Metodo fluorescente quantificabile ed economico per confermare la capacità di nuovi composti di chelare il ferro

Sommario

Descriviamo un test fluorescente in grado di confermare in modo rapido ed economico la capacità di nuovi composti di chelare il ferro. Il test misura la capacità dei composti di superare l'attività di legame del ferro della debole sonda fluorescente chelante del ferro Calceina, con conseguente aumento quantificabile della fluorescenza quando si verifica la chelazione.

Abstract

Le cellule tumorali richiedono grandi quantità di ferro per mantenere la loro proliferazione. Il metabolismo del ferro è considerato un segno distintivo del cancro, rendendo il ferro un bersaglio valido per gli approcci antitumorali. Lo sviluppo di nuovi composti e l'identificazione di lead per ulteriori modifiche richiedono l'esecuzione di saggi di prova del meccanismo. Esistono molti saggi per valutare l'impatto sulla proliferazione; Tuttavia, la capacità di chelare il ferro è una misura importante e talvolta trascurata a causa degli alti costi delle attrezzature e della sfida di quantificare in modo rapido e riproducibile la forza della chelazione. Qui, descriviamo un metodo fluorescente quantificabile ed economico senza cellule per confermare la capacità di nuovi composti di chelare il ferro. Il nostro test si basa sul colorante fluorescente economico Calceina, disponibile in commercio, la cui fluorescenza può essere quantificata sulla maggior parte dei lettori di piastre per microtitolazione fluorescenti. La calceina è un debole chelante del ferro e la sua fluorescenza si spegne quando si lega a Fe^2+/3+; la fluorescenza viene ripristinata quando un nuovo chelante supera la Calceina per il Fe^{legato 2+/3+}. La rimozione del quenching fluorescente e il conseguente aumento della fluorescenza consente di determinare la capacità chelante di un nuovo chelante putativo. Pertanto, offriamo un test economico e ad alto rendimento che consente lo screening rapido di nuovi composti chelanti candidati.

Introduzione

I cambiamenti fenotipici delle cellule che si riferiscono allo sviluppo del cancro attraverso un insieme comune di capacità biologiche alterate sono ora comunemente indicati come i segni distintivi del cancro. Tra questi ci sono i cambiamenti derivanti dalla riprogrammazione del metabolismo energetico, che sono diffusi nella biologia delle cellule tumorali¹. Tale riprogrammazione metabolica include un aumento del fabbisogno di ferro per supportare una rapida proliferazione e crescita tumorale². Questa sete di ferro porta a un metabolismo del ferro disregolato, che di per sé è considerato un segno distintivo del cancro ^3,4, con una disregolazione che si verifica in tutti gli stadi⁵. I segni distintivi delle metastasi, più recentemente proposti da Welch e Hurst, includono un ruolo per il ferro⁶ poiché il ferro può indurre stress ossidativo e questo può, a sua volta, mediare i cambiamenti del genoma, dell'epigenoma e del proteoma, aumentando la possibilità di metastasi⁷. Un legame tra i livelli di ferro e un aumento dell'incidenza del cancro è stato dimostrato attraverso studi epidemiologici⁸.

Poiché le cellule tumorali richiedono grandi quantità di ferro, sono suscettibili alla carenza di ferro e, quindi, alla chelazione del ferro. Abbiamo recentemente pubblicato un articolo di revisione che evidenzia il potenziale della ferrochelazione nell'invertire diversi segni distintivi del cancro attraverso l'interruzione delle vie di segnalazione oncogeniche⁹ da parte di NDRG1. Tuttavia, l'uso della ferrochelazione come terapia antitumorale a sé stante non ha prodotto risultati positivi negli studi clinici a causa della loro tossicità, della breve emivita, del metabolismo rapido e dei meccanismi di resistenza emergenti. Ciononostante, i chelanti del ferro si sono dimostrati promettenti nelle indagini in vitro e in vivo , indicando che è necessario ulteriore lavoro per sviluppare chelanti del ferro efficaci per la terapia del cancro. La chelazione specifica del ferro è una strategia convalidata nella scoperta di farmaci antitumorali, ma^{ad oggi sono} state riportate solo poche classi.

L'identificazione e la caratterizzazione di nuovi chelanti del ferro richiede la capacità di misurare il loro effetto su diversi endpoint. Molti di questi (come la proliferazione, l'apoptosi, la formazione di specie reattive dell'ossigeno) sono misurati di routine e sono stati delineati e rivisti in letteratura come metodi per valutare i segni distintivi del cancro¹¹. Quando valutano un nuovo chelante del ferro, molti gruppi esaminano abitualmente l'effetto sulle attività antiproliferative e redox, nonché gli effetti sull'afflusso o l'efflusso di ferro. Le tecniche di previsione in silico ¹² aumentano ulteriormente il crescente pool di chelanti del ferro che possono essere sottoposti a screening.

