3D. C'era una differenza significativa nella densità di SGN tra i gruppi (ANOVA a due vie, p = 0,76) e il gruppo 2,5 J/cm2 ha mostrato tassi di sopravvivenza di SGN significativamente più bassi rispetto ai gruppi di controllo (ANOVA a due vie, 2,5 J/cm2, p = 0,007). Tuttavia, i gruppi 2,0 e 2,25 J/cm2 hanno mostrato una sopravvivenza SGN comparabile rispetto ai controlli. Questo risultato indica che la gravità della degenerazione cocleare e della disfunzione uditiva dipende dall'esposizione all'energia LISW, che è coerente con i risultati di sopravvivenza ABR e HC.

Fascio stereociliare
Abbiamo osservato un notevole aumento della soglia ABR, circa 30 dB, in entrambi i gruppi 2,25 e 2,5 J/cm2 a frequenze superiori a 20 kHz, che persisteva fino a 1 mese dopo l'esposizione a LISW (come mostrato nella Figura 2A). Tuttavia, lo spostamento della soglia di 30 dB che abbiamo osservato non può essere attribuito esclusivamente alla perdita di OHC, alla degenerazione delle sinapsi cocleari o a un numero ridotto di SGC (Figura 3). Uno studio precedente ha indicato che gli spostamenti della soglia ABR erano minimi quando il numero di nastri sinaptici diminuiva del 50%19. Pertanto, abbiamo eseguito il SEM per indagare la causa dell'innalzamento della soglia ABR. A seguito di esposizione a LISW a un'intensità di 2,5 J/cm2, alcuni fasci stereociliari di OHC sembravano essere interrotti, in particolare nelle regioni ad alta frequenza (Figura 4A), il che potrebbe essere una delle cause dell'aumento della soglia ABR a seguito di esposizione a LISW. La valutazione quantitativa della disgregazione stereociliare ha rivelato che il rapporto di disgregazione tendeva ad essere più alto nella regione di frequenza più alta in modo dipendente dall'energia (Figura 4B).

