Metodo fluorescente quantificabile ed economico per confermare la capacità di nuovi composti di chelare il ferro

Sommario

Descriviamo un test fluorescente in grado di confermare in modo rapido ed economico la capacità di nuovi composti di chelare il ferro. Il test misura la capacità dei composti di superare l'attività di legame del ferro della debole sonda fluorescente chelante del ferro Calceina, con conseguente aumento quantificabile della fluorescenza quando si verifica la chelazione.

Abstract

Le cellule tumorali richiedono grandi quantità di ferro per mantenere la loro proliferazione. Il metabolismo del ferro è considerato un segno distintivo del cancro, rendendo il ferro un bersaglio valido per gli approcci antitumorali. Lo sviluppo di nuovi composti e l'identificazione di lead per ulteriori modifiche richiedono l'esecuzione di saggi di prova del meccanismo. Esistono molti saggi per valutare l'impatto sulla proliferazione; Tuttavia, la capacità di chelare il ferro è una misura importante e talvolta trascurata a causa degli alti costi delle attrezzature e della sfida di quantificare in modo rapido e riproducibile la forza della chelazione. Qui, descriviamo un metodo fluorescente quantificabile ed economico senza cellule per confermare la capacità di nuovi composti di chelare il ferro. Il nostro test si basa sul colorante fluorescente economico Calceina, disponibile in commercio, la cui fluorescenza può essere quantificata sulla maggior parte dei lettori di piastre per microtitolazione fluorescenti. La calceina è un debole chelante del ferro e la sua fluorescenza si spegne quando si lega a Fe^2+/3+; la fluorescenza viene ripristinata quando un nuovo chelante supera la Calceina per il Fe^{legato 2+/3+}. La rimozione del quenching fluorescente e il conseguente aumento della fluorescenza consente di determinare la capacità chelante di un nuovo chelante putativo. Pertanto, offriamo un test economico e ad alto rendimento che consente lo screening rapido di nuovi composti chelanti candidati.

Introduzione

I cambiamenti fenotipici delle cellule che si riferiscono allo sviluppo del cancro attraverso un insieme comune di capacità biologiche alterate sono ora comunemente indicati come i segni distintivi del cancro. Tra questi ci sono i cambiamenti derivanti dalla riprogrammazione del metabolismo energetico, che sono diffusi nella biologia delle cellule tumorali¹. Tale riprogrammazione metabolica include un aumento del fabbisogno di ferro per supportare una rapida proliferazione e crescita tumorale². Questa sete di ferro porta a un metabolismo del ferro disregolato, che di per sé è considerato....

Protocollo

1. Preparazione della soluzione madre

1. Quando si preparano le soluzioni stock di Calcein, prevenire la degradazione delle foto mantenendo le soluzioni al buio. Preparare una soluzione 1 mM di Calceina nel PBS di Dulbecco, senza magnesio o calcio¹⁴. Per 5 mL di soluzione di Calceina 1 mM, aggiungere 3,1 mg di Calceina (622,5 g/M) a 5 mL di PBS di Dulbecco. Utilizzando la calza da 1 mM di Calceina, preparare 1 mL di aliquote di soluzioni madre secondarie in provetta per microfuge come descritto nella Tabella 1.
2. Preparare le scorte di solfato ferrico ammonio esa....

Risultati

Per il metodo mostrato nella fase 2, questo primo esperimento (Figura 1) ha stabilito l'intervallo lineare del lettore di piastre a fluorescenza per microtitolazione quando rileva le emissioni fluorescenti di Calceina. I nostri risultati rappresentativi mostrano un ampio intervallo lineare di fluorescenza della calceina da 0 a 100 μM. L'ANOVA con l'analisi post hoc dell'LSD dimostra che esiste una differenza statisticamente significativa nella RFU media per tutte le concentrazioni di calcein.......

Discussione

L'eccessiva dipendenza dei tumori dal ferro per alimentare il loro metabolismo rende la chelazione del ferro una potenziale aggiunta ai regimi terapeutici⁴. Tuttavia, c'è una capacità limitata di selezionare rapidamente nuovi chelanti di ioni metallici per la loro capacità di legare gli ioni ferro. La sonda fluorescente Calceina, comunemente usata e ampiamente disponibile, è nota per agire come un debole chelante del ferro e per legarsi con ioni di ferro spegne la.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ammonio ferro (II) solfato esaidrato	Sigma-Aldrich	215406	altrimenti noto come FAS
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Deferiprone	Sigma-Aldrich	379409
Dulbecco′ s Soluzione salina tamponata con fosfato	Sigma-Aldrich	D5652	priva di magnesio e calcio
Greiner CELLSTAR Piastre a 96 pozzetti	Sigma-Aldrich	M0812	qualsiasi piastra a 96 pozzetti otticamente trasparente funzionerà