Laproduzione di chelanti del ferro richiede la capacità di misurare il loro effetto sui livelli di ferro come mezzo per dimostrare efficacemente la prova di principio. Attualmente, il metodo più comune per farlo è la citometria a flusso¹³ , che è costosa, dispendiosa in termini di tempo e scarsamente quantificabile. La scelta del test si basa spesso sulla disponibilità di attrezzature sperimentali, sulla velocità e sul costo di un test. Pertanto, la capacità di chelare il ferro può essere una misura del punto finale trascurata a causa degli alti costi delle attrezzature e della sfida di quantificare in modo rapido e riproducibile la forza della chelazione. Qui, descriviamo un metodo quantificabile ed economico di fluorescenza cellulare libera per confermare la capacità di nuovi composti di chelare il ferro.

Protocollo

1. Preparazione della soluzione madre

1. Quando si preparano le soluzioni stock di Calcein, prevenire la degradazione delle foto mantenendo le soluzioni al buio. Preparare una soluzione 1 mM di Calceina nel PBS di Dulbecco, senza magnesio o calcio¹⁴. Per 5 mL di soluzione di Calceina 1 mM, aggiungere 3,1 mg di Calceina (622,5 g/M) a 5 mL di PBS di Dulbecco. Utilizzando la calza da 1 mM di Calceina, preparare 1 mL di aliquote di soluzioni madre secondarie in provetta per microfuge come descritto nella Tabella 1.
2. Preparare le scorte di solfato ferrico ammonio esaidrato sciogliendo 19 mg di FAS esaidrato (392,1 g/M) in 5 mL di PBS di Dulbecco per ottenere una soluzione di solfato ferrico ammonico (FAS) da 10 mM. Preparare le scorte secondarie di FAS mediante diluizione. Per preparare un impasto di 2 mM di FAS (fA), diluire 200 μl del brodo da 10 mM di FAS con PBS con 800 μl di PBS di Dulbecco. Per preparare un impasto di 100 μM di FAS (fB), diluire 50 μL di fA con 950 μL di PBS di Dulbecco.
3. Per preparare 10 mM di brodo di Deferiprone, sciogliere 2,8 mg (139,15 g/M) in 2 mL di PBS di Dulbecco. Preparare le scorte secondarie di chelante del ferro 2mM diluendo 200 μl del brodo da 10 mM con 800 μl di PBS di Dulbecco.
   NOTA: In questo test il chelante del ferro scelto deve essere disciolto nel PBS di Dulbecco senza magnesio o calcio. Come esempio di lavoro, abbiamo utilizzato il chelante di ferro Deferiprone.

2. Validazione del saggio mediante determinazione dell'intervallo lineare di fluorescenza della calceina

1. Preparare un intervallo di stock di calceina da 1 mM a 1 μM come descritto nella tabella delle soluzioni stock (vedere la tabella 1). Tenere le soluzioni stock al buio per evitare la degradazione fotochimica.
2. Pipettare 90 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) nei pozzetti da A a H e da 1 a 12 di una piastra da 96 pozzetti utilizzando una pipetta manuale a canale singolo o una pipetta manuale multicanale.
3. Aggiungere 10 μl di 1 mM di calceina nella colonna 12, file da A a H, della piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta manuale a canale singolo.
4. Aggiungere 10 μl di calceina da 800 μM pre-preparata (Tabella 1) a una piastra da 96 pozzetti nella colonna 11, righe da A a H, utilizzando una pipetta manuale a canale singolo.
5. Ripetere la procedura di aggiunta con le scorte della tabella 1 in modo che la colonna 10 contenga 10 μl di stock da 400 μM e la colonna 9 contenga 10 μl di stock da 200 μM, ecc. Continuare questa procedura graduale attraverso le colonne fino a quando la colonna 2 contiene 10 μl di materiale da 1 μM.
   NOTA: La concentrazione finale di Calceina in ciascun pozzetto è 10 volte inferiore rispetto alle soluzioni madre a causa della diluizione 1:10.
6. Aggiungere 10 μl di PBS alla colonna 1, riga da A a E.
7. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti e impostare l'analizzatore su un lettore di micropiastre a un'eccitazione di 490 nm e una rilevazione di 530 nm (o un set di filtri adatto per la fluorescenza Calcien).