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Figura 1: Impostazioni sperimentali e profilo di pressione di LISW. (A) Configurazione sperimentale per la generazione di LISW negli animali. (B) Caratteristiche delle forme d'onda di pressione LISW impostate a 2,0 J/cm2. (C) Immagini rappresentative della membrana timpanica. I TMP non sono stati osservati in nessuna delle orecchie esposte a LISW. Come riferimento, il TMP (punte di freccia gialle) indotte da esplosioni rappresentative viene mostrato utilizzando un tubo di sabbiatura. Abbreviazioni: LISW = onda d'urto indotta dal laser; PET = polietilene tereftalato; TMP = perforazione della membrana timpanica; YAG = granato ittrio e alluminio; SHG = seconda generazione armonica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Risultati dell'ABR dopo l'esposizione alla LISW. (A) Variazioni significative della soglia dell'ABR sono state osservate in tutti i gruppi 1 giorno dopo l'esposizione alla LISW. Gli spostamenti della soglia ABR nei gruppi 2,25 e 2,5 J/cm2 sono rimasti significativamente elevati fino a 1 mese dopo l'esposizione a LISW. (B) L'ampiezza dell'ABR P1 1 giorno e 1 mese dopo l'esposizione a LISW è diminuita significativamente in tutti i gruppi. Gli asterischi indicano differenze significative tra i gruppi rispetto ai valori di preesposizione (**p < 0,001, ****p < 0,0001). Le barre di errore indicano l'errore standard della media. Abbreviazioni: ABR = risposta uditiva del tronco encefalico; LISW = onda d'urto indotta da laser; P1 = picco 1; SPL = livello di pressione sonora. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Patologia cocleare dopo l'esposizione a LISW. (A) Immagini a fluorescenza confocale dell'organo di Corti nella regione dei 20 kHz colorate con Myo7A (blu), CtBP2 (rosso) e NF (verde) dopo l'esposizione a LISW. (B) Le percentuali medie di HC sopravvissute sono mostrate nei citococleogrammi. La valutazione quantitativa ha rivelato una perdita significativa di OHC a 2,5 J/cm2, sebbene non vi fosse alcuna differenza significativa nella sopravvivenza dell'IHC tra i gruppi. (C) Il tasso di sopravvivenza dei nastri presinaptici rispetto ai valori pre-esposizione è stato significativamente diminuito nei gruppi 2,25 e 2,5 J/cm2 . (D) Micrografie fotografiche rappresentative di SGN in tutti i gruppi 1 mese dopo l'esposizione a LISW. Il tasso di sopravvivenza SGN è diminuito significativamente a 2,5 J/cm2. Gli asterischi indicano differenze significative rispetto ai valori pre-esposizione (**p < 0,001, ****p < 0,0001). Le barre di errore indicano l'errore standard della media. Barre di scala = 5 μm (A), 100 μm (D). Abbreviazioni: LISW = onda d'urto indotta dal laser; IHC = cellula ciliata interna; NF = neurofilamento; OHC = cellula ciliata esterna; SGN = neurone ganglio spirale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Strutture superficiali delle OHC. (A) Immagini rappresentative al microscopio elettronico a scansione delle stereociglia OHC nelle regioni di 16 kHz e 24 kHz dell'organo di Corti un mese dopo l'esposizione a LISW. La disgregazione stereociliare si osserva nelle immagini ingrandite dell'area scatolata nel gruppo 2,5 J/cm2 (area 24 kHz). Barra della scala -= 2 μm. (B) Il tasso di interruzione stereociliare era più alto con un aumento della sovrapressione LISW. Abbreviazioni: LISW = onda d'urto indotta dal laser; OHC = cellule ciliate esterne. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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Questo studio mirava a convalidare un modello murino di danno cocleare indotto da blasti utilizzando LISW. I nostri risultati hanno dimostrato che in seguito all'applicazione di LISW attraverso l'osso temporale, l'orecchio esposto dei topi mostrava un costante declino patologico e fisiologico della coclea, che era accompagnato da un aumento della sovrapressione di LISW. Questi risultati indicano che questo modello murino è appropriato per replicare varie patologie cocleari regolando l'output LISW. In particolare, questo modello murino di disfunzione cocleare indotta da LISW potrebbe fungere da buon modello di lesione cocleare grazie alla sua natura controllata, riproducibile e quantificabile, nonché alla sua capacità di riprodurre il declino cocleare fisiopatologico in condizioni controllate.

Il nostro studio precedente ha utilizzato un modello di ratto e ha osservato la degenerazione cocleare indotta da LISW, tra cui l'aumento delle soglie uditive, la perdita dei nastri sinaptici e la rottura del fascio stereociliare14. Un altro studio ha studiato la degenerazione cocleare fisiopatologica a seguito di lesioni da esplosione nei topi utilizzando due tipi di blasti con caratteristiche diverse: dominante a bassa frequenza utilizzando un tubo di sabbiatura e dominante ad alta frequenza utilizzando LISW15. Hanno determinato che la frequenza dominante dello spettro di potenza dell'esplosione era il fattore principale nel determinare la regione del danno cocleare, come precedentemente riportato15. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo studio a dimostrare la metodologia dettagliata dell'esposizione cocleare LISW e la degenerazione cocleare indotta da LISW dipendente dall'energia e dalla frequenza.