3. Convalida del saggio mediantequenching ionico Fe²⁺ per ridurre la fluorescenza della calceina

1. Preparare un impasto di calceina (cB) da 10 μM e un supporto FAS (fA) da 2 mM (vedere la tabella dei materiali). Tenere il ceppo di Calceina al buio per evitare la fotodegradazione.
2. Utilizzando una pipetta manuale a canale singolo o una pipetta manuale multicanale, aggiungere 50 μl di PBS alle colonne da 2 a 10, righe da A a E. Non aggiungere PBS alla colonna 11.
3. Aggiungere 100 μl di FAS (fA) da 2 mM in una piastra a 96 pozzetti nella colonna 11 (righe da A a E) utilizzando una pipetta manuale a canale singolo.
4. Utilizzando una pipetta manuale multicanale, rimuovere 50 μL di fA dalla colonna 11 e pipettarli nel PBS già presente nella colonna 10, quindi miscelare accuratamente mediante pipettaggio.
5. Continuare questa procedura graduale di doppia diluizione sulle colonne 9-2, sulle file da A a E della piastra a 96 pozzetti e miscelare mediante pipettaggio.
6. Rimuovere 50 μl di soluzione pipettando dalla colonna 2 e gettare la soluzione nei rifiuti.
7. Aggiungere 40 μL di PBS in tutti i pozzetti contenenti una soluzione, colonne 2-12, righe da A a E.
8. Aggiungere 90 μl di PBS alla colonna 1 dei pozzetti, righe A-E. Questi pozzetti agiscono come un controllo positivo di 1 μM di calceina e 0 μM di FAS.
9. Aggiungere 10 μL di 10 μM di calceina madre (cB) in ciascun pozzetto contenente una soluzione (colonne da 1 a 12, righe da A a E). Ciò si traduce in una concentrazione massima di 1000 μM di FAS nella colonna 11, con una concentrazione di FAS dimezzata per le colonne 10, 9, 8 fino alla colonna 2. Ciascuno dei pozzetti risultanti dalle colonne contiene 1 μM di calceina e una diluizione di FAS.
10. Aggiungere 100 μl di PBS alla riga F delle colonne da 1 a 5 per il solo controllo PBS. Aggiungere 100 μl di 2 mM di FAS alla riga F delle colonne da 6 a 10 per il solo controllo FAS. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti al buio.
11. Analizza su un lettore di micropiastre impostato su un'eccitazione di 490 nm e una rilevazione di 530 nm (o un set di filtri adatto per la fluorescenza della calceina).

4. Saggio per quantificare la capacità dei chelanti del ferro di superare il chelante debole Calceina per gli ioni Fe²⁺

1. Preparare una pasta di calceina (cB) di 10 μM, una pasta di FAS (fB) di 100 μM e una massa di ferro chelante di 2 mM come indicato nella Tabella 1. Tenere il brodo di calceina al buio per evitare la fotodegradazione.
2. Utilizzando una pipetta manuale a canale singolo o una pipetta manuale multicanale, aggiungere 50 μl di PBS alle colonne da 2 a 10, righe da A a E, di una piastra a 96 pozzetti. Non aggiungere PBS alla colonna 11.
3. Aggiungere 100 μl dei 2 mM stock (fA) dei chelanti del ferro in una piastra da 96 pozzetti nella colonna 11, file da A a E, utilizzando una pipetta manuale a canale singolo.
4. Utilizzando una pipetta manuale multicanale, rimuovere 50 μl di fA dalla colonna 11 e pipettarli nel PBS nella colonna 10, file da A a E, mescolando accuratamente mediante pipettaggio.
5. Continuare questa procedura di doppia diluizione graduale sulle restanti colonne 9-2, righe da A a E della piastra, miscelare ciascun pozzetto mediante pipettaggio. Rimuovere 50 μl dalla colonna 2 e gettare via. Ciò garantisce una doppia diluizione di 2 mM del chelante del ferro (Deferiprone) attraverso le colonne di piastre a 96 pozzetti da 11 a 2, file da A a E.
6. Pipettare 30 μL di PBS in tutti i pozzetti contenenti una soluzione (ad esempio, colonne 2-11 righe da A a E).
7. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 10 μL di 100 μM di FAS stock (fB) nelle colonne 2-12, righe da A a E. Ciò si traduce in una concentrazione di 1 μM di calceina e 10 μM di FAS in ciascun pozzetto e in una doppia diluizione dei chelanti, con la concentrazione che dimezza ogni colonna attraverso la piastra, le colonne 11-2, con la massima concentrazione di chelante del ferro a 1000 μM nella colonna 11 pozzetti da A a E.
8. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 10 μL di calceina madre (cB) da 10 μM nelle colonne 2-12, righe da A a E.
9. Pipettare 80 μl di PBS e 10 μl di cB e 10 μl di FAS (fB) nella colonna 1, righe A-E utilizzando una pipetta. Miscelare i campioni mediante pipettaggio. Ciò fornisce il controllo di 1 μM di calceina con 10 μM di FAS e nessun chelante.
10. Pipettare 100 μl di PBS nelle colonne della riga F da 1 a 5. Questo fornisce il controllo negativo PBS.
11. Aggiungere 100 μl di 2 mM di chelante del ferro (Deferiprone) alla riga F, colonne da 6 a 10. Questo fornisce al chelante il solo controllo.
12. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti al buio. Analisi su un lettore di micropiastre multimodale impostato su eccitazione a 490 nm e rilevamento a 530 nm (o set di filtri adatto per la fluorescenza Calcien).

5. Analisi dei dati

1. Analisi per la validazione del saggio mediante la determinazione dell'intervallo lineare della fluorescenza della calceina.
   1. Calcolare le unità di fluorescenza relative (RFU) medie delle righe A-H per ciascuna concentrazione di calceina nelle colonne della piastra a 96 pozzetti dal passaggio 1 e confrontarle con la concentrazione. Traccia il grafico a linee della concentrazione di Calceina sull'asse x rispetto alla RFU media sull'asse y e utilizza una regressione lineare per fornire la linea di adattamento.
   2. Quantificare la significatività statistica confrontando le concentrazioni di calceina in ciascuna colonna (2-11) con il controllo della PBS nelle righe da A a E della colonna 1. Eseguire un'analisi della varianza (ANOVA) e applicare un'analisi post hoc utilizzando la differenza meno significativa (LSD) con una soglia di p <0,001 per determinare la significatività statistica (indicata con ** nella Figura 1).
2. Analisi per la convalida del saggio mediante quenching ionico Fe²⁺ per ridurre la fluorescenza della calceina.
   1. Calcolare le unità di fluorescenza relative (RFU) medie delle righe da A a E per ciascuna concentrazione di FAS nelle colonne 2-11. Grafico RFU medio per ogni concentrazione FAS sull'asse y. Sull'asse x tracciare le concentrazioni di FAS utilizzando una scala Log2 in quanto distribuisce meglio i dati. Tracciare una linea di adattamento utilizzando una regressione lineare.
   2. Quantificare la significatività statistica confrontando la RFU media con la media di ciascuna colonna del controllo di PBS, 1 μM di calceina, 0 μM di FAS (colonna 1 riga da A a E). Eseguire un'ANOVA con analisi post hoc LSD con una soglia di p <0,001 per determinare la significatività statistica.
3. Analisi per il saggio: Quantificazione della capacità dei chelanti del ferro di superare il chelante debole Calceina per gli ioni Fe²⁺ .
   1. Calcolare le unità di fluorescenza relative (RFU) medie delle righe da A a E per ciascuna concentrazione di chelante nelle colonne 2-11. Tracciare la RFU media per ogni concentrazione di chelante sull'asse y. Sull'asse x tracciare le concentrazioni di chelante utilizzando una scala Log2 in quanto distribuisce meglio i dati.
   2. Quantificare la significatività statistica confrontando la RFU media-media di ciascuna colonna del controllo di PBS 1 μM Calceina e 10 μM FAS (colonna 1 riga da A a E). Eseguire un'ANOVA con analisi post hoc LSD con una soglia di p <0,001 per determinare la significatività statistica.

Risultati

Per il metodo mostrato nella fase 2, questo primo esperimento (Figura 1) ha stabilito l'intervallo lineare del lettore di piastre a fluorescenza per microtitolazione quando rileva le emissioni fluorescenti di Calceina. I nostri risultati rappresentativi mostrano un ampio intervallo lineare di fluorescenza della calceina da 0 a 100 μM. L'ANOVA con l'analisi post hoc dell'LSD dimostra che esiste una differenza statisticamente significativa nella RFU media per tutte le concentrazioni di calcein...

Discussione

L'eccessiva dipendenza dei tumori dal ferro per alimentare il loro metabolismo rende la chelazione del ferro una potenziale aggiunta ai regimi terapeutici⁴. Tuttavia, c'è una capacità limitata di selezionare rapidamente nuovi chelanti di ioni metallici per la loro capacità di legare gli ioni ferro. La sonda fluorescente Calceina, comunemente usata e ampiamente disponibile, è nota per agire come un debole chelante del ferro e per legarsi con ioni di ferro spegne la...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ammonio ferro (II) solfato esaidrato	Sigma-Aldrich	215406	altrimenti noto come FAS
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Deferiprone	Sigma-Aldrich	379409
Dulbecco′ s Soluzione salina tamponata con fosfato	Sigma-Aldrich	D5652	priva di magnesio e calcio
Greiner CELLSTAR Piastre a 96 pozzetti	Sigma-Aldrich	M0812	qualsiasi piastra a 96 pozzetti otticamente trasparente funzionerà