Abbiamo utilizzato l'esposizione alla LISW per danneggiare la coclea attraverso l'osso temporale postauricolare piuttosto che attraverso il canale uditivo esterno per creare un modello che coinvolgesse esclusivamente il danno cocleare senza alcuna TMP o interruzione della catena ossiculare. I nostri risultati implicano che la compromissione dell'udito dimostrata in questo studio era dovuta al deterioramento delle componenti neurosensoriali nel percorso uditivo. Studi recenti hanno indicato che il TMP può fungere da cuscinetto contro i danni alla coclea assorbendo l'energia SW 2,20,21. Questo modello LISW non è stato in grado di indurre TMP, anche con LISW ad alta intensità, perché il SW è stato irradiato direttamente nell'orecchio interno e non attraverso la membrana timpanica. Pertanto, per analizzare l'ipoacusia mista con TMP e SNHL, l'ideale è un'esplosione ad alta intensità generata utilizzando un'esplosione reale o un tubo d'urto. La scelta del tipo di sabbiatura dipende dall'uso specifico o dallo scopo dello studio. Pertanto, questo modello di lesione animale basato su LISW è utile per chiarire la fisiopatologia cocleare indotta da blasti puri senza TMP, con conseguente perdita dell'udito conduttiva. Da un altro punto di vista, l'irradiazione LISW richiedeva 1 ora/animale, compresa l'installazione dell'apparecchiatura e il controllo della membrana timpanica dopo l'irradiazione. Pertanto, se diversi animali sono stati esposti a LISW di seguito entro 1 giorno, è difficile misurare l'irradiazione LISW e l'ABR nello stesso giorno con una singola dose di anestetico. A causa del rischio di morte degli animali quando si aumenta la dose di anestetico, in questo studio, abbiamo deciso di eseguire le misurazioni ABR il giorno successivo, non immediatamente dopo l'irradiazione dello stesso giorno.

Nella lesione da esplosione, la fase primaria è causata dalle forze fisiche dell'esplosione e dalla rapida trasmissione SW con cambiamenti significativi nella densità dei tessuti, come le giunzioni tessuto-aria22. Pertanto, si ritiene che la maggior parte delle lesioni cocleari indotte da blasti derivi dal SW durante la fase6 primaria, suggerendo che gli studi sulle lesioni cocleari esposte al SW sono cruciali per comprendere i meccanismi della disfunzione cocleare indotta da blasti. La creazione di un SW utilizzando un impulso laser ad alta energia su un materiale solido è nota come LISW. Studi precedenti hanno utilizzato LISW per sviluppare modelli animali di lesioni cerebrali e polmonari traumatiche indotte da esplosioni16,17. I vantaggi dell'utilizzo di LISW per gli studi relativi all'esplosione includono il suo modello di danno ripetibile dipendente dall'intensità del laser e il targeting specifico dell'organo ferito perché LISW non influisce su aree al di fuori dell'area bersaglio.

In questo studio, abbiamo scoperto che la LISW provoca cambiamenti patologici negli HC cocleari, nelle SGN, nelle loro sinapsi e nel fascio stereociliare, simili al danno causato da una vera lesione da esplosione12. I danni inflitti da varie forme di insulti cocleari, come la perdita dell'udito indotta dal rumore, possono essere attribuiti a due fattori fondamentali: lo stress meccanico diretto e l'interruzione metabolica secondaria. Proponiamo che la rottura del fascio stereociliare sia la patologia primaria derivante dallo stress meccanico diretto della LISW. I disturbi stereociliari sono patologie comuni associate a disfunzioni uditive legate all'età e indotte dal rumore23,24. L'esatto meccanismo alla base di questa disgregazione stereociliare non è stato ancora chiarito. Uno studio precedente ha rivelato che l'interruzione stereociliare è stata osservata 1 settimana dopo l'esposizione all'esplosione12. Una possibile ragione per questo cambiamento morfologico unico potrebbe essere la disconnessione dei collegamenti della punta e dei collegamenti laterali tra le stereociglia della fila più esterna disturbate e le stereociglia della fila centrale14. Inoltre, anche le radichette della fila più esterna di stereociglia, che consistono di actina e proteine di raggruppamento, come TRIOBP, sono danneggiate meccanicamente15.

Gli insulti cocleari di solito portano a un'ulteriore interruzione dei processi metabolici che può persistere per giorni o addirittura mesi19. In particolare, le sinapsi nella coclea, che sono responsabili dell'elaborazione del suono uditivo, sono altamente vulnerabili all'esposizione ai blasti25. I nostri modelli animali hanno mostrato che la degenerazione della funzione degli AN, come dimostrato dal declino delle ampiezze di ABR P1, è stata causata dal danno cocleare indotto da LISW. Un possibile meccanismo della sinaptopatia cocleare indotta da LISW è l'eccessivo rilascio di glutammato da parte degli IHC, come l'ototossicità del glutammato26. L'esposizione a LISW provoca la vibrazione violenta della membrana basilare, causando un rilascio eccessivo di glutammato dall'IHC, che provoca la degenerazione dell'AN. LISW può replicare il tipo di tossicità del glutammato che colpisce la coclea, portando alla sinaptopatia cocleare e a un calo del numero di sinapsi senza danneggiare gli HC. Un altro possibile meccanismo è che l'esposizione a LISW possa danneggiare le cellule di supporto cocleare, il che contribuisce alla sopravvivenza degli ANF a seconda del rilascio di neurotrofine27. Inoltre, la LISW può essere trasmessa direttamente agli ANF e causare danni neurali. Di conseguenza, i nostri modelli di danno cocleare indotto da LISW potrebbero essere preziosi sia per la ricerca sui blasti che per l'esame di diverse forme di degenerazione cocleare che coinvolgono la sinaptopatia cocleare.

C'è un urgente bisogno di interventi terapeutici per affrontare la perdita dell'udito indotta da blasti, evidenziando l'importanza delle strategie di trattamento incentrate sulla sinaptopatia cocleare o sulla rottura del fascio stereociliare nell'OHC. Questi approcci possono essere applicati anche ad altri tipi di disturbi dell'udito con meccanismi patologici simili. La sinaptopatia cocleare è stata osservata nel nostro modello di disfunzione cocleare indotta da blasti, suggerendo che potrebbe essere un promettente bersaglio terapeutico. LISW può essere utilizzato per creare modelli murini che replicano accuratamente la fisiopatologia cocleare causata dalle esplosioni e questi modelli possono essere utilizzati per studiare vari tipi di disfunzioni cocleari.

Il nostro studio ha diversi limiti. Innanzitutto, abbiamo misurato le soglie ABR a 12-24 kHz. Secondo uno studio precedente, il danno cocleare indotto da LISW provoca una perdita dell'udito ad alta frequenza negli animali a causa delle caratteristiche del SW e della vulnerabilità della base cocleare. Sono necessari ulteriori studi ABR in regioni di frequenza più ampie (>24 kHz). In secondo luogo, in questo studio, abbiamo condotto solo una valutazione istologica della coclea e non abbiamo valutato la via uditiva centrale. La compromissione dell'udito nelle lesioni da esplosione non è limitata solo alla coclea, ma è una compromissione complicata del tronco encefalico e del sistema uditivo centrale. In futuro, sarebbe auspicabile valutare il centro uditivo in modelli animali esposti a LISW.

Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da due sovvenzioni di JSPS KAKENHI (Grant Numbers 21K09573 (K.M.) e 23K15901 (T.K.)).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Laser Nd:YAG Q-switched a 532 nmQuantelBrilliant b
Software di analisi dei picchi ABRMass Eye and EarN/AEPL Cochlear Function Test Suite
Adesivo per saldatura in resina acrilica Acrysunday Co., LtdN / A
Microscopia a fluorescenza confocaleCompostoTCS SP8
SakuraTissue-Tek OCT
CtBP2anticorpo BD Trasduzione# 612044
Specchi dielettrici multistratoSIGMAKOKI CO., LTDTFMHP-50C08-532M1-M3
Oscilloscopio digitaleTektronixDPO4104B
AuricolareCUICDMG15008-03A
IdrofonoRP acustica e.K.
misurazioneNIHplug-in del software Image Jhttps://myfiles.meei.harvard.edu/xythoswfs/webui/_xy-e693768_1-t_wC4oKeBD
Microscopio otticoKeyence CorporationBZ-X700
Anticorpo miosina 7AProteus Biosciences#25– 6790 
Anticorpo neurofilamentoSigma#AB5539
lente piano-convessaSIGMAKOKI CO., LTDSLSQ-30-200PM
Software prismaticoGraphPadN/Aver.8.2.1
Microscopio elettronico a scansioneJEOL LtdJSM-6340F
Piccolo endoscopio digitaleAVS Co. LtdAE-C1
Gelatina ad ultrasuoniHitachi Aloka MedicalN/A
Attenuatore variabileShowa Optronics Co.N/ASuccessore attualmente disponibile: KYOCERA SOC Corporation, RWH-532HP II
Incapsulante solubile in acqua Dako#S1964
di criosezione Leica FOPH2000Linea di

Riferimenti

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